JPH0622797A - 核酸の検出方法 - Google Patents
核酸の検出方法Info
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- JPH0622797A JPH0622797A JP5088529A JP8852993A JPH0622797A JP H0622797 A JPH0622797 A JP H0622797A JP 5088529 A JP5088529 A JP 5088529A JP 8852993 A JP8852993 A JP 8852993A JP H0622797 A JPH0622797 A JP H0622797A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6832—Enhancement of hybridisation reaction
Abstract
(57)【要約】
【目的】 より適当な方法で慣用の診断薬研究の要求を
満たす核酸分析物の検出方法を提供すること。 【構成】 アルカリ条件下で一本鎖核酸に変換し、固定
化可能なカプチャー・プローブまたは固定カプチャー・
プローブを添加し、該カプチャー・プローブを介する核
酸の固定化のもとに核酸とカプチャー・プローブをハイ
ブリダイズし、合成された固定ハイブリッドの量を検出
することからなり、アルカリ条件下での処理時に陰イオ
ン、非イオンおよび両性イオン洗浄剤からなる群から選
択された少なくとも１種類の洗浄剤が存在することを特
徴とする核酸の検出方法。
満たす核酸分析物の検出方法を提供すること。 【構成】 アルカリ条件下で一本鎖核酸に変換し、固定
化可能なカプチャー・プローブまたは固定カプチャー・
プローブを添加し、該カプチャー・プローブを介する核
酸の固定化のもとに核酸とカプチャー・プローブをハイ
ブリダイズし、合成された固定ハイブリッドの量を検出
することからなり、アルカリ条件下での処理時に陰イオ
ン、非イオンおよび両性イオン洗浄剤からなる群から選
択された少なくとも１種類の洗浄剤が存在することを特
徴とする核酸の検出方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、核酸の検出方法、一本
鎖核酸の安定化用洗浄剤ならびにこの方法を行うための
試薬キットおよび分析システムに関する。
鎖核酸の安定化用洗浄剤ならびにこの方法を行うための
試薬キットおよび分析システムに関する。
【０００２】
【従来の技術】核酸ハイブリダイゼーション試験の技術
分野では、２つの相補的な核酸の特異的なハイブリダイ
ゼーションを利用することに関して、最近、１０年間に
わたってかなり進歩した。現在、例えば、免疫試験だけ
でなく核酸ハイブリダイゼーション試験によっても、感
染パラメーターのような多くのパラメーターを検出する
ことが可能である。検出する前にイン・ビトロで核酸を
特異的に複製する能力、および、それ故に、試料中に僅
かな量で存在するこれらの核酸を検出する能力は、この
目的に対して特に有用であった。
分野では、２つの相補的な核酸の特異的なハイブリダイ
ゼーションを利用することに関して、最近、１０年間に
わたってかなり進歩した。現在、例えば、免疫試験だけ
でなく核酸ハイブリダイゼーション試験によっても、感
染パラメーターのような多くのパラメーターを検出する
ことが可能である。検出する前にイン・ビトロで核酸を
特異的に複製する能力、および、それ故に、試料中に僅
かな量で存在するこれらの核酸を検出する能力は、この
目的に対して特に有用であった。
【０００３】これまでのところ、これらの核酸試験は、
それらの比較的高い困難性のために、試料の複雑な手動
式処理を必要とする個々の試験で使用されただけであ
る。このような試験の典型的な例は、ＥＰ−Ａ−０ ２
００ ３６２に開示されている。この方法では、増幅し
た核酸はゲル電気泳動によって分離される。次いで、ゲ
ル中の核酸の存在は特異的標識核酸プローブによって可
視化される。このような方法は、実際には、高い処理能
力を有する研究において慣用の診断薬に関して役に立た
ない。
それらの比較的高い困難性のために、試料の複雑な手動
式処理を必要とする個々の試験で使用されただけであ
る。このような試験の典型的な例は、ＥＰ−Ａ−０ ２
００ ３６２に開示されている。この方法では、増幅し
た核酸はゲル電気泳動によって分離される。次いで、ゲ
ル中の核酸の存在は特異的標識核酸プローブによって可
視化される。このような方法は、実際には、高い処理能
力を有する研究において慣用の診断薬に関して役に立た
ない。
【０００４】ＥＰ−Ａ−０ ２６１ ９９５には、細菌の
検出方法が開示されている。該方法は、(プロテイナー
ゼＫによる)細胞壁の溶解、アルカリ処理によるＤＮＡ
の変性、次いで、カオトロピック剤の添加による一本鎖
核酸の固定化からなる。面倒な個々の工程、特に、検出
されるべき核酸の膜への直接的固定化のために、この方
法は慣用の研究において可能ではない。
検出方法が開示されている。該方法は、(プロテイナー
ゼＫによる)細胞壁の溶解、アルカリ処理によるＤＮＡ
の変性、次いで、カオトロピック剤の添加による一本鎖
核酸の固定化からなる。面倒な個々の工程、特に、検出
されるべき核酸の膜への直接的固定化のために、この方
法は慣用の研究において可能ではない。
【０００５】細菌の溶解に関して、マニアティス(Ｍani
atis)ら(モレキュラー・クローニング(Ｍolecular Ｃlo
ning)、サムブルーク(Ｓambrook)ら編、コールド・スプ
リング・ハーバー、１９８９)はアルカリ条件下のＳＤ
Ｓ(ドデシル硫酸ナトリウム)を含む条件を開示した。こ
の刊行物では、核酸の検出は、核酸の直接的固定化およ
び膜上の検出用プローブとのハイブリダイゼーションの
後でも行われる。この条件は、慣用の診断薬における用
途に適していないが、分子生物学において行われる研究
に適している。
atis)ら(モレキュラー・クローニング(Ｍolecular Ｃlo
ning)、サムブルーク(Ｓambrook)ら編、コールド・スプ
リング・ハーバー、１９８９)はアルカリ条件下のＳＤ
Ｓ(ドデシル硫酸ナトリウム)を含む条件を開示した。こ
の刊行物では、核酸の検出は、核酸の直接的固定化およ
び膜上の検出用プローブとのハイブリダイゼーションの
後でも行われる。この条件は、慣用の診断薬における用
途に適していないが、分子生物学において行われる研究
に適している。
【０００６】今日まで、中性または僅かに酸性もしくは
アルカリ性の溶液中の緩衝液(例えば、ＴＥ：１０mＭ
Ｔris x ＨＣl、pＨ７.４、１mＭ ＥＤＴＡ)が使用され
るか、該ＤＮＡが水中に貯蔵されるかまたは凍結乾燥さ
れるかまたは−２０℃で冷凍されるか、あるいは、−２
０℃でエタノール沈殿物として貯蔵された。一方、実際
には、高い処理能力および簡単な取り扱いに重点が置か
れている慣用の分析方法ではこれらの条件使用すること
はできない。
アルカリ性の溶液中の緩衝液(例えば、ＴＥ：１０mＭ
Ｔris x ＨＣl、pＨ７.４、１mＭ ＥＤＴＡ)が使用され
るか、該ＤＮＡが水中に貯蔵されるかまたは凍結乾燥さ
れるかまたは−２０℃で冷凍されるか、あるいは、−２
０℃でエタノール沈殿物として貯蔵された。一方、実際
には、高い処理能力および簡単な取り扱いに重点が置か
れている慣用の分析方法ではこれらの条件使用すること
はできない。
【０００７】フィルターへの非特異的結合を減少させる
ために、異種ＤＮＡ(例えば、ニシンの精子ＤＮＡ)の添
加が提案された。核酸のハイブリダイゼーションを促進
するために提案された添加剤としては、ポリビニルピロ
リドン、ウシ血清アルブミン、フィコル(ＦicollR)およ
びＳＤＳが挙げられる。
ために、異種ＤＮＡ(例えば、ニシンの精子ＤＮＡ)の添
加が提案された。核酸のハイブリダイゼーションを促進
するために提案された添加剤としては、ポリビニルピロ
リドン、ウシ血清アルブミン、フィコル(ＦicollR)およ
びＳＤＳが挙げられる。
【０００８】ＥＰ−Ａ−０ １３２ ９４８によると、Ｓ
Ｂ−１６はアビジンおよびアルカリホスファターゼから
なるコンジュゲートのニトロセルロースフィルタープレ
ートへの非特異的な結合を減少させる。
Ｂ−１６はアビジンおよびアルカリホスファターゼから
なるコンジュゲートのニトロセルロースフィルタープレ
ートへの非特異的な結合を減少させる。
【０００９】さらに、この刊行物には、少量のＤＮＡま
たは一本鎖ＤＮＡを安定化させるためのガラスおよびプ
ラスチック容器のシリコーン処理が開示されている。
たは一本鎖ＤＮＡを安定化させるためのガラスおよびプ
ラスチック容器のシリコーン処理が開示されている。
【００１０】ＥＰ−Ａ−０ ２５８ ０１７には、非イオ
ン洗浄剤によるサーマス・アクアチカス(Ｔhermus aqua
ticus)由来のＤＮＡポリメラーゼの安定化が開示されて
いる。
ン洗浄剤によるサーマス・アクアチカス(Ｔhermus aqua
ticus)由来のＤＮＡポリメラーゼの安定化が開示されて
いる。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、より適当な方法で慣用の診断薬研究の要求を満
たす核酸分析物の検出方法を提供することである。
目的は、より適当な方法で慣用の診断薬研究の要求を満
たす核酸分析物の検出方法を提供することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明は、アルカリ条件
下で一本鎖核酸に変換し、固定化可能なカプチャー(cap
ture)・プローブまたは固定カプチャー・プローブを添
加し、該カプチャー・プローブを介する核酸の固定化の
もとに核酸とカプチャー・プローブをハイブリダイズ
し、合成された固定ハイブリッドの量を検出することか
らなり、アルカリ条件下での処理時に陰イオン、非イオ
ンおよび両性イオン洗浄剤からなる群から選択された少
なくとも１種類の洗浄剤が存在することを特徴とする核
酸の検出方法を提供するものである。
下で一本鎖核酸に変換し、固定化可能なカプチャー(cap
ture)・プローブまたは固定カプチャー・プローブを添
加し、該カプチャー・プローブを介する核酸の固定化の
もとに核酸とカプチャー・プローブをハイブリダイズ
し、合成された固定ハイブリッドの量を検出することか
らなり、アルカリ条件下での処理時に陰イオン、非イオ
ンおよび両性イオン洗浄剤からなる群から選択された少
なくとも１種類の洗浄剤が存在することを特徴とする核
酸の検出方法を提供するものである。
【００１３】本発明は、また、アルカリ溶液中で核酸を
安定化させるための特定の洗浄剤の使用ならびに該方法
を行うための試薬キットおよび分析システムを提供する
ものである。
安定化させるための特定の洗浄剤の使用ならびに該方法
を行うための試薬キットおよび分析システムを提供する
ものである。
【００１４】本発明の方法は、ハイブリダイゼーション
試験として知られているものの特定な具体例である。原
理は核酸診断薬の技術分野の当業者に知られている。本
明細書では特記しない限り、全ての実験的詳細は、「核
酸ハイブリダイゼーション(Ｎucleic Ａcid Ｈybridiza
tion)」、ビー・ディ・ヘイムズ(Ｂ.Ｄ.Ｈames)および
エス・ジェイ・ヒギンズ(Ｓ.Ｊ.Ｈiggins)編、ＩＲＬプ
レス、１９８６、例えば、第１章（ハイブリダイゼーシ
ョン戦略(Ｈybridization Ｓtrategy))、第３章（溶液
ハイブリダイゼーションの定量分析(Ｑuantitative Ａn
alysis of Ｓolution Ｈybridization))および第４章
（定量フィルター・ハイブリダイゼーション(Ｑuantita
tive Ｆilter Ｈybridizaion))、カレント・プロトコル
ズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Ｃurrent Ｐro
tocols in Ｍolecular Ｂiology)、エフ・エム・アウス
ベル(Ｆ.Ｍ.Ａusubel)ら編、ジェイ・ウィリィ・アンド
・サン(Ｊ.Ｗiley and Ｓon)、１９８７、およびモレキ
ュラー・クローニング(Ｍolecular Ｃloning)、ジェイ
・サムブルーク(Ｊ.Ｓambrook)ら編、ＣＳＨ、１９８９
に充分に開示されている。公知の方法としては、ＥＰ−
Ａ−０ ３２４ ４７４に開示されたような標識ヌクレオ
シド三リン酸の製造；修飾および非修飾オリゴヌクレオ
チドの化学合成；制限酵素による核酸の切断；ハイブリ
ダイズされるべき核酸間のホモロジーの程度に依存する
特異性を得るためのハイブリダイゼーション条件、それ
らのＧＣ含量およびそれらの長さの選択、ポリメラー
ゼ、および所望によりいわゆるプライマーを用いるヌク
レオシド三リン酸からの核酸の形成が挙げられる。
試験として知られているものの特定な具体例である。原
理は核酸診断薬の技術分野の当業者に知られている。本
明細書では特記しない限り、全ての実験的詳細は、「核
酸ハイブリダイゼーション(Ｎucleic Ａcid Ｈybridiza
tion)」、ビー・ディ・ヘイムズ(Ｂ.Ｄ.Ｈames)および
エス・ジェイ・ヒギンズ(Ｓ.Ｊ.Ｈiggins)編、ＩＲＬプ
レス、１９８６、例えば、第１章（ハイブリダイゼーシ
ョン戦略(Ｈybridization Ｓtrategy))、第３章（溶液
ハイブリダイゼーションの定量分析(Ｑuantitative Ａn
alysis of Ｓolution Ｈybridization))および第４章
（定量フィルター・ハイブリダイゼーション(Ｑuantita
tive Ｆilter Ｈybridizaion))、カレント・プロトコル
ズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Ｃurrent Ｐro
tocols in Ｍolecular Ｂiology)、エフ・エム・アウス
ベル(Ｆ.Ｍ.Ａusubel)ら編、ジェイ・ウィリィ・アンド
・サン(Ｊ.Ｗiley and Ｓon)、１９８７、およびモレキ
ュラー・クローニング(Ｍolecular Ｃloning)、ジェイ
・サムブルーク(Ｊ.Ｓambrook)ら編、ＣＳＨ、１９８９
に充分に開示されている。公知の方法としては、ＥＰ−
Ａ−０ ３２４ ４７４に開示されたような標識ヌクレオ
シド三リン酸の製造；修飾および非修飾オリゴヌクレオ
チドの化学合成；制限酵素による核酸の切断；ハイブリ
ダイズされるべき核酸間のホモロジーの程度に依存する
特異性を得るためのハイブリダイゼーション条件、それ
らのＧＣ含量およびそれらの長さの選択、ポリメラー
ゼ、および所望によりいわゆるプライマーを用いるヌク
レオシド三リン酸からの核酸の形成が挙げられる。
【００１５】本発明で理解される標識化としては、直接
的または間接的に検出可能な基Ｌが挙げられる。直接的
に検出可能な基としては、例えば、放射活性(32Ｐ)基、
着色基もしくは蛍光基または金属原子が挙げられる。間
接的に検出可能な基としては、例えば、抗体、抗原、ハ
プテンまたは酵素のような免疫的または酵素的に活性な
化合物あるいは酵素的に活性な部分酵素が挙げられる。
これらは、次なる反応または反応シーケンスにおいて検
出される。ハプテン標識ヌクレオシド三リン酸は一般に
ポリメラーゼの基質として特によく供され、次いで、ハ
プテンまたはハプテン化されたヌクレオシドに対する標
識抗体との反応を行うのが容易であるので、ハプテンが
特に好ましい。このようなヌクレオシド三リン酸として
は、例えば、ブロミドヌクレオシド三リン酸またはジゴ
キシゲニン、ジゴキシンまたはフルオレセイン−結合ヌ
クレオシド三リン酸が挙げられる。ＥＰ−Ａ−０ ３２
４４７４にはステロイドおよびそれらの検出が開示され
ており、特に適していることが証明された。核酸へのそ
れらの取込みに関して、ＥＰ−Ａ−０ ３２４ ４７４を
引用記載する。
的または間接的に検出可能な基Ｌが挙げられる。直接的
に検出可能な基としては、例えば、放射活性(32Ｐ)基、
着色基もしくは蛍光基または金属原子が挙げられる。間
接的に検出可能な基としては、例えば、抗体、抗原、ハ
プテンまたは酵素のような免疫的または酵素的に活性な
化合物あるいは酵素的に活性な部分酵素が挙げられる。
これらは、次なる反応または反応シーケンスにおいて検
出される。ハプテン標識ヌクレオシド三リン酸は一般に
ポリメラーゼの基質として特によく供され、次いで、ハ
プテンまたはハプテン化されたヌクレオシドに対する標
識抗体との反応を行うのが容易であるので、ハプテンが
特に好ましい。このようなヌクレオシド三リン酸として
は、例えば、ブロミドヌクレオシド三リン酸またはジゴ
キシゲニン、ジゴキシンまたはフルオレセイン−結合ヌ
クレオシド三リン酸が挙げられる。ＥＰ−Ａ−０ ３２
４４７４にはステロイドおよびそれらの検出が開示され
ており、特に適していることが証明された。核酸へのそ
れらの取込みに関して、ＥＰ−Ａ−０ ３２４ ４７４を
引用記載する。
【００１６】ヌクレオシド三リン酸(ＮＴＰ)はリボヌク
レオシド三リン酸(ｒＮＴＰ)またはデオキシリボヌクレ
オシド三リン酸(ｄＮＴＰ)である。
レオシド三リン酸(ｒＮＴＰ)またはデオキシリボヌクレ
オシド三リン酸(ｄＮＴＰ)である。
【００１７】核酸分析物は検出されるべき核酸であると
解される。したがって、核酸分析物としては、例えば、
ウイロイド、ウイルス、細菌または細胞の起源の核酸の
ようないずれかの起源の核酸が挙げられる。それらは、
溶液、懸濁液中に存在し、固体上に固定されてもよい
か、あるいは細胞含有培地、細胞塗抹、固定細胞、組織
粒子または固定微生物中に含有され得る。核酸は溶液中
に存在するのが好ましい。通常、反応シーケンスは、核
酸分析物を対応する試薬と共に調製することによって開
始される。これは、pＨの変化(アルカリ)、熱、極度の
温度変化の繰り返し(冷凍／解凍)、生理学的成長条件
(浸透圧)の変化、洗浄剤、カオトロピック塩または酵素
(例えば、プロテアーゼ、リパーゼ)の作用によって促進
され得る。これらの因子は核酸を放出するために単独で
または組み合わせて使用してもよい。本発明の方法は非
常に高感度かつ選択的であるので、例えば蛋白、細胞、
細胞断片のような他の物質の存在下、または検出される
べきでない核酸の存在下でも、非常に少量の核酸が検出
される。検出されるべき核酸が使用される試薬との反応
に従事するために充分な量で利用可能であるという条件
で、試料の精製はもはや必要とされない。
解される。したがって、核酸分析物としては、例えば、
ウイロイド、ウイルス、細菌または細胞の起源の核酸の
ようないずれかの起源の核酸が挙げられる。それらは、
溶液、懸濁液中に存在し、固体上に固定されてもよい
か、あるいは細胞含有培地、細胞塗抹、固定細胞、組織
粒子または固定微生物中に含有され得る。核酸は溶液中
に存在するのが好ましい。通常、反応シーケンスは、核
酸分析物を対応する試薬と共に調製することによって開
始される。これは、pＨの変化(アルカリ)、熱、極度の
温度変化の繰り返し(冷凍／解凍)、生理学的成長条件
(浸透圧)の変化、洗浄剤、カオトロピック塩または酵素
(例えば、プロテアーゼ、リパーゼ)の作用によって促進
され得る。これらの因子は核酸を放出するために単独で
または組み合わせて使用してもよい。本発明の方法は非
常に高感度かつ選択的であるので、例えば蛋白、細胞、
細胞断片のような他の物質の存在下、または検出される
べきでない核酸の存在下でも、非常に少量の核酸が検出
される。検出されるべき核酸が使用される試薬との反応
に従事するために充分な量で利用可能であるという条件
で、試料の精製はもはや必要とされない。
【００１８】鋳型核酸は、実質的に相補的な核酸鎖が新
しく合成される核酸である。鋳型核酸は転写に必要な配
列情報を含有する。
しく合成される核酸である。鋳型核酸は転写に必要な配
列情報を含有する。
【００１９】核酸を変性することは、二本鎖核酸を一本
鎖核酸に分離することを意味する。概して、当業者は種
々の可能性、例えば、水酸化アルカリによる処理、熱ま
たは化学的処理から選択することができる。
鎖核酸に分離することを意味する。概して、当業者は種
々の可能性、例えば、水酸化アルカリによる処理、熱ま
たは化学的処理から選択することができる。
【００２０】特異的検出とは、ある核酸を他の核酸の存
在下で選択的に検出する方法を意味する。しかし、部分
的に同一または類似のヌクレオチド配列を有する１群の
核酸を検出することも可能である。二本鎖核酸の検出
は、２つの相補鎖の各々からなり得る。
在下で選択的に検出する方法を意味する。しかし、部分
的に同一または類似のヌクレオチド配列を有する１群の
核酸を検出することも可能である。二本鎖核酸の検出
は、２つの相補鎖の各々からなり得る。
【００２１】他の核酸と実質的に相補的である核酸また
は核酸配列は、ハイブリダイジング断片における核酸配
列が他の核酸と厳密に相補的であるかまたは厳密に相補
的な核酸と２、３個の塩基だけが異なる対応する核酸と
ハイブリダイズすることが可能である核酸または配列で
あると解される。特異性は、相補性の程度およびハイブ
リダイゼーション条件の両方に依存する。
は核酸配列は、ハイブリダイジング断片における核酸配
列が他の核酸と厳密に相補的であるかまたは厳密に相補
的な核酸と２、３個の塩基だけが異なる対応する核酸と
ハイブリダイズすることが可能である核酸または配列で
あると解される。特異性は、相補性の程度およびハイブ
リダイゼーション条件の両方に依存する。
【００２２】核酸の検出で使用される水相は、通常、溶
解された有機物質または無機物質、例えば緩衝物質、過
剰の試薬、検出されるべきでない核酸、蛋白などを含有
する液相である。
解された有機物質または無機物質、例えば緩衝物質、過
剰の試薬、検出されるべきでない核酸、蛋白などを含有
する液相である。
【００２３】検出されるべき核酸は、核酸分析物そのも
のであってもよい。しかし、試料液中での前処理を介し
て核酸分析物から得られる核酸であってもよい。公知の
前処理法としては、特に、例えば制限酵素による断片形
成またはＲＮＡからのｃＤＮＡ合成が挙げられる。その
長所を充分に説明するための本発明の方法について、検
出されるべき核酸が最小限の長さ４０ｂｐを有する場合
に優れていることが判明した。
のであってもよい。しかし、試料液中での前処理を介し
て核酸分析物から得られる核酸であってもよい。公知の
前処理法としては、特に、例えば制限酵素による断片形
成またはＲＮＡからのｃＤＮＡ合成が挙げられる。その
長所を充分に説明するための本発明の方法について、検
出されるべき核酸が最小限の長さ４０ｂｐを有する場合
に優れていることが判明した。
【００２４】好ましくは、検出されるべき核酸は上流の
特異的または非特異的核酸複製の生成物である。このよ
うな核酸増幅法は、例えば、ＥＰ−Ａ−０ ２０１ １８
４、ＥＰ−Ａ−０ ２３７ ３６２、ＥＰ−Ａ−０ ３２
９ ８２２、ＥＰ−Ａ−０ ３２０ ３０８またはＷＯ ８
８／１０３１５から知られている。これらの方法では、
核酸分析物は最終的に検出されるべきである核酸の合成
のための鋳型核酸として供される。
特異的または非特異的核酸複製の生成物である。このよ
うな核酸増幅法は、例えば、ＥＰ−Ａ−０ ２０１ １８
４、ＥＰ−Ａ−０ ２３７ ３６２、ＥＰ−Ａ−０ ３２
９ ８２２、ＥＰ−Ａ−０ ３２０ ３０８またはＷＯ ８
８／１０３１５から知られている。これらの方法では、
核酸分析物は最終的に検出されるべきである核酸の合成
のための鋳型核酸として供される。
【００２５】しかし、該核酸はクローニングおよびイン
・ビボ複製によって得られてもよい。
・ビボ複製によって得られてもよい。
【００２６】体液(例えば、血清)中の特定のウイルスを
検出する方法は第１工程としてウイルス外膜の溶解で開
始してよい。当業者は細胞壁の溶解方法に精通してい
る。溶解は、例えば、水酸化アルカリ溶液による処理に
よって行うことができる。他の可能性は、添加物、例え
ば洗浄剤の添加である。特に、低濃度で体液中に存在す
るウイルス(例えば、Ｃ型肝炎ウイルス)の場合、この工
程の次に、(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応または他の
前記複製方法のうちの１つによって)核酸のイン・ビト
ロ複製を行うこともできる。ここでは、核酸の鋳型であ
る核酸分析物が多くの核酸を合成するのに供され、次い
で、本発明の方法で検出される。
検出する方法は第１工程としてウイルス外膜の溶解で開
始してよい。当業者は細胞壁の溶解方法に精通してい
る。溶解は、例えば、水酸化アルカリ溶液による処理に
よって行うことができる。他の可能性は、添加物、例え
ば洗浄剤の添加である。特に、低濃度で体液中に存在す
るウイルス(例えば、Ｃ型肝炎ウイルス)の場合、この工
程の次に、(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応または他の
前記複製方法のうちの１つによって)核酸のイン・ビト
ロ複製を行うこともできる。ここでは、核酸の鋳型であ
る核酸分析物が多くの核酸を合成するのに供され、次い
で、本発明の方法で検出される。
【００２７】例えば食物中の細菌を検出する場合、本発
明の方法はいくつかの工程によって行われ得る。
明の方法はいくつかの工程によって行われ得る。
【００２８】一般に、所望により細菌細胞壁を溶解させ
る条件下(例えば、プロテイナーゼ、アルカリ)での細菌
のイン・ビボ複製の後、細菌試料を消化させる。非常に
低濃度の試料の場合、これに次いで、細菌の核酸分析物
のイン・ビトロ増幅を行ってもよい。
る条件下(例えば、プロテイナーゼ、アルカリ)での細菌
のイン・ビボ複製の後、細菌試料を消化させる。非常に
低濃度の試料の場合、これに次いで、細菌の核酸分析物
のイン・ビトロ増幅を行ってもよい。
【００２９】これらの種々の前処理は、常に、溶解状態
に核酸、ならびに、調製工程が必要である場合は、試薬
および溶解細胞成分も含有する試料液を製造する。
に核酸、ならびに、調製工程が必要である場合は、試薬
および溶解細胞成分も含有する試料液を製造する。
【００３０】本発明の方法は、陰イオン、非イオンおよ
び両性イオン洗浄剤からなる群から選択される少なくと
も１種類の洗浄剤が存在する、アルカリ条件下での試料
の処理を提案する。該条件は、液中に存在する核酸がま
だ一本鎖核酸でない場合にこれが一本鎖核酸に変換され
るような条件である。これを行うために、該液に、添加
後に９.５〜１４、好ましくは１１〜１３.５の範囲の試
料pＨが得られる量の水酸化アルカリ、好ましくは水酸
化ナトリウムを、固形物質の形態で、または好ましくは
溶液として添加する。添加された溶液は、さらなる添加
物(例えば、塩および緩衝液)を含有してもよい。
び両性イオン洗浄剤からなる群から選択される少なくと
も１種類の洗浄剤が存在する、アルカリ条件下での試料
の処理を提案する。該条件は、液中に存在する核酸がま
だ一本鎖核酸でない場合にこれが一本鎖核酸に変換され
るような条件である。これを行うために、該液に、添加
後に９.５〜１４、好ましくは１１〜１３.５の範囲の試
料pＨが得られる量の水酸化アルカリ、好ましくは水酸
化ナトリウムを、固形物質の形態で、または好ましくは
溶液として添加する。添加された溶液は、さらなる添加
物(例えば、塩および緩衝液)を含有してもよい。
【００３１】本発明の主旨は、一本鎖への転換のための
アルカリ条件下での処理時の特定の洗浄剤の存在が有意
な長所をもたらすという発見である。本発明を遂行する
場合、この洗浄剤は、固形物質としてまたは好ましくは
試料液中の洗浄剤濃度が０.０１ｗｔ％〜１０ｗｔ％、
好ましくは０.０５ｗｔ％〜５ｗｔ％に達するような溶
液の形態で試料液に添加される。アルカリ条件に調節す
る前または後に、調製した試料液に該洗浄剤を添加する
ことが可能である。特に好ましい方法では、試料液に添
加する場合、該洗浄剤はすでにアルカリ変性溶液に含有
されているかまたはそれと一緒に添加される。変性溶液
中の洗浄剤濃度は、好ましくは０.０１〜１５ｗｔ％で
あり、特に好ましい濃度は０.０５〜１０ｗｔ％の範囲
である。
アルカリ条件下での処理時の特定の洗浄剤の存在が有意
な長所をもたらすという発見である。本発明を遂行する
場合、この洗浄剤は、固形物質としてまたは好ましくは
試料液中の洗浄剤濃度が０.０１ｗｔ％〜１０ｗｔ％、
好ましくは０.０５ｗｔ％〜５ｗｔ％に達するような溶
液の形態で試料液に添加される。アルカリ条件に調節す
る前または後に、調製した試料液に該洗浄剤を添加する
ことが可能である。特に好ましい方法では、試料液に添
加する場合、該洗浄剤はすでにアルカリ変性溶液に含有
されているかまたはそれと一緒に添加される。変性溶液
中の洗浄剤濃度は、好ましくは０.０１〜１５ｗｔ％で
あり、特に好ましい濃度は０.０５〜１０ｗｔ％の範囲
である。
【００３２】好ましい非イオン洗浄剤としては、シンペ
ロニック(Ｓynperonic)(ポリオキシエチレンおよびポリ
エトキシプロピレンから製造されたブロック・コポリマ
ー、ファルマシア(Ｐharmacia))、トゥイーン(Ｔween)
２０(ポリエチレングリコール(２０)モノラウリル酸ソ
ルビタン)、テシット(ＴhesitR)(ドデシルポリエチレン
グリコールエーテル)、トリトン(Ｔriton) Ｘ−１００
(ポリエチレングリコールエーテル)およびグリコシド系
洗浄剤、例えばオクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドが
挙げられる。本発明において、ＳynperonicおよびＮＰ
−４０が特に有効である。
ロニック(Ｓynperonic)(ポリオキシエチレンおよびポリ
エトキシプロピレンから製造されたブロック・コポリマ
ー、ファルマシア(Ｐharmacia))、トゥイーン(Ｔween)
２０(ポリエチレングリコール(２０)モノラウリル酸ソ
ルビタン)、テシット(ＴhesitR)(ドデシルポリエチレン
グリコールエーテル)、トリトン(Ｔriton) Ｘ−１００
(ポリエチレングリコールエーテル)およびグリコシド系
洗浄剤、例えばオクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドが
挙げられる。本発明において、ＳynperonicおよびＮＰ
−４０が特に有効である。
【００３３】陰イオン洗浄剤の例としては、ＳＤＳ(ラ
ウリル硫酸ナトリウム)、ラウリルサルコシンナトリウ
ムおよびデオキシコール酸ナトリウムが挙げられる。こ
の群からの好ましい物質はＳＤＳである。
ウリル硫酸ナトリウム)、ラウリルサルコシンナトリウ
ムおよびデオキシコール酸ナトリウムが挙げられる。こ
の群からの好ましい物質はＳＤＳである。
【００３４】両性イオン洗浄剤としては、ツヴィッター
ジェント(Ｚwittergent)３−０８(Ｎ−オクチル−Ｎ,Ｎ
−ジメチル−３−アミノ−１−プロパン・スルホナー
ト)、ツヴィッタージェント３−１２(Ｎ−ドデカニル−
Ｎ,Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパン・ス
ルホナート)、ＣＨＡＰＳ(３−[(３−コラミドプロピ
ル)−ジメチル−アンモニオ]−１−プロパン・スルホナ
ート)およびＣＨＡＰＳＯ(３−[(３−コラミドプロピ
ル)−ジメチルアミノ]−２−ヒドロキシ−１−プロパン
・スルホナート)が挙げられる。ツヴィッタージェント
３−１２が特に有効であることが判明した。
ジェント(Ｚwittergent)３−０８(Ｎ−オクチル−Ｎ,Ｎ
−ジメチル−３−アミノ−１−プロパン・スルホナー
ト)、ツヴィッタージェント３−１２(Ｎ−ドデカニル−
Ｎ,Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパン・ス
ルホナート)、ＣＨＡＰＳ(３−[(３−コラミドプロピ
ル)−ジメチル−アンモニオ]−１−プロパン・スルホナ
ート)およびＣＨＡＰＳＯ(３−[(３−コラミドプロピ
ル)−ジメチルアミノ]−２−ヒドロキシ−１−プロパン
・スルホナート)が挙げられる。ツヴィッタージェント
３−１２が特に有効であることが判明した。
【００３５】本発明では、一本鎖への変換のための条件
は、検出されるべき核酸の顕著な分解を生じずに１分〜
８時間維持され得る。好ましい方法では、４時間後に初
めに、存在した核酸の９０％を超えて検出可能である。
は、検出されるべき核酸の顕著な分解を生じずに１分〜
８時間維持され得る。好ましい方法では、４時間後に初
めに、存在した核酸の９０％を超えて検出可能である。
【００３６】変性は、プラスチック容器中で生じるのが
好ましい。これは、特に、試料貯蔵容器として慣用の自
動分析器中で使用されるこれらの容器が挙げられる。例
としては、ポリスチレン、ポリエチレンまたはルラン(l
uran)から製造された容器が挙げられる。アルカリおよ
び洗浄剤での処理時に、処理が行われる容器は、すで
に、分析器中にあるのが好ましく、特に試料ローター上
にあり、試料採取装置を該ローター上にある個々の試料
容器に出し入れさせるのが好ましい。このような自動分
析器は、例えば、ＥＰ−Ａ−０ ３６１ ８３０に開示さ
れている。
好ましい。これは、特に、試料貯蔵容器として慣用の自
動分析器中で使用されるこれらの容器が挙げられる。例
としては、ポリスチレン、ポリエチレンまたはルラン(l
uran)から製造された容器が挙げられる。アルカリおよ
び洗浄剤での処理時に、処理が行われる容器は、すで
に、分析器中にあるのが好ましく、特に試料ローター上
にあり、試料採取装置を該ローター上にある個々の試料
容器に出し入れさせるのが好ましい。このような自動分
析器は、例えば、ＥＰ−Ａ−０ ３６１ ８３０に開示さ
れている。
【００３７】本発明は、充填された試料貯蔵容器の放置
時間が容器ごとに変化し、したがって、種々の長さのア
ルカリ処理時間が導入される分析器および分析方法に関
連して使用される場合に特に有用である。緊急の場合、
ある試料の分析を最初に行い、他の試料の分析を後で行
うことができることがこれらの自動分析器の長所であ
る。
時間が容器ごとに変化し、したがって、種々の長さのア
ルカリ処理時間が導入される分析器および分析方法に関
連して使用される場合に特に有用である。緊急の場合、
ある試料の分析を最初に行い、他の試料の分析を後で行
うことができることがこれらの自動分析器の長所であ
る。
【００３８】本発明の方法におけるもう１つの必須工程
は、固定化可能なカプチャー・プローブまたは固定カプ
チャー・プローブの添加である。これは、ピペットを使
用して一本鎖核酸を有する溶液に固定化可能なカプチャ
ー・プローブの溶液を添加することによって、または、
例えば、カプチャー・プローブを結合する固形物質とそ
れを接触させることによって行われ得る。
は、固定化可能なカプチャー・プローブまたは固定カプ
チャー・プローブの添加である。これは、ピペットを使
用して一本鎖核酸を有する溶液に固定化可能なカプチャ
ー・プローブの溶液を添加することによって、または、
例えば、カプチャー・プローブを結合する固形物質とそ
れを接触させることによって行われ得る。
【００３９】固定化可能なカプチャー・プローブは、固
定化の可能ないくつかの基Ｉのうちの１つを有するとい
う点で検出されるべき核酸と実質的に相補的である通常
の核酸とは構造が異なる核酸であると解される。好まし
い場合、カプチャー・プローブは、相補鎖を添加しない
一本鎖核酸である。一本鎖カプチャー・プローブを有す
る溶液は、好ましくは、ハイブリダイゼーション促進物
質、例えばＳＳＣ、(より長い断片が存在する場合は)ホ
ルムアミドまたは検出されるべきではない核酸のための
遮断薬、好ましくはpＨ値を正しく調節するための試薬
を含有するのも好ましい。特に好ましいカプチャー・プ
ローブはＤＥ−Ａ−４１ ２３ ５４０に開示されている
核酸である。
定化の可能ないくつかの基Ｉのうちの１つを有するとい
う点で検出されるべき核酸と実質的に相補的である通常
の核酸とは構造が異なる核酸であると解される。好まし
い場合、カプチャー・プローブは、相補鎖を添加しない
一本鎖核酸である。一本鎖カプチャー・プローブを有す
る溶液は、好ましくは、ハイブリダイゼーション促進物
質、例えばＳＳＣ、(より長い断片が存在する場合は)ホ
ルムアミドまたは検出されるべきではない核酸のための
遮断薬、好ましくはpＨ値を正しく調節するための試薬
を含有するのも好ましい。特に好ましいカプチャー・プ
ローブはＤＥ−Ａ−４１ ２３ ５４０に開示されている
核酸である。
【００４０】一本鎖カプチャー・プローブは、例えば、
ＤＥ−Ａ−３９ １６ ８７１またはＥＰ−Ｂ−０ １８
４ ０５６に従った化学的核酸合成法を介して得ること
ができる。
ＤＥ−Ａ−３９ １６ ８７１またはＥＰ−Ｂ−０ １８
４ ０５６に従った化学的核酸合成法を介して得ること
ができる。
【００４１】自動分析器上で検出方法を行う場合、ハイ
ブリダイゼーション溶液は、好ましい方法では、いくつ
かの異なる測定法用の試薬を保持するローター上に置か
れる試薬貯蔵容器から自動的に採取される。次いで、該
ハイブリダイゼーション溶液を検出されるべき変性核酸
を含有する液体のアリコートと合わせる。特に好ましい
方法では、まず、分析機によって試料貯蔵容器から所定
量を取り出し、次いで、所定の試薬貯蔵容器から所定量
のハイブリダイゼーション溶液を取り出し、次いで、両
者を固定化および検出容器に注ぐ。
ブリダイゼーション溶液は、好ましい方法では、いくつ
かの異なる測定法用の試薬を保持するローター上に置か
れる試薬貯蔵容器から自動的に採取される。次いで、該
ハイブリダイゼーション溶液を検出されるべき変性核酸
を含有する液体のアリコートと合わせる。特に好ましい
方法では、まず、分析機によって試料貯蔵容器から所定
量を取り出し、次いで、所定の試薬貯蔵容器から所定量
のハイブリダイゼーション溶液を取り出し、次いで、両
者を固定化および検出容器に注ぐ。
【００４２】固定化可能である基Ｉは、天然の核酸中に
通常存在しないかまたは化学反応もしくはは光反応で固
相に結合され得る化学基である。基Ｉは、基特異的相互
作用を介して他の分子または分子の部分によって認識さ
れ、かくして、結合され得る基または分子の部分でもあ
り得る。このような基としては、例えば、ハプテン、抗
原および抗体、ヌクレオチド配列、レセプター、調節配
列、糖蛋白、例えば、レクチンまたはビオチンもしくは
イミノビオチンのような結合蛋白の結合相手が挙げられ
る。好ましい基はビタミンおよびハプテンであり、特に
好ましくはビオチン、フルオレセインまたはジゴキシゲ
ニンもしくはジゴキシンのようなステロイドである。
通常存在しないかまたは化学反応もしくはは光反応で固
相に結合され得る化学基である。基Ｉは、基特異的相互
作用を介して他の分子または分子の部分によって認識さ
れ、かくして、結合され得る基または分子の部分でもあ
り得る。このような基としては、例えば、ハプテン、抗
原および抗体、ヌクレオチド配列、レセプター、調節配
列、糖蛋白、例えば、レクチンまたはビオチンもしくは
イミノビオチンのような結合蛋白の結合相手が挙げられ
る。好ましい基はビタミンおよびハプテンであり、特に
好ましくはビオチン、フルオレセインまたはジゴキシゲ
ニンもしくはジゴキシンのようなステロイドである。
【００４３】カプチャー・プローブの検出されるべき一
本鎖核酸とのインキュベーション時に、後者の２つがハ
イブリダイズしてハイブリッドＤを形成する。さらなる
核酸、例えば検出プローブをハイブリッドＤの一本鎖部
分とハイブリダイズする場合、それらはこの混合物に添
加されていてもよく、所望によりハイブリダイズされて
もよい。
本鎖核酸とのインキュベーション時に、後者の２つがハ
イブリダイズしてハイブリッドＤを形成する。さらなる
核酸、例えば検出プローブをハイブリッドＤの一本鎖部
分とハイブリダイズする場合、それらはこの混合物に添
加されていてもよく、所望によりハイブリダイズされて
もよい。
【００４４】検出されるべき核酸が試料中に存在する場
合に溶解された形態で核酸ハイブリッドＤを含有する液
体を、核酸プローブの固定化可能な基を介してハイブリ
ッドＤを特異的に結合することができる固相と接触させ
る。固相のタイプは、固定化可能な基Ｉによって決定さ
れる。後者は、Ｉとの結合相互作用をもたらすことがで
きる固定基Ｒを有するのが好ましい。例えば、固定化可
能な基がハプテンである場合、表面がこのハプテンに対
する抗体を有する固相を使用することができる。固定化
可能な基がビタミン、例えばビオチンである場合、固相
は固定された形態のアビジンまたはストレプトアビジン
のような結合蛋白を含有することができる。特に好まし
くは、残基ＩおよびＲはビオチンおよびストレプトアビ
ジンである。修飾核酸の基を介する固定化は、それが例
えばハイブリダイゼーション反応よりも緩和な条件下で
行うことができるので特に好都合である。
合に溶解された形態で核酸ハイブリッドＤを含有する液
体を、核酸プローブの固定化可能な基を介してハイブリ
ッドＤを特異的に結合することができる固相と接触させ
る。固相のタイプは、固定化可能な基Ｉによって決定さ
れる。後者は、Ｉとの結合相互作用をもたらすことがで
きる固定基Ｒを有するのが好ましい。例えば、固定化可
能な基がハプテンである場合、表面がこのハプテンに対
する抗体を有する固相を使用することができる。固定化
可能な基がビタミン、例えばビオチンである場合、固相
は固定された形態のアビジンまたはストレプトアビジン
のような結合蛋白を含有することができる。特に好まし
くは、残基ＩおよびＲはビオチンおよびストレプトアビ
ジンである。修飾核酸の基を介する固定化は、それが例
えばハイブリダイゼーション反応よりも緩和な条件下で
行うことができるので特に好都合である。
【００４５】好ましい方法では、合成された核酸を固定
化するために、核酸ハイブリッドＤの合成前または合成
時または合成後に容器中に反応混合物を充填する。固定
化可能な基との反応は、この容器の表面で起こり得る。
好ましい方法では、プローブとのハイブリダイゼーショ
ン反応は実質的には固定化と同時に起こる。反応混合物
が適用され得る膜、織物、またはフリースのような多孔
性物質の形態で固相を使用することができる。ビーズま
たはラテックス粒子を使用することもできる。好ましい
容器としては、キュベット、チューブまたは微量滴定プ
レートが挙げられる。固相は、少なくとも、核酸ハイブ
リッドＤ、したがって検出されるべき核酸が存在すると
同様に多くの、プローブの固定化可能な基に対する結合
部位を有すべきである。
化するために、核酸ハイブリッドＤの合成前または合成
時または合成後に容器中に反応混合物を充填する。固定
化可能な基との反応は、この容器の表面で起こり得る。
好ましい方法では、プローブとのハイブリダイゼーショ
ン反応は実質的には固定化と同時に起こる。反応混合物
が適用され得る膜、織物、またはフリースのような多孔
性物質の形態で固相を使用することができる。ビーズま
たはラテックス粒子を使用することもできる。好ましい
容器としては、キュベット、チューブまたは微量滴定プ
レートが挙げられる。固相は、少なくとも、核酸ハイブ
リッドＤ、したがって検出されるべき核酸が存在すると
同様に多くの、プローブの固定化可能な基に対する結合
部位を有すべきである。
【００４６】好ましい固相の調製を開示するＥＰ−Ａ−
０ ３４４ ５７８を充分に引用記載する。
０ ３４４ ５７８を充分に引用記載する。
【００４７】自動分析器で行うことができる特に好まし
い具体例では、本発明の変性核酸を有する溶液を、結合
された形態でその表面にカプチャー・プローブの固定化
基に対して特異的な結合相手を含有する容器に注ぐ。固
定化基を有する一本鎖カプチャー・プローブを含有する
ハイブリダイジング溶液を該容器中に添加する。これは
反応混合物を中和する。カプチャー・プローブとハイブ
リダイズした検出されるべき核酸は固相に結合される。
い具体例では、本発明の変性核酸を有する溶液を、結合
された形態でその表面にカプチャー・プローブの固定化
基に対して特異的な結合相手を含有する容器に注ぐ。固
定化基を有する一本鎖カプチャー・プローブを含有する
ハイブリダイジング溶液を該容器中に添加する。これは
反応混合物を中和する。カプチャー・プローブとハイブ
リダイズした検出されるべき核酸は固相に結合される。
【００４８】固定カプチャー・プローブは、検出される
べき核酸の少なくとも一部分と実質的に相補的である核
酸であると介される。この実質的に相補的な核酸は添加
時にすでに固相に結合されている。該結合は共有であり
得るが、固定化可能なプローブに関係して記載したとお
り、生体特異的相互作用に基づいていてもよい。固相
は、容器であり得るが、他の幾何学の固形物質、例えば
他の容器を必要とする球形であってもよい。
べき核酸の少なくとも一部分と実質的に相補的である核
酸であると介される。この実質的に相補的な核酸は添加
時にすでに固相に結合されている。該結合は共有であり
得るが、固定化可能なプローブに関係して記載したとお
り、生体特異的相互作用に基づいていてもよい。固相
は、容器であり得るが、他の幾何学の固形物質、例えば
他の容器を必要とする球形であってもよい。
【００４９】固定化反応が起こるインキュベーション期
間の後、容器、多孔性物質またはペレット化ビーズから
液相を除去する。次いで、ハイブリッドＤの固相への結
合が非常に有効であるので、固相を適当な緩衝液で洗浄
することができる。
間の後、容器、多孔性物質またはペレット化ビーズから
液相を除去する。次いで、ハイブリッドＤの固相への結
合が非常に有効であるので、固相を適当な緩衝液で洗浄
することができる。
【００５０】検出されるべき核酸および固相に結合され
るカプチャー・プローブからなるハイブリッドの量は概
略公知の方法で測定され得る。一方、これは、サンドイ
ッチ・ハイブリダイゼーション法にしたがってカプチャ
ー・プローブによって行われ得る。この方法では、ハイ
ブリッドを、カプチャー・プローブが特異的であり、か
つそれとハイブリダイズされる配列とは異なる、検出さ
れるべき核酸のヌクレオチド配列と相補的である検出プ
ローブと反応させる。固相で形成されたものは検出プロ
ーブ、検出されるべき核酸およびカプチャー・プローブ
からなるハイブリッドである。このような方法は、例え
ば、ＥＰ−Ａ−０ ０７９ １３９に開示されている。好
ましい方法では、カプチャー・プローブと一緒に検出プ
ローブをハイブリダイゼーション溶液に添加する。
るカプチャー・プローブからなるハイブリッドの量は概
略公知の方法で測定され得る。一方、これは、サンドイ
ッチ・ハイブリダイゼーション法にしたがってカプチャ
ー・プローブによって行われ得る。この方法では、ハイ
ブリッドを、カプチャー・プローブが特異的であり、か
つそれとハイブリダイズされる配列とは異なる、検出さ
れるべき核酸のヌクレオチド配列と相補的である検出プ
ローブと反応させる。固相で形成されたものは検出プロ
ーブ、検出されるべき核酸およびカプチャー・プローブ
からなるハイブリッドである。このような方法は、例え
ば、ＥＰ−Ａ−０ ０７９ １３９に開示されている。好
ましい方法では、カプチャー・プローブと一緒に検出プ
ローブをハイブリダイゼーション溶液に添加する。
【００５１】本発明の検出方法の前に増幅反応を行う場
合、増幅反応時に(検出されるべき核酸である)複製生成
物に検出可能な基を取り込むのが好ましい。このような
方法は、例えば、ＤＥ−Ａ−４ ０４１ ６０８に開示さ
れている。この刊行物に開示された方法では、モノヌク
レオシド三リン酸を増幅反応に一体化する。この場合、
検出されるべき核酸の標識が検出され得るので、検出プ
ローブとのハイブリダイゼーションはもはや必要ではな
い。
合、増幅反応時に(検出されるべき核酸である)複製生成
物に検出可能な基を取り込むのが好ましい。このような
方法は、例えば、ＤＥ−Ａ−４ ０４１ ６０８に開示さ
れている。この刊行物に開示された方法では、モノヌク
レオシド三リン酸を増幅反応に一体化する。この場合、
検出されるべき核酸の標識が検出され得るので、検出プ
ローブとのハイブリダイゼーションはもはや必要ではな
い。
【００５２】直接検出可能な基、例えば蛍光標識では、
標識の量は蛍光測定法で測定される。検出可能な基が間
接的に検出され得る場合、例えばハプテンである場合、
ＥＰ−Ａ−０ ３２４ ４７４の対応する開示に従って、
修飾核酸をこのハプテンに対する標識抗体と反応させる
のが好ましい。抗体での標識は、例えば、色素もしくは
蛍光標識または好ましくはβ−ガラクトシダーゼ、アル
カリホスファターゼまたはペルオキシダーゼのような酵
素標識であり得る。酵素標識を使用する場合、核酸の量
は、色素基質、化学発光基質または蛍光基質との酵素反
応の光度測定的、化学発光測定的または蛍光光度測定的
モニターリングで測定される。得られたシグナルは初期
に存在する検出されるべき核酸、したがって、検出され
るべき微生物の量に関する指標である。
標識の量は蛍光測定法で測定される。検出可能な基が間
接的に検出され得る場合、例えばハプテンである場合、
ＥＰ−Ａ−０ ３２４ ４７４の対応する開示に従って、
修飾核酸をこのハプテンに対する標識抗体と反応させる
のが好ましい。抗体での標識は、例えば、色素もしくは
蛍光標識または好ましくはβ−ガラクトシダーゼ、アル
カリホスファターゼまたはペルオキシダーゼのような酵
素標識であり得る。酵素標識を使用する場合、核酸の量
は、色素基質、化学発光基質または蛍光基質との酵素反
応の光度測定的、化学発光測定的または蛍光光度測定的
モニターリングで測定される。得られたシグナルは初期
に存在する検出されるべき核酸、したがって、検出され
るべき微生物の量に関する指標である。
【００５３】好ましい方法では、自動分析器によって、
合成されたハイブリッドを検出する。これを行うため
に、一本鎖核酸のカプチャー・プローブおよび所望によ
り検出プローブとのインキュベーション後に試料液を固
定ハイブリッドから分離する。これは、例えば、固定ハ
イブリッドから液体を除去することによって行われ得
る。これは固相の種類に依存する。例えば、容器を使用
する場合、例えば、該液体は、例えばピペッティングに
よって、この容器から除去される。未固定カプチャー・
プローブおよび所望により検出プローブおよび検出可能
な標識モノヌクレオシド三リン酸を完全に除去するため
の１回または数回の洗浄工程の後、測定を行う(直接標
識)か、または酵素基質を添加し、放出された切断生成
物を測定する(酵素標識)。好ましい方法では、ハイブリ
ダイゼーション反応用の容器は該測定にも使用される。
合成されたハイブリッドを検出する。これを行うため
に、一本鎖核酸のカプチャー・プローブおよび所望によ
り検出プローブとのインキュベーション後に試料液を固
定ハイブリッドから分離する。これは、例えば、固定ハ
イブリッドから液体を除去することによって行われ得
る。これは固相の種類に依存する。例えば、容器を使用
する場合、例えば、該液体は、例えばピペッティングに
よって、この容器から除去される。未固定カプチャー・
プローブおよび所望により検出プローブおよび検出可能
な標識モノヌクレオシド三リン酸を完全に除去するため
の１回または数回の洗浄工程の後、測定を行う(直接標
識)か、または酵素基質を添加し、放出された切断生成
物を測定する(酵素標識)。好ましい方法では、ハイブリ
ダイゼーション反応用の容器は該測定にも使用される。
【００５４】前記から、本発明は、核酸分析物が溶解さ
れた状態で調製試料溶液中に存在する工程で始まり、検
出されるべき核酸およびカプチャー・プローブからなる
固定ハイブリッドが存在する工程まで、検出されるべき
核酸を中間分離せずに適用され得ると理解され得る。こ
れにより、かなり取り扱いし易くなる。さらにまた、こ
の方法は、イムノアッセイ(例えば、ＥＰ−Ａ−０９８
５９０を参照)について一般的に知られているような自
動分析器で行うことができるという長所を有する。これ
は免疫学的パラメーターならびに核酸診断の技術分野か
らのパラメーターを同時に処理させる。さらに、本発明
の方法は、非常に厳密であるという長所を有する。特定
の洗浄剤を添加せずに行われる方法と比較して、本発明
の方法における偏差が５％未満であるような同一試料の
種々の測定結果の間で高い偏差がみられる。しかし、こ
れは核酸の確実な定量的自動検出に関する予め必要な条
件である。特に、定量的核酸ハイブリダイゼーション試
験を免疫学的試験用の分析器で行わないようにした自動
分析器を使用すると、試料容器の放置時間が非常に変わ
るという事実があった。
れた状態で調製試料溶液中に存在する工程で始まり、検
出されるべき核酸およびカプチャー・プローブからなる
固定ハイブリッドが存在する工程まで、検出されるべき
核酸を中間分離せずに適用され得ると理解され得る。こ
れにより、かなり取り扱いし易くなる。さらにまた、こ
の方法は、イムノアッセイ(例えば、ＥＰ−Ａ−０９８
５９０を参照)について一般的に知られているような自
動分析器で行うことができるという長所を有する。これ
は免疫学的パラメーターならびに核酸診断の技術分野か
らのパラメーターを同時に処理させる。さらに、本発明
の方法は、非常に厳密であるという長所を有する。特定
の洗浄剤を添加せずに行われる方法と比較して、本発明
の方法における偏差が５％未満であるような同一試料の
種々の測定結果の間で高い偏差がみられる。しかし、こ
れは核酸の確実な定量的自動検出に関する予め必要な条
件である。特に、定量的核酸ハイブリダイゼーション試
験を免疫学的試験用の分析器で行わないようにした自動
分析器を使用すると、試料容器の放置時間が非常に変わ
るという事実があった。
【００５５】本発明の別の課題は、核酸固定化用試薬キ
ットである。該試薬キットは、分離容器中に、固定化さ
れるべき核酸に対して特異的であるカプチャー・プロー
ブならびに水酸化アルカリおよび陰イオン、非イオンお
よび両性イオン洗浄剤からなる群から選択される少なく
とも１種類の洗浄剤を含有する試薬を含有する。また、
該試薬キットは核酸の固定化を促進する成分、例えば核
酸がカプチャー・プローブによって固定化され得るプラ
スチック容器を含有する。
ットである。該試薬キットは、分離容器中に、固定化さ
れるべき核酸に対して特異的であるカプチャー・プロー
ブならびに水酸化アルカリおよび陰イオン、非イオンお
よび両性イオン洗浄剤からなる群から選択される少なく
とも１種類の洗浄剤を含有する試薬を含有する。また、
該試薬キットは核酸の固定化を促進する成分、例えば核
酸がカプチャー・プローブによって固定化され得るプラ
スチック容器を含有する。
【００５６】本発明のさらなる課題は、核酸固定化用試
薬キットの成分および好ましくはカプチャー・プローブ
の配列とは異なる配列で固定化されるべき核酸に対して
特異的である少なくとも１つのさらなる核酸を含有する
核酸検出用試薬キットである。好ましくは、このさらな
る核酸は検出可能な標識を担持し、検出プローブとして
供される。
薬キットの成分および好ましくはカプチャー・プローブ
の配列とは異なる配列で固定化されるべき核酸に対して
特異的である少なくとも１つのさらなる核酸を含有する
核酸検出用試薬キットである。好ましくは、このさらな
る核酸は検出可能な標識を担持し、検出プローブとして
供される。
【００５７】本発明のさらなる課題は、試料溶液中の診
断パラメーターの自動測定用分析システムである。該シ
ステムは、試料ローター中の少なくとも１つの試料貯蔵
容器、試薬ローター上の少なくとも１つの試薬貯蔵容器
からなり、後者は陰イオン、非イオンおよび両性イオン
洗浄剤からなる群から選択される少なくとも１種類の洗
浄剤と一緒にアルカリ条件下の核酸に関する変性溶液を
含有し、少なくとも１つの試薬貯蔵容器は固定化可能ま
たは固定されたパラメーター特異的カプチャー・プロー
ブを含有する。さらに、この分析システムは、プロー
ブ、変性溶液およびカプチャー・プローブを採取しつ
つ、検出されるべき核酸を自動プロセッシングするため
の装置を含有する。
断パラメーターの自動測定用分析システムである。該シ
ステムは、試料ローター中の少なくとも１つの試料貯蔵
容器、試薬ローター上の少なくとも１つの試薬貯蔵容器
からなり、後者は陰イオン、非イオンおよび両性イオン
洗浄剤からなる群から選択される少なくとも１種類の洗
浄剤と一緒にアルカリ条件下の核酸に関する変性溶液を
含有し、少なくとも１つの試薬貯蔵容器は固定化可能ま
たは固定されたパラメーター特異的カプチャー・プロー
ブを含有する。さらに、この分析システムは、プロー
ブ、変性溶液およびカプチャー・プローブを採取しつ
つ、検出されるべき核酸を自動プロセッシングするため
の装置を含有する。
【００５８】本発明のさらなる課題は、核酸の検出方法
におけるグリコシド系洗浄剤の使用である。グリコシド
系洗浄剤は糖残基を含有し、液体の表面張力を低下させ
る化合物であると解される。
におけるグリコシド系洗浄剤の使用である。グリコシド
系洗浄剤は糖残基を含有し、液体の表面張力を低下させ
る化合物であると解される。
【００５９】「図１」は本発明の方法の特に好ましい具体
例の代表的なアルゴリズムを示す。
例の代表的なアルゴリズムを示す。
【００６０】「図２」はアルカリ条件下でＤＮＡの安定性
を示すグラフ(４２０nmでの吸光度)である。このグラフ
から、ＮＰ−４０を使用すると、ＤＮＡの吸光度および
したがってその安定性が６０分後に実験の開始時とほと
んど同一であることが理解され得る。洗浄剤を添加しな
い場合、６０分後のＤＮＡの量は半分よりも多く減少し
た。これを、ＨＢＶ−ＤＮＡの３種類全ての濃度(４
０、８０、２００ｎｇ ＨＢＶ−ＤＮＡ／ミリリットル)
で行う。
を示すグラフ(４２０nmでの吸光度)である。このグラフ
から、ＮＰ−４０を使用すると、ＤＮＡの吸光度および
したがってその安定性が６０分後に実験の開始時とほと
んど同一であることが理解され得る。洗浄剤を添加しな
い場合、６０分後のＤＮＡの量は半分よりも多く減少し
た。これを、ＨＢＶ−ＤＮＡの３種類全ての濃度(４
０、８０、２００ｎｇ ＨＢＶ−ＤＮＡ／ミリリットル)
で行う。
【００６１】以下の実施例は本発明をより詳細に説明す
る。
る。
【００６２】実施例１ ＨＢＶ−ＤＮＡ含有血清の消化（溶解） ＨＢＶ含有血清１０マイクロリットルを０.２Ｎ ＮaＯ
Ｈ １０マイクロリットルと混合し、３７℃で１時間イ
ンキュベートする。次いで、中和溶液(１００mＭＫＣ
l、２０mＭ Ｔris／ＨＣl、３mＭ ＭgＣl2、０.６７Ｎ
ＨＣl)３０マイクロリットルを添加する。この混合物の
１つのアリコートをＰＣＲ増幅に使用する。
Ｈ １０マイクロリットルと混合し、３７℃で１時間イ
ンキュベートする。次いで、中和溶液(１００mＭＫＣ
l、２０mＭ Ｔris／ＨＣl、３mＭ ＭgＣl2、０.６７Ｎ
ＨＣl)３０マイクロリットルを添加する。この混合物の
１つのアリコートをＰＣＲ増幅に使用する。
【００６３】実施例２ ＰＣＲ増幅およびジゴキシゲニンによるＨＢＶ−ＤＮＡ
の標識化 実施例１において消化した血清２０マイクロリットルを
下記「表１」に従ってＰＣＲ増幅で使用する。
の標識化 実施例１において消化した血清２０マイクロリットルを
下記「表１」に従ってＰＣＲ増幅で使用する。
【００６４】
【表１】
【００６５】１０ ｘ ＰＣＲ緩衝液：１００mＭ Ｔris
／ＨＣl、５００mＭ ＫＣl、１５mＭＭgＣl2、１mg／ミ
リリットル ゼラチン、pＨ９.０。 Ｄig−１１−ｄＵＴＰ：ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴ
Ｐ,Ｌi塩(ベーリンガー・マンハイム(Ｂoehringer Ｍan
nheim))。 プライマー１：ＨＢＶ配列２２６９−２２８９のオリゴ
ヌクレオチド。 プライマー２：ＨＢＶ配列２４１９−２４３９のオリゴ
ヌクレオチド、逆。
／ＨＣl、５００mＭ ＫＣl、１５mＭＭgＣl2、１mg／ミ
リリットル ゼラチン、pＨ９.０。 Ｄig−１１−ｄＵＴＰ：ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴ
Ｐ,Ｌi塩(ベーリンガー・マンハイム(Ｂoehringer Ｍan
nheim))。 プライマー１：ＨＢＶ配列２２６９−２２８９のオリゴ
ヌクレオチド。 プライマー２：ＨＢＶ配列２４１９−２４３９のオリゴ
ヌクレオチド、逆。
【００６６】パーキン・エルマー・サーマル・サイクラ
ー(Ｐerkin Ｅlmer Ｔhermal Ｃycler)で、９２℃で３
０秒、５０℃で３０秒および７０℃で１分を３０回繰り
返してＰＣＲバッチを増幅させる。
ー(Ｐerkin Ｅlmer Ｔhermal Ｃycler)で、９２℃で３
０秒、５０℃で３０秒および７０℃で１分を３０回繰り
返してＰＣＲバッチを増幅させる。
【００６７】実施例３ ＰＣＲ増幅およびα−32Ｐ ｄＣＴＰによるＨＢＶ−Ｄ
ＮＡの標識化 概略、実施例２と同様に増幅および標識化を行う。ｄＣ
ＴＰの代わりにα−32Ｐ ｄＣＴＰ(１０μＣi／マイク
ロリットル、１０００nＣi／ナノモル)５マイクロリッ
トルを用いる。ｄＴＴＰの最終濃度は２００μＭであ
り、Ｄig−１１−ｄＵＴＰは使用しない。
ＮＡの標識化 概略、実施例２と同様に増幅および標識化を行う。ｄＣ
ＴＰの代わりにα−32Ｐ ｄＣＴＰ(１０μＣi／マイク
ロリットル、１０００nＣi／ナノモル)５マイクロリッ
トルを用いる。ｄＴＴＰの最終濃度は２００μＭであ
り、Ｄig−１１−ｄＵＴＰは使用しない。
【００６８】実施例４ 変性および増幅ＤＮＡの検出 ポリスチレンまたはポリエチレン容器を使用して、増幅
反応(ＰＣＲ[エイチ・エイ・エールリッチ(Ｈ.Ａ.Ｅhrl
ich)編、１９８９ ＰＣＲ・テクノロジー：プリンシプ
ルズ・アンド・アプリケーションズ・フォー・ＤＮＡ・
アンプリフィケーション(ＰＣＲ technology：Ｐrincip
les and applications for ＤＮＡ amplification)、ス
トックトン・プレス、ニューヨーク]、ＬＣＲ(バイオテ
クニカ(Ｂiotechnica)、ＥＰ−Ａ−０３２０３０８)、
ＲＣＲ(セゲブ・ダイアグノスティクス(Ｓegev Ｄiagno
stics)、[ＷＯ ９０／０１０６９]またはＷＯ ９１／０
３５７３から知られている系))からのジゴキシゲニン標
識ＤＮＡを変性溶液(０.05N ＮaＯＨ、０.９ ＮaＣl、
０.１％ Ｎa−ラウリルサルコシン、pＨ１２.５)で１：
１０に希釈する。放置時間は０〜８時間の間で変化する
ことができる(温度：５℃〜４５℃)。ＥＳ ３００R分析
器(ベーリンガー・マンハイム(Ｂoehringer Ｍannhei
m))上で、この混合物１００マイクロリットルを、ＴＢ
ＳＡストレプトアビジン被覆チューブ(ＥＰ−Ａ−０３
４４５７８)中で、ビオチニル化(ＥＰ−Ａ−００６３８
７９)カプチャー・プローブを含有するハイブリダイゼ
ーション緩衝液４００マイクロリットルと３７℃で３時
間インキュベートする。該ハイブリダイゼーション緩衝
液は、６２.５mＭリン酸Ｎa緩衝液、０.９４Ｍ ＮaＣ
l、９４mＭ クエン酸Ｎa、０.１２５％Ｎa−ラウリルサ
ルコシン、０.６％ウシ血清アルブミン、pＨ６.５を含
有する。ビオチニル化カプチャー・プローブはハイブリ
ダイゼーション緩衝液中に２５〜１５０ng／ミリリット
ルの範囲の濃度で存在する。実施例２に記載の増幅ＨＢ
Ｖ−ＤＮＡに関して、５０ng／ミリリットルのＨＢＶ
adw−配列２３３２−２３５１のビオチニル化カプチャ
ー・プローブを使用する。
反応(ＰＣＲ[エイチ・エイ・エールリッチ(Ｈ.Ａ.Ｅhrl
ich)編、１９８９ ＰＣＲ・テクノロジー：プリンシプ
ルズ・アンド・アプリケーションズ・フォー・ＤＮＡ・
アンプリフィケーション(ＰＣＲ technology：Ｐrincip
les and applications for ＤＮＡ amplification)、ス
トックトン・プレス、ニューヨーク]、ＬＣＲ(バイオテ
クニカ(Ｂiotechnica)、ＥＰ−Ａ−０３２０３０８)、
ＲＣＲ(セゲブ・ダイアグノスティクス(Ｓegev Ｄiagno
stics)、[ＷＯ ９０／０１０６９]またはＷＯ ９１／０
３５７３から知られている系))からのジゴキシゲニン標
識ＤＮＡを変性溶液(０.05N ＮaＯＨ、０.９ ＮaＣl、
０.１％ Ｎa−ラウリルサルコシン、pＨ１２.５)で１：
１０に希釈する。放置時間は０〜８時間の間で変化する
ことができる(温度：５℃〜４５℃)。ＥＳ ３００R分析
器(ベーリンガー・マンハイム(Ｂoehringer Ｍannhei
m))上で、この混合物１００マイクロリットルを、ＴＢ
ＳＡストレプトアビジン被覆チューブ(ＥＰ−Ａ−０３
４４５７８)中で、ビオチニル化(ＥＰ−Ａ−００６３８
７９)カプチャー・プローブを含有するハイブリダイゼ
ーション緩衝液４００マイクロリットルと３７℃で３時
間インキュベートする。該ハイブリダイゼーション緩衝
液は、６２.５mＭリン酸Ｎa緩衝液、０.９４Ｍ ＮaＣ
l、９４mＭ クエン酸Ｎa、０.１２５％Ｎa−ラウリルサ
ルコシン、０.６％ウシ血清アルブミン、pＨ６.５を含
有する。ビオチニル化カプチャー・プローブはハイブリ
ダイゼーション緩衝液中に２５〜１５０ng／ミリリット
ルの範囲の濃度で存在する。実施例２に記載の増幅ＨＢ
Ｖ−ＤＮＡに関して、５０ng／ミリリットルのＨＢＶ
adw−配列２３３２−２３５１のビオチニル化カプチャ
ー・プローブを使用する。
【００６９】インキュベーションの後に、エンザイムン
(ＥnzymunR)洗浄溶液で３回洗浄する。次いで、コンジ
ュゲート溶液(１００mＭ Ｔris／ＨＣl、pＨ７.５、０.
９％ＮaＣl、０.５％ウシ血清アルブミン中５０mＵ／ミ
リリットル抗ジゴキシゲニン−ＰＯＤ−コンジュゲート
(ベーリンガー・マンハイム))５００マイクロリットル
をピペットで添加する。３７℃で３０分間のインキュベ
ーションの後、該混合物をエンザイムン(ＥnzymunR)洗
浄溶液で再度洗浄し、次いで、基質(ＡＢＴＳR、ベーリ
ンガー・マンハイム)でさらに３０分間インキュベーシ
ョンを続ける。次いで、吸光度を４２２nmで測定する。
(ＥnzymunR)洗浄溶液で３回洗浄する。次いで、コンジ
ュゲート溶液(１００mＭ Ｔris／ＨＣl、pＨ７.５、０.
９％ＮaＣl、０.５％ウシ血清アルブミン中５０mＵ／ミ
リリットル抗ジゴキシゲニン−ＰＯＤ−コンジュゲート
(ベーリンガー・マンハイム))５００マイクロリットル
をピペットで添加する。３７℃で３０分間のインキュベ
ーションの後、該混合物をエンザイムン(ＥnzymunR)洗
浄溶液で再度洗浄し、次いで、基質(ＡＢＴＳR、ベーリ
ンガー・マンハイム)でさらに３０分間インキュベーシ
ョンを続ける。次いで、吸光度を４２２nmで測定する。
【００７０】実施例５ 変性および非増幅ＤＮＡの検出 ０.１Ｎ ＮaＯＨ、０.９ ＮaＣl、０.１％ＮＰ−４０、
pＨ１３を使用してポリスチレン容器中で、クローン化
したＨＢＶ−ＤＮＡ(ｐＵＣＢＭ２０中でクローン化し
たＨＢＶadw−配列のヌクレオチド２９−２６０６)１０
〜２００ngを変性させる。比較するために、同一である
がＮＰ−４０を有しない変性溶液で再度該アッセイを調
製する。６０分間のインキュベーションの後、変性ＤＮ
Ａを、ハイブリダイゼーション緩衝液５００マイクロリ
ットルと一緒に３時間インキュベートする。次いで、エ
ンザイムン(ＥnzymunR)洗浄溶液で３回洗浄し、コンジ
ュゲート溶液(実施例４を参照)をピペットで添加し、３
７℃で６０分間インキュベートし、再度洗浄し、ＡＢＴ
ＳRとの基質反応(６０分)の後に、吸光度を４２２nmで
測定する。結果を「図２」に示す。
pＨ１３を使用してポリスチレン容器中で、クローン化
したＨＢＶ−ＤＮＡ(ｐＵＣＢＭ２０中でクローン化し
たＨＢＶadw−配列のヌクレオチド２９−２６０６)１０
〜２００ngを変性させる。比較するために、同一である
がＮＰ−４０を有しない変性溶液で再度該アッセイを調
製する。６０分間のインキュベーションの後、変性ＤＮ
Ａを、ハイブリダイゼーション緩衝液５００マイクロリ
ットルと一緒に３時間インキュベートする。次いで、エ
ンザイムン(ＥnzymunR)洗浄溶液で３回洗浄し、コンジ
ュゲート溶液(実施例４を参照)をピペットで添加し、３
７℃で６０分間インキュベートし、再度洗浄し、ＡＢＴ
ＳRとの基質反応(６０分)の後に、吸光度を４２２nmで
測定する。結果を「図２」に示す。
【００７１】ハイブリダイゼーション溶液：６２.５mＭ
リン酸ナトリウム緩衝液、０.９ＭＮaＣl、９０mＭ ク
エン酸Ｎa、０.１％ウシ血清アルブミン、０.１２５％
Ｎa−ラウリルサルコシン、pＨ６.５中２００ng／ミリ
リットルのビオチニル化オリゴヌクレオチド・プローブ
(ＨＢＶ−配列２４５６−２４１７)およびジゴキシゲニ
ン標識オリゴヌクレオチド・プローブ(ＨＢＶ−配列２
８７−２４６)を有する溶液。
リン酸ナトリウム緩衝液、０.９ＭＮaＣl、９０mＭ ク
エン酸Ｎa、０.１％ウシ血清アルブミン、０.１２５％
Ｎa−ラウリルサルコシン、pＨ６.５中２００ng／ミリ
リットルのビオチニル化オリゴヌクレオチド・プローブ
(ＨＢＶ−配列２４５６−２４１７)およびジゴキシゲニ
ン標識オリゴヌクレオチド・プローブ(ＨＢＶ−配列２
８７−２４６)を有する溶液。
【００７２】ジゴキシゲニンによる標識化はターミナル
・トランスフェラーゼで行った(カー・ミューレガー
(Ｋ.Ｍuehlegger)、エー・フーバー(Ｅ.Ｈuber)、ハー
・フォン・デル・エルツ(Ｈ.von der Ｅltz)、アール・
リューガー(Ｒ.Ｒueger)およびツェー・ケスラー(Ｃ.Ｋ
essler)、１９９０、バイオロジカル・ケミストリー・
ホーペ−セイラー(Ｂiological Ｃhemistry Ｈoppe−Ｓ
eyler)、３７１、９５３−６５)。
・トランスフェラーゼで行った(カー・ミューレガー
(Ｋ.Ｍuehlegger)、エー・フーバー(Ｅ.Ｈuber)、ハー
・フォン・デル・エルツ(Ｈ.von der Ｅltz)、アール・
リューガー(Ｒ.Ｒueger)およびツェー・ケスラー(Ｃ.Ｋ
essler)、１９９０、バイオロジカル・ケミストリー・
ホーペ−セイラー(Ｂiological Ｃhemistry Ｈoppe−Ｓ
eyler)、３７１、９５３−６５)。
【００７３】実施例６ アルカリ条件下でのＤＮＡ安定化のための種々の洗浄剤
の比較 洗浄剤の濃度は０.１％であった。使用した容器はポリ
スチレン製であった。他の全ての反応条件は実施例１〜
４に挙げられたものと同一である。
の比較 洗浄剤の濃度は０.１％であった。使用した容器はポリ
スチレン製であった。他の全ての反応条件は実施例１〜
４に挙げられたものと同一である。
【００７４】
【表２】
【００７５】実施例７ 種々のプラスチック容器中での種々の安定化試薬の効果
【００７６】
【表３】
【図１】 本発明の方法の特に好ましい具体例の代表的
なアルゴリズム。
なアルゴリズム。
【図２】 アルカリ条件下でＤＮＡの安定性を示す４２
０nmでの吸光度のグラフ。
０nmでの吸光度のグラフ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 コルネリア・クルーゼ−ミューラー ドイツ連邦共和国デー−8132トゥートツィ ング、ベーリンガーヴェーク10番 (72)発明者 シュテファニー・ケラー ドイツ連邦共和国デー−8130シュタルンベ ルク、ヴェルムシュトラーセ22アー番
Claims (8)
- 【請求項１】 アルカリ条件下で一本鎖核酸に変換し、
固定化可能なカプチャー・プローブまたは固定カプチャ
ー・プローブを添加し、該カプチャー・プローブを介す
る核酸の固定化のもとに核酸とカプチャー・プローブを
ハイブリダイズし、合成された固定ハイブリッドの量を
検出することからなり、アルカリ条件下での処理時に陰
イオン、非イオンおよび両性イオン洗浄剤からなる群か
ら選択される少なくとも１種類の洗浄剤が存在すること
を特徴とする核酸の検出方法。 - 【請求項２】 陰イオン、非イオンおよび両性イオン洗
浄剤からなる群から選択される少なくとも１種類の洗浄
剤が一本鎖への変換から固定化の間じゅうの全ての処理
工程の間に存在する請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 洗浄剤の濃度が０.０１〜１０重量％の
範囲である請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 アルカリ条件下での処理がプラスチック
容器中で行われる請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 固定ハイブリッドの量の検出が核酸分析
物の一本鎖への変換からを開始され、不規則な間隔で検
出のためにアルカリ試料液を採取する自動分析器で行わ
れる請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項６】 分離容器中に、固定化核酸に対して特異
的なカプチャー・プローブ、ならびに水酸化アルカリお
よび陰イオン、非イオンおよび両性イオン洗浄剤からな
る群から選択される少なくとも１種類の洗浄剤を含有す
る試薬を含有する核酸の固定化用試薬キット。 - 【請求項７】 試料ローター中の少なくとも１つの試料
貯蔵容器、アルカリ条件下で陰イオン、非イオンおよび
両性イオン洗浄剤からなる群から選択される少なくとも
１種類の洗浄剤を含有する核酸変性用溶液を含有する試
薬ローター上の少なくとも１つの試薬貯蔵容器、固定化
可能または固定されたパラメーター特異的カプチャー・
プローブを含有する少なくとも１つの試薬貯蔵容器から
なる試料溶液中の診断パラメーターの自動測定用分析シ
ステム。 - 【請求項８】 核酸検出用グリコシド系洗浄剤。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4212555A DE4212555A1 (de) | 1992-04-15 | 1992-04-15 | Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren |
| DE4212555-3 | 1992-04-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0622797A true JPH0622797A (ja) | 1994-02-01 |
| JP2638421B2 JP2638421B2 (ja) | 1997-08-06 |
Family
ID=6456845
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5088529A Expired - Lifetime JP2638421B2 (ja) | 1992-04-15 | 1993-04-15 | 核酸の検出方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6066455A (ja) |
| EP (1) | EP0566050B2 (ja) |
| JP (1) | JP2638421B2 (ja) |
| AT (1) | ATE157707T1 (ja) |
| AU (1) | AU654771B2 (ja) |
| DE (2) | DE4212555A1 (ja) |
| ES (1) | ES2109387T5 (ja) |
| FI (1) | FI931677A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002525123A (ja) * | 1998-09-30 | 2002-08-13 | パッカード バイオサイエンス ベスローテン フェンノートシャップ | Ａｔｐを検出する方法 |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4344742A1 (de) * | 1993-06-09 | 1994-12-15 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäuren |
| US7569342B2 (en) | 1997-12-10 | 2009-08-04 | Sierra Molecular Corp. | Removal of molecular assay interferences |
| AU2006214141B2 (en) | 2005-02-18 | 2010-07-15 | Gen-Probe Incorporated | Sample preparation method incorporating an alkaline shock |
| CA2842232C (en) | 2005-03-10 | 2015-01-27 | Gen-Probe Incorporated | Systems and methods to perform assays for detecting or quantifying analytes within samples |
| EP2247753B1 (en) * | 2008-02-01 | 2014-06-25 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Urine transport medium |
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