CN105586431A - 一种芦笋茎枯病菌分子检测引物及快速检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种芦笋茎枯病菌分子检测引物及其检测方法，属于农作物病害检测和生物技术领域。该特异性引物包括上游引物SF：5’-CCTTACTGTTGCCTCGGCG-3’，下游引物SR：5’-CCGGAGCGAGGGTTTAACTA-3’；采用上述引物经PCR扩增（退火温度56℃）和琼脂糖凝胶电泳可在芦笋茎枯病菌纯DNA、带菌的芦笋植株和栽培土壤中特异性地扩增出片段长度为401bp的特异性扩增产物。本发明检测引物特异性强、灵敏度高，检测方法实用性好，操作简便快捷；本发明能实现芦笋茎枯病的早期检测，还能有效区分芦笋上相似的褐斑病、枯萎病，对芦笋茎枯病的早期预警和防控，防治病害的扩散蔓延具有重要意义。

Description

一种芦笋茎枯病菌分子检测引物及快速检测方法
技术领域
本发明涉及一种芦笋茎枯病菌分子检测引物及其检测方法，专用于芦笋茎枯病菌的快速分子检测，同时可实现田间芦笋茎枯病菌的早期诊断和病菌的监测鉴定，属于农作物病害检测和生物技术领域。
背景技术
芦笋是一种名贵的保健蔬菜，其嫩茎风味鲜美，细嫩可口，具有很高的食用和药用价值，已成为深受消费者喜爱的营养保健型高档蔬菜，国际上享有“蔬菜之王”的美誉，风靡欧洲、美洲、韩国、日本等国，也成为我国出口创汇的特色蔬菜之一。芦笋是多年生宿根的草本植物，春、秋季抽出的嫩芽即为可食用的“芦笋”。芦笋是一种名贵的中药材，古代《神农本草经》称它为“上品之上”，《本草纲目》称其能“解诸瘤之毒”。据科学研究表明，芦笋富含组织蛋白质，人体所需的17种氨基酸，而以天门冬氨含量高达51.32mg/100ml，维生素中以维生素A含量尤为丰富，多种微量元素以硒的含量较为突出，所有这些特殊物质都能抑制癌细胞的产生。
芦笋茎枯病是芦笋上一种毁灭性病害，由拟茎点霉[Phomopsisasparagi(Sacc.)Bubak]引起，茎枯病的发生需要湿热气候条件，欧美芦笋主产区均为冷凉气候，故在欧美国家基本不发生茎枯病。在我国芦笋种植地区芦笋茎枯病每年均有不同程度的发生，我国南方芦笋种植区，茎枯病发生更严重，一旦发病当年就会造成20%-50%的损失，如果防治不力，次年就可能造成绝收毁园，给芦笋生产造成极大威胁。芦笋茎枯病菌的在田间主要通过风雨传播，雨水飞溅是近距离传播的主要因子，而种子带菌、带菌鲜笋调运是进行远距离传播的主要因子，而病害初发期是病害防治的最佳时期。因此，建立一种快速、灵敏的检测方法用于芦笋茎枯病的早期诊断，为病害的最佳防治时期提供技术支撑，同时防治病害从病区向非病区传播具有重要意义。
芦笋茎枯病可为害芦笋茎秆、枝条、小枝和拟叶，为害芦笋茎秆和枝条初期出现水渍状斑点，后逐渐扩大成梭形或椭圆形的病斑。干燥条件下病斑边缘清晰，扩展较慢，高温潮湿时病斑扩展迅速，深入茎秆髓部，造成茎秆枯死。为害拟叶和小枝，先出现褐色小点，而后迅速扩大，形成边缘紫红色，中间灰白色的拟叶病段，使拟叶迅速枯死。芦笋茎枯病为害茎秆，尤其是为害茎秆基部是的病害症状与芦笋枯萎病相似，而为害拟叶和小枝的病害症状与芦笋褐斑病相似，给芦笋茎枯病的诊断造成很大难度。以症状为基础的病害常规诊断技术，需要采用柯赫氏法则经过病原菌分离培养、病原菌鉴定、接菌、症状分析等步骤，耗时长、效率低、准确性差，难以做到病害发生时及时检测和有效控制病原菌的传播和病害流行，难以满足芦笋茎枯病诊断的实际需要，因此迫切需要建立一套方便快捷、结果可靠、灵敏度高的快速诊断技术。
近年来，分子生物学技术发展迅速，随着分子生物学技术在植物病理学科不断发展和应用，一些分子标记技术为植物病原菌的诊断检测提供了新的途径，其中PCR（polymerasechainreaction）技术以特异性强、灵敏度高、方便快捷等特点被用于植物病原菌的诊断。真菌核糖体转录间隔区（internaltranscribedspacer,ITS）序列种内的保守性和科属种间可变性的特点，设计特异性引物进行PCR，对病原菌进行快速检测和鉴定的技术已受到广泛的应用，国内外研究人员已成功开发出大豆疫霉、辣椒疫霉、柑橘溃疡病菌、甘薯黑斑病菌和玉米南方锈病菌等多种病原菌的特异性引物和检测方法，实现了快速、灵敏和准确的鉴定。但目前有关芦笋茎枯病菌分子检测的研究尚未见报道。
发明内容
针对现有技术中对芦笋茎枯病菌的检测和鉴定主要基于病原形态学特征，程序繁琐、耗死长、对鉴定经验要求高、准确度低，难以满足芦笋茎枯病诊断的实际需要问题，提供了一种芦笋茎枯病菌分子检测引物及其检测方法。
为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：
本发明首先提供了一种芦笋茎枯病菌分子检测引物，其核苷酸序列为：
上游引物SF：5’-CCTTACTGTTGCCTCGGCG-3’；
下游引物SR：5’-CCGGAGCGAGGGTTTAACTA-3’。
所述引物SF和SR对芦笋茎枯病菌特异性扩增出401bp的产物。
本发明还提供了一种芦笋茎枯病菌的快速检测方法，包括以下步骤：
(1)从芦笋植株或栽培土壤中提取DNA；
用于检测病原菌纯培养物时，采用CTAB法提取供试菌株基因组DNA；用于检测芦笋植株组织是否存在芦笋茎枯病菌时，采用NaOH快速裂解法提取芦笋植株组织基因组DNA；用于检测土壤中是否存在芦笋茎枯病菌时，采用土壤DNA快速提取试剂盒提取。
(2)以提取芦笋植株或栽培土壤DNA为模板进行PCR扩增：PCR反应体系25μL，包含2.5μL10×PCRbuffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTPMixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的引物SF和SR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH2O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，56℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35个循环；72℃延伸10min；
(3)上步所得的PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上用0.5×TBE缓冲液电泳分析，电压为4-5V/cm；根据扩增产物的大小判定检测结果，如果能特异性扩增出401bp的产物，则判定所述的芦笋植株或栽培土壤中存在芦笋茎枯病菌，否则所述的芦笋植株或栽培土壤中不存在芦笋茎枯病菌。
本发明的有益效果在于：
（1）准确性高：本发明是根据真菌核糖体转录间隔区（rDNA-ITS）序列在真菌种内的高度保守性和科属种间可变性的特点设计对芦笋茎枯病菌具有特异扩增作用的PCR引物。已经对不同地理来源的芦笋茎枯病菌、携带芦笋茎枯病菌的植物组织、携带芦笋茎枯病菌的土壤和健康的芦笋组织进行了检测验证，只有芦笋茎枯病菌和携带该病菌的组织和土壤中能特异性地扩增出一条401bp的电泳条带，说明本发明所设计的引物用于检测芦笋茎枯病菌准确可靠；
（2）特异性强：本发明所设计的引物对芦笋茎枯病菌具有很强的特异性，能够用于区别芦笋茎枯病菌、芦笋褐斑病菌及芦笋枯萎病菌等芦笋上常见的病原菌，从而能有效区分发生在芦笋上症状特征相似的病害；
（3）灵敏度高：本发明将设计的特异引物与ITS基因通用引物（ITS1/ITS4）联合起来进行巢式PCR扩增后，对芦笋茎枯病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到10fg；
（4）适用性广、实用性好：本发明的芦笋茎枯病菌的检测方法，不仅能对病菌菌丝体进行检测，也能对感病的芦笋组织和带菌土壤进行检测，可实现芦笋茎枯病菌的早期检测，即在病害显症前进行检测，防治病害的爆发流行。
（5）操作简便快速：本发明只需进行DNA提取、PCR扩增和琼脂糖电泳后即可判定结果，一般整个检测过程可在数小时内完成，操作简便快捷。
附图说明
图1为本发明引物对芦笋茎枯病菌特异性扩增电泳图：其中泳道M为2000bpDNAMarker，泳道2、泳道3为芦笋茎枯病菌，泳道4-10分别为：芦笋褐斑病菌、芦笋枯萎病菌、莴苣菌核病菌、番茄灰霉病菌、蘑菇褐腐病菌、玉米大斑病菌、阴性对照。
图2为本发明引物芦笋茎枯病菌的灵敏性检测扩增电泳图：图A：普通PCR灵敏度检测，其中泳道M为2000bpDNAMarker，泳道2-12分别为：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、阴性对照、阳性对照;图B为巢式PCR灵敏度检测，其中泳道M为2000bpDNAMarker，泳道2-13分别为：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、100ag、阴性对照、阳性对照。
图3为本发明芦笋发病组织和栽培土壤扩增电泳图，其中泳道M为2000bpDNAMarker，泳道2-10分别为自然发病的芦笋组织、自然发病芦笋栽培土壤、人工接种发病的芦笋组织、人工接种发病芦笋茎栽培土壤、健康芦笋组织、灭菌的土壤、健康芦笋栽培土壤、阳性对照、阴性对照。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1分子检测引物设计及芦笋茎枯病菌特异分子检测方法的建立
1.芦笋茎枯病菌基因组DNA的提取：
采用CTAB法提取本实验室保存的8株芦笋茎枯病菌的基因组DNA，具体步骤如下：
(1)取0.1g菌丝粉于1.5mL离心管中，加入900μL2wt.%CTAB提取液，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴60min，室温条件下，12000r/min离心15min；
(2)取上清液700μL，加等体积酚、氯仿、异戊醇混合液（各体积比为25:24:1），温和摇动，室温条件下，8000r/min离心10min；
(3)取上清液500μL，加入等体积氯仿再抽提一次，室温条件下，8000r/min离心10min；
(4)取上清液350μL，加入1/10体积3mol/LNaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀60min，4℃条件下，8000r/min离心5min；
(5)弃去上清液，加入700μL体积浓度为70%冰乙醇，轻摇10sec，4℃条件下，8000r/min离心10sec，晾干，加入50μLTE缓冲液，-20℃保存备用。
2.芦笋茎枯病菌ITS序列测定：
以真菌核糖体基因转录间隔区（rDNA-ITS）通用引物TS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'为引物对提取芦笋茎枯病菌的DNA进行PCR扩增，扩增反应体系和反应程序为：PCR反应体系25μL，包含2.5μL10×PCRbuffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTPMixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶（Takara大连宝生物工程有限公司），10μmol/L的TIS1和ITS4各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH2O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火45sec，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min；所得PCR产物送大连宝生物工程有限公司测序。
3.芦笋茎枯病菌特异分子检测引物的设计：
根据芦笋茎枯病菌核糖体内转录间隔区（rDNA-ITS）序列在真菌种间高度变异和种内稳定性，用ClustalX软件将测序得到的8株芦笋茎枯病菌的ITS序列与GenBank中Phomopsis属不同种的ITS序列、芦笋褐斑病菌ITS序列、芦笋枯萎病菌ITS序列进行同源性分析和差异位点比较，用PrimerPrimer5软件设计了对芦笋茎枯病菌具有特异性扩增作用的一对PCR引物(由上海生工生物工程有限公司合成)，即特异分子检测引物的序列为：
上游引物SF：5’-CCTTACTGTTGCCTCGGCG-3’；；
下游引物SR：5’-CCGGAGCGAGGGTTTAACTA-3’。
4.芦笋茎枯病菌快速分子检测方法的建立：
(1)从芦笋植株或栽培土壤中提取DNA:
①用于检测病原菌纯培养物时，采用CTAB法提取供试菌株基因组DNA；
②用于检测芦笋植株组织是否存在芦笋茎枯病菌时，采用NaOH快速裂解法提取芦笋植株组织基因组DNA，具体步骤如下：
a.称取待检测的植物组织0.1g，加入0.5mol/LNaOH30μL，将组织充分磨碎成糊；
b.将糊状组织转入1.5mL离心管中，12000r/min离心6min，取上清液5μl；
c.上清液中加入495μL0.1mol/LTris-HCl（pH=8.0），混合均匀，取1.0μL作为PCR模板进行扩增；
③用于检测土壤中是否存在芦笋茎枯病菌时，采用土壤DNA快速提取试剂盒提取。
(2)以提取芦笋植株或栽培土壤DNA为模板进行PCR扩增：PCR反应体系25μL，包含2.5μL10×PCRbuffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTPMixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的SF和SR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH2O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，56℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35个循环；72℃延伸10min；
(3)上步所得的PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上用0.5×TBE缓冲液电泳分析，电压为4-5V/cm；根据扩增产物的大小判定检测结果，如果能特异性扩增出401bp的产物，则可判定所述的芦笋植株或栽培土壤中存在芦笋茎枯病菌，否则所述的芦笋植株或栽培土壤中不存在芦笋茎枯病菌。
实施例2芦笋茎枯病菌特异性扩增
1.采用CTAB法提取2株芦笋茎枯病菌、芦笋褐斑病菌、芦笋枯萎病菌及其它不同作物病原菌（包括莴苣菌核病菌、番茄灰霉病菌、蘑菇褐腐病菌、玉米大斑病菌）的基因组DNA。
2.以提取供试菌的DNA为模板进行PCR扩增：PCR反应体系25μL，包含2.5μL10×PCRbuffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTPMixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的SF和SR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH2O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，56℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35个循环；72℃延伸10min；电泳检测扩增产物。
3.特异性扩增结果
如图1所示，2株芦笋茎枯病菌可以特异性扩增出401bp的条带，而芦笋褐斑病菌、芦笋枯萎病菌、供试其它作物病原菌和阴性对照均无扩增条带，表明本发明的分子检测引物可以将芦笋茎枯病菌与其他病原菌区分开来，具有很强的特异性，本发明的检测方法可用于芦笋茎枯病菌的特异性扩增。
实施例3本发明引物对芦笋茎枯病菌的灵敏性检测
1.采用CTAB法提取芦笋茎枯病菌的基因组DNA；
2.将提取的芦笋茎枯病菌的基因组DNA，经分光光度计测定浓度后，用无菌超纯水稀释，配制成系列浓度，备用；
3.以配制的成系列浓度DNA为模板进行常规PCR扩增：PCR反应体系25μL，包含2.5μL10×PCRbuffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTPMixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的SF和SR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH2O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，56℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35个循环；72℃延伸10min；电泳检测扩增产物。
4.以配制的成系列浓度DNA为模板进行巢式PCR扩增：
（1）第一轮PCR扩增：以真菌核糖体基因转录间隔区（rDNA-ITS）通用引物TS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'为外引物对配制的成系列浓度DNA进行第一轮PCR扩增，扩增反应体系和反应程序为：PCR反应体系25μL，包含2.5μL10×PCRbuffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTPMixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶（Takara大连宝生物工程有限公司），10μmol/L的TIS1和ITS4各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH2O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火45sec，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min；
（2）第二轮PCR扩增：以第一轮PCR扩增的产物为模板，以SF/SR为引物进行第二轮PCR扩增，PCR反应体系25μL，包含2.5μL10×PCRbuffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTPMixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的SF和SR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH2O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，56℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35个循环；72℃延伸10min；电泳检测扩增产物。
5.检测结果
如图2所示，以本发明引物SF/SR为引物进行常规PCR时，在25μL反应体系中，10pg的芦笋茎枯病菌DNA可以获得可视条带，其检测灵敏度可达到10pg（图2-A）；而进一步以真菌核糖体基因转录间隔区（rDNA-ITS）的通用引物TS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'为外引物扩增的产物为模板，以本发明引物SF/SR为引物进行第二轮扩增时，在25μL反应体系中，10fg的芦笋茎枯病菌DNA可以获得可视条带，其检测灵敏度可达到10fg(图2-B)。
实施例4发病芦笋植株及土壤中芦笋茎枯病菌的检测
1.采用NaOH快速裂解法提取芦笋植株组织基因组DNA；采用土壤DNA快速提取试剂盒提取待测土壤基因组DNA。
2.以配制的成系列浓度DNA为模板进行常规PCR扩增：PCR反应体系25μL，包含2.5μL10×PCRbuffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTPMixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的SF和SR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH2O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，56℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35个循环；72℃延伸10min；电泳检测扩增产物。
3.检测结果
如图3所示，自然发病的芦笋组织、自然发病芦笋栽培土壤、人工接种发病的芦笋组织、人工接种发病芦笋茎栽培土壤、阳性对照中均可产生401bp左右的可视条带，而健康芦笋组织、灭菌的土壤、健康芦笋栽培土壤、阴性对照均无任何条带出现，表明本发明引物和检测方法还可用于田间芦笋茎枯病发病植株及栽培土壤的检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
序列表
<110>福建省农业科学院植物保护研究所
<120>一种芦笋茎枯病菌分子检测引物及快速检测方法
<160>4
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<400>1
tccgtagggaacctgcgg18
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<400>2
tcctccgcttattgatatgc20
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<400>3
ccttactgttgcctcggcg19
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<400>4
ccggagcgagggtttaacta20

Claims (4)

1.一种芦笋茎枯病菌分子检测引物，其特征在于：引物的核苷酸序列为：
上游引物SF：5’-CCTTACTGTTGCCTCGGCG-3’
下游引物SR：5’-CCGGAGCGAGGGTTTAACTA-3’。
2.根据权利要求1所述芦笋茎枯病菌分子检测引物，其特征在于，所述上游引物SF和下游引物SR对芦笋茎枯病菌特异性扩增出401bp的产物。
3.一种芦笋茎枯病菌的快速检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)提取芦笋植株或栽培土壤的DNA；
(2)以提取的芦笋植株或栽培土壤DNA为模板进行PCR扩增：PCR反应体系25μL，包含2.5μL10×PCRbuffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTPMixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的引物SF和SR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH2O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，56℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35个循环；72℃延伸10min；
(3)上步所得的PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上用0.5×TBE缓冲液电泳分析，电压为4-5V/cm；根据扩增产物的大小判定检测结果，如果能特异性扩增出401bp的产物，则判定芦笋植株或栽培土壤存在芦笋茎枯病菌。
4.如权利要求1所述的一种芦笋茎枯病菌分子检测引物在检测土壤芦笋茎枯病菌中的应用。
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