ES2109387T5 - Procedimiento para la deteccion de acidos nucleicos. - Google Patents
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Abstract
PROCEDIMIENTO PARA COMPROBAR UN ACIDO NUCLEINICO A TRAVES DEL DESARROLLO INDIVIDUAL DEL ACIDO NUCLEINICO EN CONDICIONES ALCALINAS. POR LO MENOS ESTA PRESENTE UN DETERGENTE DEL GRUPO DE DETERGENTES ANIONICOS NO IONICAS E HIBRIDAS SE ADICIONA UNA SONDA DE RETENCION INMOVILIZADA O NO INMOVILIZADA AL ACIDO NUCLEINICO, SE HIBRIDA LA SONDA DE RETENCION CON EL ACIDO NUCLEINICO INMOVILIZANDO EL ACIDO NUCLEINICO POR LA SONDA DE RETENCION Y SE COMPRUEBA LA CANTIDAD DE HIBRIDO INMOVILIZADO FORMADO.
Description
Procedimiento para la detección de ácidos
nucleicos.
Son objeto del invento un procedimiento para la
detección de ácidos nucleicos, la utilización de determinados
detergentes para la estabilización de ácidos nucleicos
monocatenarios, así como un estuche de reactivos y un sistema de
análisis para la realización del procedimiento.
En el sector de los ensayos de hibridación de
ácidos nucleicos se hicieron en la última década considerables
progresos en relación con el aprovechamiento de la hibridación
específica de ácidos nucleicos que son complementarios entre sí.
Así, entretanto se ha hecho posible detectar muchos parámetros, p.
ej. infecciones, no solamente por medio de ensayos inmunológicos
sino también mediante ensayos de hibridación de ácidos nucleicos.
Para esta meta, era especialmente favorable la posibilidad de
multiplicar los ácidos nucleicos in vitro específicamente
antes de su detección y por consiguiente determinar también ácidos
nucleicos, que estén contenidos en las muestras sólo en pequeñas
cantidades.
Sin embargo, hasta ahora tales ensayos de ácidos
nucleicos sólo encontraron utilización en ensayos individuales que
exigían una costosa elaboración manual de la muestra, a causa de su
complejidad relativamente alta. Un ejemplo típico de uno de tales
ensayos está descrito en el documento de patente europea
EP-A-0.200.362. En este
procedimiento, los ácidos nucleicos amplificados son sometidos a una
separación mediante electroforesis en gel. A continuación, con
sondas, marcadas y específicas, de ácidos nucleicos se hace visible
la presencia de los ácidos nucleicos en el gel. Tales
procedimientos no son prácticamente utilizables para el diagnóstico
rutinario en un laboratorio con un alto caudal de muestras.
A partir del documento
EP-A-0.261.955 se conoce un
procedimiento para la detección de bacterias, que consta de las
etapas de lisis de las paredes celulares (mediante proteinasa K),
luego de tratamiento con un álcali para la desnaturalización del
ADN, y a continuación de inmovilización de los ácidos nucleicos
monocatenarios por adición de un agente caótropo. Tampoco este
procedimiento es realizable en laboratorios rutinarios, a causa de
las complicadas etapas individuales, especialmente de la
inmovilización directa del ácido nucleico, que ha de ser detectado,
sobre una membrana.
Para la lisis de bacterias, a partir de la obra
de Maniatis y colaboradores (Molecular Cloning, compilador Sambrook
et al., Cold Spring Harbour 1989), se conocen condiciones que
implican al SDS (dodecilsulfato de sodio) en condiciones alcalinas.
También en ese caso tiene lugar la detección de los ácidos nucleicos
después de inmovilización directa del ácido nucleico y de
hibridación con una sonda detectora sobre una membrana. Las
condiciones son ciertamente apropiadas para laboratorios de biología
molecular, pero no para el diagnóstico rutinario.
Para la estabilización de un ADN se utilizaba
hasta ahora, en una solución neutra o bien ligeramente ácida o
básica, un tampón (p. ej. el TE: Tris x HCl 10 mM, pH 7,4, EDTA 1
mM) o el ADN se conservaba en agua o liofilizaba, o bien se
congelaba a -20ºC o se almacenaba como precipitado con etanol a
-20ºC. Estas condiciones, sin embargo, no se pueden emplear tampoco
prácticamente en procedimientos de análisis rutinarios, en los
cuales se trata de manejar un alto caudal y de una sencilla
manipulación.
Para la disminución de fijaciones inespecíficas
a filtros, se propuso la adición de un ADN ajeno (p. ej. ADN de
esperma de arenque). Como adiciones a soluciones, que debían
facilitar una hibridación de ácidos nucleicos, se propusieron
poli(vinilpirrolidona), albúmina de suero bovino, Ficoll® y
SDS.
En el documento
EP-A-0.132.948 se describe que el
SB-16 reduce la fijación inespecífica de un
conjugado, a base de avidina y fosfatasa alcalina, a plaquitas de
filtros de nitrocelulosa.
Se ha descrito además la siliconización de
recipientes de vidrio y materiales sintéticos para la estabilización
de pequeñas cantidades de un ADN o de un ADN monocatenario.
En el documento
EP-A-0.258.0l7 se describe la
estabilización de la polimerasa de ADN procedente de Thermus
aquaticus por medio de detergentes no iónicos.
Sánchez-Pescador y colaboradores
(Antimicrobial Agents and Chemotherapy, vol. 33, Nº 10 (1989)
1813-1815) describen un ensayo de ácidos nucleicos
para la detección de bacterias con una resistencia a tetraciclina
mediada por tetM. En este caso, las células se someten a un
tratamiento de lisis, conteniendo la solución de lisis, entre otras
cosas, la proteinasa K y SDS. Luego se añade una solución, que junto
a sondas captadoras, contiene también NaOH. En la cita de
Sánchez-Pescador y colaboradores no se menciona un
efecto estabilizador del SDS sobre ácidos nucleicos
monocatenarios.
Urdea y colaboradores ("Luminiscence
Immunoassay and Molecular Applications", Bocaraton, Florida, CRC
Press (1990)) describen un procedimiento para la detección del
virus de la hepatitis B. Para esto, se lleva a cabo en primer lugar
una lisis con una solución para lisis, que contiene la proteinasa H
y SDS. El ADN puesto en libertad es aprovechado luego para el
análisis adicional, en el que a la solución de lisis que contiene
ADN se le añaden entonces al mismo tiempo unas sondas captadoras e
hidróxido de sodio. En la cita de Urdea y colaboradores no se
menciona el recurso de estabilizar ácidos nucleicos monocatenarios
por medio de detergentes.
El documento de solicitud de patente
internacional WO 91/19567 describe, entre otras cosas, la
automatización del ensayo de análisis de ADN. Ese documento
91/19567 no describe sin embargo recipientes para la conservación
de reactivos con una solución de desnaturalización, que contiene un
detergente aniónico, no iónico o anfótero.
El documento EP 0.317.077 A1 describe unos
estuches para ensayos de hibridación para ácidos nucleicos
amplificados, que típicamente contienen en recipientes separados,
entre otras cosas, una sonda captadora, una fase sólida destinada a
la inmovilización del analito y un reactivo de desnaturalización. No
se describe que la solución de hidróxido de metal alcalino debería
de contener un detergente aniónico, no iónico o anfótero.
Fue misión del presente invento poner a punto un
procedimiento para la detección de ácidos nucleicos analitos, que
se adapte mejor a las necesidades de un laboratorio para diagnóstico
rutinario.
Es objeto del invento un procedimiento para la
detección de un ácido nucleico, que comprende consecutivamente las
siguientes etapas, en el orden de sucesión:
- -
- hacer monocatenario el ácido nucleico en condiciones alcalinas;
- -
- añadir una sonda captadora inmovilizable o inmovilizada;
- -
- hibridar la sonda captadora con el ácido nucleico mediando inmovilización del ácido nucleico a través de la sonda captadora; y
- -
- detectar la cantidad de híbrido inmovilizado que se ha formado,
estando presente durante el tratamiento en
condiciones alcalinas por lo menos un detergente tomado entre el
grupo de los detergentes aniónicos, no iónicos y anfóteros (iónicos
híbridos), llevándose a cabo la conversión en monocatenario en un
recipiente a base de poliestireno, polietileno o Luran.
Son asimismo objeto del invento la utilización
de determinados detergentes para la estabilización de ácidos
nucleicos en soluciones acuosas, al igual que un estuche (kit) de
reactivos y un sistema de análisis para la realización del
procedimiento.
En el caso del procedimiento conforme al invento
se trata de una forma especial de realización de los denominados
ensayos de hibridación, que en sus fundamentos son conocidos para un
experto en la materia en el sector del diagnóstico por ácidos
nucleicos. Si en lo sucesivo no se señalan detalles experimentales,
se remite acerca de ello en todo su contenido a la obra "Nucleic
acid hybridisation" (Hibridación de ácidos nucleicos),
compiladores B. D. Hames y S. J. Higgins, IRL Press, 1986, p. ej.
en los capítulos 1 (Estrategia de hibridación), 3 (Análisis
cuantitativo de la hibridación en solución) y 4 (Hibridación
cuantitativa en filtros), Current Protocols in Molecular Biology,
compilador F. M. A usubel et al., J. Wiley and Sons, 1987, y
Molecular Cloning, compilador J. Sambrook et al., CSH, 1989.
A los métodos conocidos pertenece también el de la preparación de
nucleósido-trifosfatos marcados, tal como se
describen en el documento
EP-A-0.324.474, a saber la síntesis
química de oligonucleótidos modificados y sin modificar, la
disociación de ácidos nucleicos mediante enzimas de restricción, la
elección de condiciones de hibridación, mediante las cuales se
puede conseguir una especificidad, que depende del grado de
homología entre los ácidos nucleicos que se han de hibridar, de su
contenido según ce (cromatografía de gases) y de su longitud, así
como la formación de ácidos nucleicos a partir de
nucleósido-trifosfatos con ayuda de polimerasas,
eventualmente con utilización de los denominados cebadores.
Una marcación, en el sentido que se le da en el
presente invento, consta de un grupo L detectable directa o
indirectamente. Los grupos detectables directamente son por ejemplo
grupos, o átomos de metales, radiactivos con ^{32}P), coloreados
o fluorescentes. Los grupos detectables indirectamente son por
ejemplo compuestos activos inmunológica o enzimáticamente, tales
como anticuerpos, antígenos, haptenos o enzimas, o bien parciales
enzimáticamente activas. Éstos son detectados en una subsiguiente
reacción o secuencia de reacciones. Se prefieren especialmente los
haptenos, puesto que los nucleósido-trifosfatos
marcados con ellos se pueden emplear especialmente como substratos
de polimerasas, y se puede llevar a cabo con facilidad una
subsiguiente reacción con un anticuerpo marcado contra el hapteno o
contra el nucleósido haptenizado. Tales
nucleósido-trifosfatos son por ejemplo
nucleósido-trifosfatos bromados o
nucleósido-trifosfatos acoplados con digoxigenina,
digoxina o fluoresceína. Se han acreditado como especialmente
apropiados los esteroides mencionados en el documento
EP-A-0.324.474 y la detección de
éstos. Acerca de su incorporación en ácidos nucleicos se remite por
el presente documento al documento
EP-A-0.324.474.
Los nucleósido-trifosfatos (NTP)
son ribonucleósido-trifosfatos (rNTP) o
desoxi-ribonucleósido-trifosfatos
(dNTP).
(dNTP).
Por un ácido nucleico analito se entiende un
ácido nucleico, que es meta de la detección. Por ácidos nucleicos
analitos han de entenderse en este caso ácidos nucleicos de
cualquier origen, por ejemplo ácidos nucleicos de origen viroide,
vírico, bacteriano o celular. Éstos se pueden presentar en solución
o suspensión, pero también fijados a cuerpos sólidos o en medios
que contienen células, en frotis celulares, células fijadas,
secciones de tejidos u organismos fijados. Preferiblemente, los
ácidos nucleicos se presentan en estado de solución. La secuencia
de reacciones es comenzada la mayor parte de las veces mediante
puesta a disposición del ácido nucleico analito con
correspondientes reactivos. En este caso, pueden contribuir a la
liberación de los ácidos nucleicos tanto modificaciones del pH
(alcalino), calor, repetición de modificaciones extremadas de la
temperatura (congelación/descongelación), modificación de las
condiciones fisiológicas del crecimiento (presión osmótica), acción
de detergentes, sales caótropas o enzimas (p. ej. proteasas,
lipasas), a solas o en combinación. Puesto que el procedimiento
conforme al invento es muy sensible y selectivo, se pueden detectar
también pequeñas cantidades de ácidos nucleicos en presencia de
otras sustancias, por ejemplo proteínas, células, fragmentos de
células, pero también ácidos nucleicos que no se hayan de detectar.
Por consiguiente, puede prescindirse de una purificación de las
muestras, cuando esté asegurado que los ácidos nucleicos que se
hayan de detectar sean suficientemente accesibles para los
reactivos empleados.
Un ácido nucleico de molde es un ácido nucleico,
para el que se forma de nuevas una cadena de ácido nucleico que en
lo esencial es complementaria. En lo referente a la información
sobre secuencias, el ácido nucleico de molde sirve como matriz para
la transcripción.
Una desnaturalización de ácidos nucleicos
significa una separación de dobles cadenas de ácidos nucleicos en
cadenas individuales. Para un experto en la materia están a
disposición en principio un gran número de posibilidades, p. ej.
tratamiento por medio de hidróxidos de metales alcalinos, por calor
o mediante productos químicos.
Por una detección específica se entiende un
procedimiento mediante el cual se pueden detectar en caso deseado
ácidos nucleicos determinados selectivamente, incluso en presencia
de otros ácidos nucleicos. Sin embargo, también es posible detectar
un grupo de ácidos nucleicos que tenga una secuencia de nucleótidos
parcialmente coincidente o similar. Para la detección de ácidos
nucleicos bicatenarios se puede incluir cualquiera de las dos
cadenas complementarias.
Por un ácido nucleico, o una secuencia de ácido
nucleico, que sea esencialmente complementario con un ácido
nucleico, se entienden ácidos nucleicos, o secuencias de ellos, que
se pueden hibridar con el correspondiente ácido nucleico, cuya
secuencia de nucleótidos en la zona que se ha de hibridar sea o bien
exactamente complementaria con el otro ácido nucleico o que se
diferencie en unas pocas bases del ácido nucleico exactamente
complementario. La especificidad se orienta en tal caso tanto hacia
el grado de la complementariedad como también hacia las condiciones
de hibridación.
Las fases líquidas son las fases acuosas que
usualmente se utilizan en detecciones de ácidos nucleicos,
eventualmente con sustancias constitutivas orgánicas o inorgánicas
disueltas, p. ej. sustancias tamponadoras, reactivos en exceso,
ácidos nucleicos que no se han de detectar, proteínas, etc.
El ácido nucleico que se ha de detectar puede
ser el ácido nucleico analito propiamente dicho. Sin embargo, puede
ser también un ácido nucleico que se hubiera preparado a partir del
ácido nucleico analito mediante un tratamiento previo en el líquido
de muestra. A los conocidos tratamientos previos pertenecen
especialmente la fragmentación, por ejemplo mediante enzimas de
restricción, o la síntesis de ADNc (ADN complementario) a partir de
ARN. Para que el procedimiento conforme al invento pueda desplegar
completamente sus ventajas, se ha manifestado como conveniente que
el ácido nucleico que se haya de detectar tenga un tamaño de por lo
menos 40 pb (pares de bases).
Es preferido que el ácido nucleico que se ha de
detectar sea el producto de una multiplicación, específica o
inespecífica, realizada de antemano, de un ácido nucleico. Tales
procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos son conocidos
por ejemplo a partir de los documentos
EP-A-0.201.184,
EP-A-0.237.362,
EP-A-0.329.822,
EP-A-0.320.308 o de patente PCT WO
88/10315. En estos procedimientos, el ácido nucleico analito sirve
como ácido nucleico de molde para la preparación del ácido nucleico
que a fin de cuentas ha de ser detectado.
El ácido nucleico puede ser sin embargo también
un ácido nucleico preparado por clonación y multiplicación in
vivo.
Por ejemplo, un procedimiento para la detección
de un virus especial en un líquido corporal (p. ej. un suero) puede
implicar como primera etapa la lisis de la envolvente de virus. Los
procedimientos para la lisis de paredes celulares son conocidos
para un experto en la materia. Por ejemplo, la lisis se puede llevar
a cabo por tratamiento con soluciones de hidróxidos de metales
alcalinos. También es posible la adición de sustancias
coadyuvantes, p. ej. detergentes. A ésta le puede seguir,
especialmente en el caso de virus que se presentan solo en pequeñas
concentraciones en líquidos corporales (p. ej. el virus de la
hepatitis C), una multiplicación in vitro de los ácidos
nucleicos (p. ej. a través de la reacción en cadena de polimerasa
(PCR) o los otros procedimientos de amplificación que antes se han
mencionado). En tal caso, con el ácido nucleico analito como ácido
nucleico de molde se forma un gran número de ácidos nucleicos, que
luego son detectados en el procedimiento conforme al invento.
En el caso de una detección de bacterias, por
ejemplo en alimentos, se podrían realizar de antemano al
procedimiento conforme al invento también varias etapas. En
general, las muestras de bacterias, eventualmente después de una
reproducción in vivo de las bacterias, se disgregan en
condiciones que producen la lisis de la pared celular de las
bacterias (p. ej. proteinasas, álcalis). En el caso de muestras de
muy baja concentración puede seguir a esto también una
amplificación in vitro de los ácidos nucleicos analitos de la
bacteria.
El resultado de los diversos tratamientos
previos es siempre un líquido de muestra, que contiene disueltos
ácidos nucleicos y en el que están contenidos eventualmente los
reactivos empleados en las etapas preparatorias, así como los
constituyentes celulares eventualmente destruidos.
El procedimiento conforme al invento prevé por
fin el tratamiento de la muestra en condiciones alcalinas, estando
presente también por lo menos un detergente tomado del grupo formado
por detergentes aniónicos, no iónicos y anfóteros. Estas
condiciones están destinadas a hacer monocatenarios a los ácidos
nucleicos presentes en el líquido, si es que todavía no lo son.
Para ello, al líquido se le añade un hidróxido de un metal alcalino,
preferiblemente un hidróxido de sodio, en forma de un material
sólido o preferiblemente como una solución (solución de
desnaturalización), en una cantidad tal que el pH del líquido de la
muestra, después de la adición, está situado entre 9,5 y 14,
preferiblemente entre 11 y 13,5. La solución añadida puede contener
además también todavía otros materiales coadyuvantes (p. ej. sales
y tampones).
El núcleo del invento es el reconocimiento de
que la presencia de determinados detergentes durante el tratamiento
en condiciones alcalinas trae consigo considerables ventajas para la
conversión en monocatenarios. Para la realización del invento, éste
detergente es añadido al líquido de la muestra o bien en forma
sólida o preferiblemente en forma de una solución, de manera tal
que la concentración del detergente en el líquido de la muestra sea
de 0,01% en peso hasta 10% en peso, preferiblemente de 0,05% en peso
hasta 5% en peso. Es posible añadir el detergente al líquido de la
muestra previamente preparado ya antes, pero también después, de
haberse ajustado las condiciones alcalinas. Se prefiere
especialmente añadir el detergente en, o juntamente con, la solución
alcalina de desnaturalización al líquido de la muestra. La
concentración de detergente en la solución de desnaturalización es
preferiblemente de 0,01 hasta 15% en peso, de modo especialmente
preferido de 0,05 hasta 10% en peso.
Detergentes no iónicos preferidos son Synperonic
(copolímeros de bloques a base de poli(oxietileno) y
poli(oxipropileno), Pharmacia), Tween 20
(polietilenglicol-(20)-monolaurato de sorbitán),
Thesit®
(dodecil-polietilen-glicol-éter),
Triton X-100 (polietilenglicol
(9-10)-p-t-octilfenol),
NP-40
(etilen-fenol-polietilenglicol-éter)
y detergentes glicosídicos, p. ej.
octil-\beta-D-gluco-piranósido.
Son especialmente eficaces en el sentido del invento el Synperonic
y el NP-40.
Ejemplos de detergentes aniónicos son SDS
(laurilsulfato de sodio), laurilsarcosinato de sodio y desoxicolato
de sodio. Entre este grupo es especialmente preferido el SDS.
Entre los detergentes anfóteros son preferidos
Zwittergent 3-08
(N-octil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propanosulfonato),
Zwittergent 3-12
(N-dodecanil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propanosulfonato),
CHAPS
(3[(3-colamidopropil)-dimetilamonio]-1-propanosulfonato)
y CHAPSO
(3-[(3-colamidopropil)-dimetilamino]-2-hidroxi-1-propanosulfonato).
Se ha manifestado como especialmente activo el Zwittergent
3-12. Las condiciones para poder hacer monocatenario
pueden mantenerse según el presente invento entre 1 minuto y 8
horas, sin que tenga lugar una apreciable descomposición de los
ácidos nucleicos que se hayan de detectar. Preferiblemente, después
de 4 horas son detectables todavía más del 90% de los ácidos
nucleicos originalmente presentes.
Preferiblemente, la desnaturalización tiene
lugar en un recipiente de material sintético. Especialmente, se
pueden emplear en este caso los recipientes que normalmente se
utilizan en dispositivos automáticos de análisis como recipientes
para la conservación de las muestras. Los recipientes son de
poliestireno, polietileno o Luran. Durante el tratamiento con un
álcali y un detergente, el recipiente, en el que tiene lugar el
tratamiento, se encuentra preferiblemente ya en un dispositivo
automático de análisis, de modo especialmente preferido sobre un
rotor para muestras, que permite la aplicación de un dispositivo de
toma de muestras a recipientes con muestras, individuales, que se
encuentran sobre el rotor. Uno de tales dispositivos automáticos de
análisis está descrito por ejemplo en el documento
EP-A-0.361.830.
De modo especialmente positivo repercute el
invento en dispositivos automáticos de análisis y procedimientos de
análisis, en los cuales los tiempos de permanencia de los
recipientes llenos para conservación de muestras varían de un
recipiente a otro y por consiguiente los períodos de tiempo de
tratamiento con un álcali son de diferente duración, condicionados
por el sistema. Estos dispositivos automáticos tienen la ventaja de
que en caso de emergencia se puede dar la preferencia al análisis
de determinadas muestras, lo cual desplaza el análisis de otras
muestras a un posterior momento.
Otra etapa esencial del procedimiento conforme
al invento es la adición de una sonda captadora inmovilizable o
inmovilizada. Esto puede realizarse añadiendo una solución de una
sonda captadora inmovilizable a la solución que tiene el ácido
nucleico monocatenario, por ejemplo añadiéndolo con pipeta, o
poniéndolo en contacto con un material sólido con el que ya está
unida una sonda captadora.
Se entiende por una sonda captadora
inmovilizable un ácido nucleico que ha sido modificado
estructuralmente con respecto al ácido nucleico normal que
esencialmente es complementario con el ácido nucleico que ha de ser
detectado, en el sentido de que tiene uno o varios grupos I
capacitadores para la inmovilización. Es preferido el caso en el
que la sonda captadora consiste en una sonda de ácido nucleico
monocatenario y a la que no se añade la cadena complementaria con
ella. La solución con la sonda captadora monocatenaria contiene,
además de ello, preferiblemente reactivos que son muy útiles para
la hibridación, tales como p. ej. de, formamida (en el caso de
fragmentos más largos) o reactivos de bloqueo para ácidos nucleicos
que no han de ser detectados así como preferiblemente reactivos
para el ajuste correcto del valor del pH. De modo especialmente
preferido, la sonda captadora es un ácido nucleico según el
documento de patente alemana
DE-A-41.23.540.
Las sondas captadoras monocatenarias se pueden
preparar por ejemplo mediante síntesis química de ácidos nucleicos
según el documento DE-A-39.16.871 o
según el documento
EP-B-0.184.056.
Al realizar el procedimiento de detección en un
analizador automático, la solución de hibridación se recoge
preferiblemente de modo automático a partir de un recipiente de
conservación de reactivos, que por ejemplo contiene sobre un rotor
los reactivos para varias determinaciones diferentes, y se reúne con
una parte alícuota del líquido con el ácido nucleico
desnaturalizado, que ha de ser detectado. De modo especialmente
preferido, el analizador retira primeramente un determinado volumen
desde un recipiente de conservación de muestras y luego un
determinado volumen de solución para hibridación desde un recipiente
determinado de conservación de reactivos, y los descarga en un
recipiente de inmovilización y detección.
Los grupos I capacitadores para la
inmovilización son por ejemplo grupos químicos que normalmente no
están presentes en ácidos nucleicos naturales, y que pueden ser
unidos covalentemente, por ejemplo a través de una reacción química
o una fotorreacción, a una fase sólida, o bien grupos o partes de
moléculas que se pueden reconocer y unir, a través de interacciones
específicas para grupos, por otra molécula u otra parte de molécula.
Tales grupos son por lo tanto p. ej. haptenos, antígenos y
anticuerpos, secuencias de nucleótidos, receptores, secuencias de
regulación, glicoproteínas, por ejemplo lectinas, o también los
partícipes en una fijación de proteínas de fijación, tales como
biotina o iminobiotina. Se prefieren vitaminas y haptenos, y se
prefieren especialmente biotina, fluoresceína o esteroides, tales
como digoxigenina o digoxina.
Durante la incubación de la sonda captadora con
el ácido nucleico monocatenario que ha de ser detectado, éstos se
hibridan uno con otro mediando formación de un híbrido D. Si está
considerada la hibridación de otros ácidos nucleicos, p. ej. sondas
de detección, con partes monocatenarias del híbrido D, éstos pueden
ser ya incorporados en esta mezcla y llevados a hibridación, tal
como se desea.
El líquido que contiene disuelto el híbrido D de
ácidos nucleicos, cuando el ácido nucleico que se había de detectar
estaba presente en la muestra, es puesto en contacto con una fase
sólida que puede fijar específicamente el híbrido D a través de los
grupos inmovilizables de la sonda de ácido nucleico.
El tipo de la fase sólida se orienta hacia el
grupo I capacitador de la inmovilización. Preferiblemente, éste
tiene un grupo R inmovilizador, que puede pasar a tomar parte de una
interacción de fijación con I. Si el grupo inmovilizable es por
ejemplo un hapteno, entonces se puede utilizar una fase sólida, que
tenga en su superficie anticuerpos contra este hapteno. Si el grupo
inmovilizable es una vitamina, tal como p. ej. biotina, entonces la
fase sólida puede contener inmovilizadas proteínas fijadoras, tales
como avidina o estreptavidina. Los radicales I y R especialmente
preferidos son biotina y estreptavidina. La inmovilización a través
de un grupo en el ácido nucleico modificado es especialmente
ventajosa, puesto que puede tener lugar en condiciones más suaves
que por ejemplo las reacciones de hibri-
dación.
dación.
Preferiblemente, para la inmovilización de los
ácidos nucleicos formados, la mezcla de reacción es cargada antes,
durante o después de la formación de los híbridos D de ácidos
nucleicos, dentro de un recipiente que puede reaccionar en su
superficie con el grupo inmovilizable. Preferiblemente, la reacción
de hibridación con la sonda tiene lugar esencialmente al mismo
tiempo que la inmovilización. Es posible utilizar una fase sólida
en forma de un material poroso, tal como una membrana, un tejido o
un velo, sobre el cual se vierte la mezcla de reacción. También es
posible la utilización de perlas, los denominados glóbulos (beads) o
partículas de látex. El recipiente es preferiblemente una cubeta,
un tubito o una placa de microtitulación. La fase sólida deberá
tener por lo menos tantos sitios de fijación para el grupo
inmovilizable como híbridos D de ácidos nucleicos, y por lo
consiguiente como ácidos nucleicos que se hayan de detectar, que
estén presentes.
La preparación de una fase sólida preferida está
descrita en el documento
EP-A-0.344.578, al que se hace
referencia en todo su contenido.
En una forma de realización especialmente
preferida, que es accesible a aparatos analizadores, la solución
con el ácido nucleico desnaturalizado conforme al invento es cargada
dentro de un recipiente que contiene unido a la superficie un
partícipe específico en una fijación para un grupo inmovilizador de
la sonda captadora. En el recipiente se añade además también una
solución para hibridación, que contiene una sonda captadora
monocatenaria, la cual presenta un grupo inmovilizador. Con ello,
la mezcla de reacción es neutralizada. El ácido nucleico que se ha
de detectar, eventualmente presente, que se ha hibridado con la
sonda captadora, es fijado a la fase sólida.
Por una sonda captadora inmovilizada se entiende
un ácido nucleico que en lo esencial es complementario con por lo
menos una parte del ácido nucleico que se ha de detectar, el cual
ácido nucleico primeramente mencionado está unido ya a una fase
sólida en el momento de efectuarse la adición. La fijación puede ser
covalente, pero también puede estar basada en interacciones
bioespecíficas, tal como se describen en el caso de las sondas
inmovilizables. La fase sólida puede ser un recipiente, pero también
un material sólido con otra geometría distinta, p. ej. una esfera o
bola, que haga necesario otro recipiente adicional.
Después de un período de tiempo de incubación,
durante el cual tiene lugar la reacción de inmovilización, la fase
líquida es retirada del recipiente, del material poroso o de los
glóbulos sedimentados. La fase sólida puede ser lavada a
continuación con un tampón apropiado, puesto que es muy eficiente la
fijación de los híbridos D a la fase sólida.
La cantidad del híbrido, fijado a la fase
sólida, constituido por el ácido nucleico que ha de ser detectado y
sonda captadora, se puede determinar de un modo conocido en cuanto a
su principio. Por una parte, esto puede realizarse mediando
utilización de una sonda de detección, al modo de un procedimiento
de hibridación en emparedado. En este procedimiento, el híbrido se
hace reaccionar con una sonda de detección, que es complementaria
con otra secuencia de nucleótidos del ácido nucleico que ha de ser
detectado, que es distinta de la sonda captadora, y se hibrida con
ésta. Con ello se forma un híbrido a base de la sonda de detección,
el ácido nucleico que se ha de detectar y la sonda captadora en la
fase sólida. Tal procedimiento está descrito por ejemplo en el
documento EP-A-0.079.139.
Preferiblemente, la sonda de detección es añadida a la solución de
hibridación juntamente con la sonda captadora.
En el caso de que al procedimiento de detección
conforme al invento se le hubiera antepuesto una reacción de
amplificación, es preferido el caso de que durante la reacción de
amplificación se hubiera incorporado un grupo detectable en el
producto de la multiplicación (que constituye el ácido nucleico que
ha de ser detectado). Tal procedimiento está descrito por ejemplo
en el documento DE-A-4.041.608. En
tal caso, en la reacción de amplificación se incorporan
mononucleósido-trifosfatos marcados. Para este caso
se prescinde de una hibridación con una sonda de detección, puesto
que el ácido nucleico detectable está marcado de una manera apta
para detectarse.
En el caso de grupos directamente detectables,
por ejemplo marcas fluorescentes, se determina fluorométricamente
la cantidad de la marcación. Si el grupo detectable se puede
detectar indirectamente, p. ej. un hapteno, el ácido nucleico
modificado es hecho reaccionar preferiblemente con un anticuerpo
marcado contra el hapteno, tal como se describe análogamente en el
documento EP-A-0.324.474. La
marcación en el anticuerpo puede ser por ejemplo una marcación
coloreada o fluorescente, o preferiblemente una marcación por
enzima, tal como \beta-galactosidasa, fosfatasa
alcalina o peroxidasa. En el caso de la marcación por enzima, se
mide la cantidad de ácido nucleico a través de la vigilancia, la
mayor parte de las veces fotométrica, quimioluminométrica o
fluorométrica de una reacción de la enzima con un substrato
cromógeno, quimioluminógeno o fluorógeno. La señal de medición es
una medida de la cantidad de ácido nucleico que se ha de detectar,
originalmente presente, y por consiguiente, de modo eventual, de
organismos que se hayan de detectar.
Preferiblemente también la detección del híbrido
formado se realiza con ayuda de un aparato automático de análisis.
Para ello, después de la incubación del ácido nucleico monocatenario
con la sonda captadora y eventualmente con la sonda de detección,
se retira el líquido de muestra desde los híbridos inmovilizados.
Esto puede realizarse por ejemplo retirando el líquido desde los
híbridos inmovilizados. Esto depende del tipo de la fase sólida.
Por ejemplo, en el caso de utilizarse un recipiente, el líquido es
separado del recipiente, por ejemplo por pipeteo. Después de una o
varias etapa(s) de lavado para la eliminación completa de la
sonda captadora no inmovilizada y eventualmente de la sonda de
detección y del mononucleósido-trifosfato que está
marcado de manera detectable, se lleva a cabo, dependiendo del tipo
de la marcación, una medición (marcación directa) o una adición de
un substrato de enzima y medición del producto liberado de
disociación (marcación con enzima). En este caso sirve
preferiblemente el recipiente utilizado durante la reacción de
hibridación también para la realización de la medición.
De lo que se ha expuesto hasta ahora en este
documento, puede deducirse que el procedimiento conforme al invento
desde la etapa, en la que los ácidos nucleicos analitos se presentan
en estado disuelto en la solución de muestra previamente preparada,
hasta el momento en el cual se presenta el híbrido inmovilizado a
base de ácido nucleico a detectar y sonda captadora, se puede
llevar a cabo sin aislamiento o separación intermedia de los ácidos
nucleicos que han de ser detectados. Esto significa una considerable
ventaja para la manipulación. El procedimiento tiene, además de
ello, la ventaja de que se puede llevar a cabo en aparatos
analizadores automáticos tal como son en general usuales para
ensayos inmunológicos (véase por ejemplo el documento
EP-A-098.590). Esto hace posible
también la elaboración simultánea tanto de parámetros inmunológicos
como también de diagnóstico de ácidos nucleicos en un solo aparato.
Además de ello, el procedimiento conforme al invento tiene la
ventaja de que es muy exacto. Frente a los procedimientos, que se
llevan a cabo sin la adición de los detergentes determinados, las
variaciones de los resultados medidos entre las distintas mediciones
con la misma muestra son diferentes en grado muy grande, mientras
que en el caso del procedimiento conforme al invento ascienden a
menos del 5%. Ésta, sin embargo, es una de las condiciones previas
para que se puedan realizar detecciones automáticas cuantitativas y
confiables de ácidos nucleicos. Especialmente, el hecho de que en el
caso de los aparatos analizadores variaban muy grandemente los
tiempos de permanencia de los recipientes de las muestras, no
admitía una realización de ensayos cuantitativos de hibridación de
ácidos nucleicos en aparatos analizadores para ensayos
inmunológicos.
Es asimismo objeto del invento un estuche de
reactivos para la inmovilización de un ácido nucleico, que contenga
en recipientes dispuestos por separado una sonda captadora
específica para un ácido nucleico que haya de ser inmovilizado y un
reactivo que contenga un hidróxido de metal alcalino y por lo menos
un detergente tomado del grupo formado por los detergentes
aniónicos, no iónicos y anfóteros y un recipiente a base de
poliestireno, polietileno o Luran. El estuche de reactivos puede
contener además otros constituyentes que sean útiles para la
inmovilización del ácido nucleico, por ejemplo un recipiente de
material sintético en el que se debe inmovilizar el ácido nucleico
a través de la sonda captadora.
\newpage
Es asimismo objeto del invento un estuche de
reactivos para la detección de un ácido nucleico, que contenga los
componentes del estuche de reactivos para la inmovilización de un
ácido nucleico, así como por lo menos otro ácido nucleico, que sea
específico para el ácido nucleico que se haya de inmovilizar,
preferiblemente en otra secuencia distinta de la sonda captadora.
Este otro ácido nucleico está preferiblemente marcado de un modo
detectable y constituye una sonda de detección.
Es asimismo objeto del invento un sistema de
análisis para la determinación automática de parámetros de
diagnóstico en soluciones de muestras, que contenga por lo menos un
recipiente para la conservación de muestras, de poliestireno,
polietileno o Luran, en un rotor para muestras, por lo menos un
recipiente de conservación de reactivos sobre un rotor para
reactivos, que contenga una solución de desnaturalización para
ácidos nucleicos en condiciones alcalinas con por lo menos un
detergente tomado del grupo formado por los detergentes aniónicos,
no iónicos y anfóteros, así como por lo menos un recipiente de
conservación de reactivos, que contenga una sonda captadora
inmovilizable o inmovilizada, específica para ciertos parámetros.
Este sistema de análisis contiene además un aparato para la
elaboración automática de detecciones con intervención sobre la
muestra, una solución de desnaturalización y la sonda
captadora.
Es asimismo objeto del invento la utilización de
detergentes glicosídicos en procedimientos para la detección de
ácidos nucleicos. Por detergentes glicosídicos se entienden los
compuestos que contienen radicales de azúcares y disminuyen la
tensión superficial de líquidos.
En la Figura 1 se ha representado
esquemáticamente una forma especialmente preferida de realización
del procedimiento conforme al invento.
En la Figura 2 se reproduce gráficamente la
estabilidad de un ADN en condiciones alcalinas (extinción a 422
nm). Puede observarse que en el caso de utilizarse
NP-40, la extinción del ADN y por consiguiente su
estabilidad después de 60 min es casi igual que al comienzo del
experimento. Sin la adición de un detergente, la cantidad de ADN ya
ha disminuido en más de la mitad después de 60 mino Esto es válido
con las tres concentraciones de ADN de HBV [= virus de la hepatitis
B](40, 80, 200 ng de ADN de HBV/ml).
Los siguientes Ejemplos explican el invento con
mayor detalle.
Ejemplo
1
Se mezclan 10 \mul de un suero que contiene
HBV con 10 \mul de NaOH 0,2 N, y se incuba durante 1 h a 37ºC y
seguidamente se mezcla con 30 \mul de una solución de
neutralización (KCl 100 mM, Tris/HCl 20 mM, MgCl_{2} 3 mM, HCl
0,067 N).
Una parte alícuota de esta mezcla es empleada en
la amplificación por PCR.
Ejemplo
2
Se emplean 20 \mul de sueros disgregados tal
como en el Ejemplo 1, de acuerdo con el siguiente esquema en la
amplificación por PCR:
- 10 x tampón para PCR:
- Tris/HCl 100 mM, KCl 500 mM, MgCl_{2} 15 mM, 1 mg/ml gelatina, pH 9,0
- Dig-11-dUTP:
- digoxigenina-11-dUTP, sal de Li (Boehringer Mannheim)
- Cebador 1:
- oligonucleótido con la secuencia de HBV 2269-2289
- Cebador 2:
- oligonucleótido con la secuencia de HBV 2419-2439 inversa.
Las tandas de la PCR se amplifican en un aparato
ciclador Perkin Elmer Thermal Cycler con 30 ciclos de 30 segundos a
92ºC, de 30 segundos a 50ºC y de 1 minuto a 70ºC.
Ejemplo
3
La amplificación y la marcación se llevan a cabo
en principio tal como se describe en el Ejemplo 2. En lugar de dCTP
se emplean 5 \mul de \alpha^{32}P-dCTP (10
\muLCi/\mul, 1.000 nCi/nmol). La concentración final de dTTP es
200 \muM y se prescinde del
Dig-11-dUTP.
Ejemplo
4
Un ADN marcado con digoxigenina, procedente de
una reacción de amplificación (PCR [H.A. Ehrlich compilador, 1989
PCR technology: Principles and applications for DNA amplification
(Tecnología de PCR: Principios y aplicaciones para la amplificación
de ADN), Stockton Press, Nueva York}, LCR (Biotechnica, documento
EP-A-0.320.308), RCR (Segev
Diagnostics [documento de patente PCT WO 90/01069], o del sistema
del documento WO 91/03573, se diluye a 1:10 con una solución de
desnaturalización (NaOH 0,05 N, NaCl 0,9%, laurilsarcosinato de
sodio al 0,1%, pH 12,5) dentro de un recipiente de poliestireno o
polietileno. El tiempo de permanencia puede variar en tal caso
entre 0 y 8 h (temperatura: 5ºC -45ºC). Se incuban 100 \mul de
esta mezcla con 400 \mul de un tampón de hibridación, que
contiene una sonda captadora biotinilada (documento
EP-A-0.063.879) durante 3 h a 37ºC
dentro de un tubo revestido con TRSA-estreptavidina
(documento EP-A-0.344.578) en un ES
300® (Boehringer Mannheim). El tampón de hibridación contiene un
tampón de fosfato de sodio 62,5 mM, NaCl 0,94 M, citrato de sodio 94
mM, laurilsarcosinato de sodio al 0,125%, albúmina de suero bovino
al 0,06%, pH 6,5. La sonda captadora biotinilada se presenta en el
tampón de hibridación con una concentración comprendida entre 25 y
150 ng/ml. Para un ADN de HBV amplificado tal como se describe en
el Ejemplo 2 se emplea una sonda captadora biotinilada de la
secuencia de HBV_{adw} 2.332-2.351 en una
cantidad de 50 ng/ml.
Después de la incubación se lava con una
solución de lavado de Enzymun® (Boehringer Mannheim) 3 veces y a
continuación se añaden por pipeteo 500 \mul de una solución de
conjugado (50 mU/ml de conjugado de
anti-digoxigenina y POD (Boehringer Mannheim GmbH)
en Tris/HCl100 mM, pH 7,5, NaCl al 0,9%, albúmina de suero bovino al
0,5%). Después de una incubación durante 30 min a 37ºC se lava
nuevamente con una solución de lavado con Enzymun® y a continuación
se incuba durante otros 30 min con substrato (ABTS®, Boehringer
Mannheim) y seguidamente se determina la extinción a 422 nm.
Ejemplo
5
Por cada tanda se desnaturalizan de 10 a 200 ng
de ADN de HBV clonado (nucleótidos 29-2.606 de la
secuencia HBV_{adw} clonado en pUCBM20) con NaOH 0,1 N, NaCl al
0,9%, NP-40 al 0,1%, pH 13, dentro de un recipiente
de poliestireno. Como comparación, se establece un experimento con
la misma solución de desnaturalización pero sin
NP-40. Después de un período de tiempo de incubación
durante 60 min, el ADN desnaturalizado se incuba durante 3 h con
500 \mul de una solución de hibridación. A continuación de ello,
se lava 3 veces con una solución de lavado con Enzymun® y se añade
por pipeteo una solución de conjugado (véase el Ejemplo 4), se
incuba durante 60 min a 37ºC, se lava de nuevo y después de la
reacción del substrato (durante 60 min) con ABTS® se mide la
extinción a 422 nm. Los resultados pueden obtenerse de la Figura
2.
Solución de hibridación: cada vez 200 ng/ml de
sonda de oligonucleótidos biotinilada (secuencia de HBV
2.456-2.417) y sonda de oligonucleótidos marcada
con digoxigenina (secuencia de HBV 287-246) en un
tampón de fosfato de sodio 62,5 mM, NaCl 0,9 M, citrato de sodio 90
mM, albúmina de suero bovino al 0,1%, laurilsarcosinato de sodio al
0,125%, pH 6,5.
La marcación con digoxigenina fue llevada a cabo
con transferasa terminal (K. Mühlegger, E. Huber, H. von der Eltz,
R. Rüger y C. Kessler 1990, Biological Chemistry
Hoppe-Seyler 371, 953-65).
\newpage
Ejemplo
6
La concentración del detergente fue de 0,1%. Se
utilizaron recipientes de poliestireno. Las demás condiciones de
reacción han de tomarse de los Ejemplos 1-4.
\newpage
Ejemplo
7
Condiciones de reacción iguales a las de los
Ejemplos 1-4.
Claims (12)
-
\global\parskip0.830000\baselineskip
1. Utilización de un detergente aniónico, no iónico o anfótero para la estabilización de ácidos nucleicos monocatenarios en soluciones alcalinas en un procedimiento para la detección de un ácido nucleico, que implica las siguientes etapas:- -
- hacer monocatenario el ácido nucleico en condiciones alcalinas;
- -
- añadir una sonda captadora inmovilizable o inmovilizada;
- -
- hibridar la sonda captadora con el ácido nucleico mediando inmovilización del ácido nucleico a través de la sonda captadora; y
- -
- detectar la cantidad de híbrido inmovilizado que se ha formado,
caracterizada porque durante el tratamiento en condiciones alcalinas está presente por lo menos un detergente tomado del grupo de los detergentes aniónicos, no iónicos y anfóteros, efectuándose la conversión en monocatenario en un recipiente de poliestireno, polietileno o Luran. - 2. Utilización según la reivindicación 1, caracterizada porque en todas las etapas del procedimiento, que van desde la de hacer monocatenario hasta la de inmovilización, está presente por lo menos un detergente tomado del grupo de los detergentes aniónicos, no iónicos y anfóteros.
- 3. Utilización según la reivindicación 1, caracterizada porque la concentración del detergente es de 0,01 hasta 10% en peso.
- 4. Utilización según la reivindicación 1, caracterizada porque la temperatura está situada entre 5 y 45ºC durante el tratamiento en condiciones alcalinas.
- 5. Utilización según la reivindicación 1, caracterizada porque por condiciones alcalinas se entiende un pH comprendido entre 9,5 y 14.
- 6. Utilización según la reivindicación 1, caracterizada porque la solución alcalina se neutraliza con el ácido nucleico monocatenario por adición de una solución de la sonda captadora inmovilizable con un pH de < 7,5.
- 7. Utilización según una de las precedentes reivindicaciones, caracterizada porque desde la operación de hacer monocatenario al ácido nucleico analito hasta la de detección de la cantidad de híbrido inmovilizable se lleva a cabo en un aparato automático de análisis, que también a intervalos irregulares interviene sobre los líquidos alcalinizados de las muestras para su detección.
- 8. Utilización de un detergente aniónico, no iónico o anfótero para la estabilización de ácidos nucleicos monocatenarios en soluciones alcalinas en recipientes de poliestireno, polietileno o Luran.
- 9. Estuche de reactivos para la inmovilización de un ácido nucleico, que contiene en recipientes separados
- -
- una sonda captadora que es específica para un ácido nucleico que se haya de inmovilizar,
- -
- un reactivo que contiene un hidróxido de metal alcalino y por lo menos un detergente tomado del grupo de los detergentes aniónicos, no iónicos y anfóteros y
- -
- un recipiente de poliestireno, polietileno o Luran.
- 10. Estuche de reactivos para la detección del ácido nucleico, que contiene los componentes del estuche de reactivos según la reivindicación 9, así como por lo menos otro ácido nucleico, que es específico para el ácido nucleico que se ha de detectar.
- 11. Estuche de reactivos según la reivindicación 10, caracterizado porque el otro ácido nucleico está marcado de manera detectable.
- 12. Sistema de análisis para la determinación automática de parámetros de diagnóstico en soluciones de muestras, que contiene
- -
- por lo menos un recipiente para la conservación de muestras, de poliestireno, polietileno o Luran en un rotor para muestras
- -
- por lo menos un recipiente para la conservación de reactivos sobre un rotor para reactivos, que contiene una solución para la desnaturalización de ácidos nucleicos, la cual en condiciones alcalinas contiene por lo menos un detergente tomado del grupo de los detergentes aniónicos, no iónicos y anfóteros,
- -
- por lo menos un recipiente para la conservación de reactivos, que contiene una sonda captadora inmovilizable o inmovilizada, que es específica para ciertos parámetros.
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1997
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