JP2006020511A - 核酸の検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 煩雑な操作を必要としないので、迅速で容易に再現性の良い結果が得られる、試料中の核酸配列を明確にまた簡便に検出できる方法を提供する。
【解決手段】 特定の核酸配列を含む試料溶液に核酸配列増幅用オリゴヌクレオチドを用いて増幅反応と同時およびまたは増幅反応後、該核酸配列に特異的に結合するリガンドが結合されたオリゴヌクレオチドを接触させ、特定の核酸配列と結合したリガンドを検出することによって試料溶液中に含まれる核酸配列を検出する方法において、増幅された核酸配を特異的に認識するオリゴヌクレオチドが結合された通液性フィルターおよび上記リガンドに結合する、標識された生理活性物質を用いることを特徴とする核酸配列の検出方法。

Description

本発明は、固相担体として通液性フィルターを用いた核酸配列の検出方法に関するものである。

生体試料中に存在する特定の核酸分子を検出する技術は、特定臓器で発現・機能するタンパク質の核酸分子レベルでの解析、神経、脳あるいは免疫系での情報伝達におけるタンパク質の発現制御の研究等において重要であるのみならず、遺伝的疾患の変異遺伝子の検出、癌の診断、ウイルス関連遺伝子の検出等遺伝子診断においても極めて重要である。

しかしながら、従来の技術は、煩雑で且つ多くの工程を含み、熟練を要するために、操作によってはかなりの時間が必要とされることが多い。

また、遺伝子診断などは確定診断として用いられるため誤りが許されず、さらに迅速性も要求されるために、迅速性を保ちながら高い精度有していなければならないが、従来の技術は、かかる要請を十分に満足するものとはいえない。

試料中に存在する特定の核酸分子を検出する代表的な技術としては、ハイブリダイゼーション法がある。核酸のハイブリダイゼーション分析は、多種類の核酸の中から非常に少数の標的核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）をプローブで検出する技術であるが、ハイブリダイゼーション法では、高感度なレポーター（酵素、蛍光色素、ラジオアイソトープ等）を用いても、低コピー数（１〜１０００個）の標的核酸分子を検出するのは困難である。さらに、ハイブリダイゼーション法には、非特異反応という大きな問題点が存するため、特定の核酸分子を正確に検出する為には担体のブロッキング、非特異シグナルの除去等の操作が不可欠であり、多大な労力が必要となる。

また、過去においてガラス繊維で構成されたフィルターを用いて抗原−抗体反応などの生物学的特異反応を検出する試みがなされている（たとえば、特許文献１参照）が、特定の核酸を検出する方法に関しての具体的開示はされていなかった。

特開平４−３１８４６２号公報

本発明は、かかる事情に鑑みてなされたものであり、従来の核酸検出技術に比べて、操作が簡便であるとともに特異性が向上した核酸検出法を提供することを特徴とする。

本発明者らは、鋭意研究の結果、上記の従来法において、必要とされる洗浄操作を簡便化する方法として、通液性フィルターを用いることによって、上方より試薬を順次滴下する操作だけで、特定核酸配列を検出する可能となることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
［１］特定の核酸配列を含む試料溶液に核酸配列増幅用オリゴヌクレオチドを用いて増幅反応と同時およびまたは増幅反応後、該核酸配列に特異的に結合するリガンドが結合されたオリゴヌクレオチドを接触させ、特定の核酸配列と結合したリガンドを検出することによって試料溶液中に含まれる核酸配列を検出する方法において、増幅された核酸配を特異的に認識するオリゴヌクレオチドが結合された通液性フィルターおよび上記リガンドに結合する、標識された生理活性物質を用いることを特徴とする核酸配列の検出方法。

［２］特定の核酸配列を含む試料溶液に核酸配列増幅用オリゴヌクレオチドを用いて増幅反応と同時およびまたは増幅反応後、該核酸配列に特異的に結合するリガンドが結合されたオリゴヌクレオチドを接触させ、特定の核酸配列と結合したリガンドを検出することによって試料溶液中に含まれる核酸配列を検出する方法において、増幅された核酸配列を特異的に認識するオリゴヌクレオチドが結合された通液性フィルターに増幅された核酸断片を結合させる工程；該通液性フィルターの表面に、上記リガンドに結合する、標識された生理活性物質の溶液を滴下して、この標識を持つ生理活性物質を、リガンドに結合させる工程；必要により通液性フィルター を洗浄することにより未結合の標識生理活性物質を除去する工程；そして通液性フィルターに結合した標識を測定する工程からなることを特徴とする、核酸配列の検出方法 。

［３］特定の核酸配列を含む試料溶液に核酸配列増幅用オリゴヌクレオチドを用いて増幅反応と同時およびまたは増幅反応後、該核酸配列を特異的に認識するリガンドが結合したオリゴヌクレオチドを接触させ、特定の核酸配列と結合したリガンドを検出することによって試料溶液中に含まれる核酸配列を検出する方法において、上記増幅された核酸断片と該核酸配列を特異的に認識するリガンドが結合したオリゴヌクレオチドとの複合体にリガンドに結合する標識された生理活性物質の溶液を混合後、増幅された核酸配列を特異的に認識するオリゴヌクレオチドが結合された通液性フィルターに滴下し、増幅された核酸断片を結合させる工程；必要により通液性フィルター を洗浄することにより未結合の標識生理活性物質を除去する工程；そして通液性フィルターに結合した標識を測定する工程からなることを特徴とする、核酸配列の検出方法 。

［４］ 該特定核酸配列増幅用オリゴヌクレオチドに結合されているリガンドが抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵素よりなる群から選ばれたいずれかである核酸配列の検出方法。

［５］増幅反応がＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＡ、ＴＭＡ、ＬＡＭＰおよびＩＣＡＮよりなる群から選ばれたいずれかの方法であることを特徴とする核酸配列の検出方法。

［６］リガンドに特異的に結合する生理活性物質が抗体、オリゴヌクレオチド、レセプター、核酸特異的結合物質、アビジンよりなる群から選ばれたいずれかである核酸配列の検出方法

［７］生理活性物質の標識が、磁性体、電子伝達体、蛍光物質、発光団および酵素よりなる群から選ばれたいずれかである核酸配列の検出方法。

［８］通液性フィルターとして、繊維質通液性フィルターを用いることを特徴とする核酸配列の検出方法

［９］少なくとも核酸増幅用のオリゴヌクレオチド、リガンドが結合した核酸配列特異的に認識するオリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ、増幅した核酸配列と結合するオリゴヌクレオチドが結合した通液性フィルター、標識されたリガンドと結合する生理活性物質を含む特定核酸検出キット。

［１０］通液性フィルターとオリゴヌクレオチドがスペーサを介して結合している繊維質通液性フィルター を用いることを特徴とする核酸配列の検出方法 。

本発明により、試料中の核酸配列を明確にまた簡便に検出できる方法が提供される。本発明の方法では、これまでの方法のように煩雑な操作を必要としないので、迅速で容易に再現性の良い結果が得られる。

以下、本発明を詳細に説明する。試料中に含まれる特定の核酸配列を含む染色体又はその断片は、目的の遺伝子の情報を担う標的核酸であれば、特に制限されない。該標的核酸の例としては、ウイルスや病原体由来の遺伝子、Ａｌｕ配列、蛋白質をコードする遺伝子のエキソンやイントロン、プロモーターなどが例示できる。

本発明におけるリガンドが結合した核酸特異的オリゴヌクレオチドとは核酸を特異的に認識する配列であれば何でも良く、９〜４０ｍｅｒのものを用いることができる。また標的核酸配列と全ての塩基において相補的な配列でなくてもよい。

核酸を複製する反応の場合、一本鎖に変性した標的核酸にプライマー、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）とＤＮＡポリメラーゼを作用させることで、標的核酸を鋳型としてプライマー伸長反応が起こり核酸配列の相補鎖が合成される。

本発明において、用いられるリガンド結合核酸特異的オリゴヌクレオチドは核酸が増幅される反応中に存在していても、増幅後に添加されても良い。

核酸配列増幅用オリゴヌクレオチドによって増幅された核酸断片とリガンドが結合した標的核酸を特異的に認識するオリゴヌクレオチドとの反応後、標的核酸を特異的に認識するオリゴヌクレオチドの結合した通液性フィルター上に添加する。通液性フィルターに結合したオリゴヌクレオチドとリガンドの結合したオリゴヌクレオチドは、標的核酸に結合する部位が異なる。さらに標識されたリガンド結合生理活性物質、必要により洗浄液を随時フィルター上に添加し、フィルター上に結合した標識体を測定することによって核酸配列の検出が可能となる。また、別の実施態様として、核酸配列増幅用オリゴヌクレオチドによって増幅された核酸断片とリガンドが結合した標的核酸を特異的に認識するオリゴヌクレオチドとの反応後、増幅された核酸断片と該核酸配列を特異的に認識するリガンドが結合したオリゴヌクレオチドとの複合体にリガンドに結合する標識された生理活性物質の溶液を混合後、標的核酸を特異的に認識するオリゴヌクレオチドの結合した通液性フィルター上に添加する。通液性フィルターに結合したオリゴヌクレオチドとリガンドの結合したオリゴヌクレオチドは、標的核酸に結合する部位が異なる。さらに、必要により洗浄液をフィルター上に添加し、フィルター上に結合した標識体を測定することによっても核酸配列の検出が可能となる。

本発明においての増幅方法は、基本的には、従来の方法を用いて行うことができ、通常、一本鎖に変性させた特定の塩基多型部位を含む染色体又はその断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及びＤＮＡポリメラーゼ及び１組のプライマーを作用させることで、標的核酸を鋳型として増幅される。

核酸増幅方法としては、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence-basedamplification method；Nature 第３５０巻、第９１頁（１９９１年））、ＬＣＲ（国際公開８９／１２６９６号公報、特開平２−２９３４号公報）、ＳＤＡ（Strand Displacement Amplification：Nucleic acid research 第２０巻、第１６９１頁（１９９２年））、ＲＣＡ（国際公開９０／１０６９号公報）、ＴＭＡ（Transcription mediated amplification method；J.Clin.Microbiol. 第３１巻、第３２７０頁（１９９３年））、ＬＡＭＰ（loop-mediated isothermal amplification method：J Clin Microbiol. 第４２巻：第１，９５６頁（２００４年））、ＩＣＡＮ（isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids：Kekkaku. 第７８巻、第５３３頁（２００３年））などが挙げられる。

なかでもＰＣＲ法は、試料核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のプライマー及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより、上記一対のプライマーで挟まれる試料核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である。すなわち、変性工程で試料の核酸を変性し、続くアニーリング工程において各プライマーと、それぞれに相補的な一本鎖試料核酸上の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、各プライマーを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各一本鎖試料核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ、二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上上記一対のプライマーで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２^ｎ倍に増幅される。増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在するので、電気泳動等の方法により容易に検出できる。よって、遺伝子増幅法を用いれば、従来では検出不可能であった、極めて微量（１分子でも可）の試料核酸をも検出することが可能であり、最近非常に広く用いられている技術である。

標識
本発明において用いられる標識としては磁性体、電子伝達体、酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質および発光団などがある。磁性体としては、酸化鉄、二酸化クロム、コバルト、フェライトなどが挙げられる。電子伝達体としては、フェロセン、ＰＱＱ、レドックス化合物などが挙げられる。酵素としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、ＦＩＴＣ，６−ＦＡＭ，ＨＥＸ，ＴＥＴ，ＴＡＭＲＡ，テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５などが挙げられる。ハプテンとしては、ビオチン、ジゴキシゲニンなどが挙げられる。放射性物質としては、^３２Ｐ、^３５Ｓなどが挙げられる。発光団としては、ルテニウム、エクオリンなどが挙げられる。該標識は、核酸検出反応に影響を与えることがなければなにを用いても良い。また反応に影響がなければオリゴヌクレオチドのどの位置に結合させてもよい。好ましくは、３’末端、５’末端部位である。

キット
本発明において、キットとしては、少なくとも核酸増幅用のオリゴヌクレオチド、リガンドが結合した核酸配列特異的に認識するオリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ、増幅した核酸配列と結合するオリゴヌクレオチドが結合した通液性フィルター、標識されたリガンドと結合する生理活性物質を含む特定核酸検出キットを含むものである。 なお、本発明におけるオリゴヌクレオチドおよびプライマーの長さとしては、９〜３５塩基、好ましくは、１１〜３０塩基である。

このように、本発明の方法では、特定核酸配列増幅用オリゴヌクレオチドによって増幅された核酸断片とリガンドが結合した核酸特異的結合体との反応後、増幅された核酸を特異的に認識するオリゴヌクレオチドの結合した通液性フィルター上に添加する。通液性フィルター上に添加することにより、余分な液はフィルターを通して下に落ち、被検出物はフィルター上およびフィルター上部の孔部分に結合され、検出感度も向上される。

さらに標識されたリガンド結合生理活性物質、続いて好ましくは洗浄液を随時フィルター上に添加してフィルターに補足されなかった物質を除去した後、フィルター上に結合した標識体を測定することによって核酸配列の検出が可能となる。あるいは、核酸配列増幅用オリゴヌクレオチドによって増幅された核酸断片とリガンドが結合した標的核酸を特異的に認識するオリゴヌクレオチドとの反応後、増幅された核酸断片と該核酸配列を特異的に認識するリガンドが結合したオリゴヌクレオチドとの複合体にリガンドに結合する標識された生理活性物質の溶液を混合後、標的核酸を特異的に認識するオリゴヌクレオチドの結合した通液性フィルター上に添加する。通液性フィルターに結合したオリゴヌクレオチドとリガンドの結合したオリゴヌクレオチドは、標的核酸に結合する部位が異なる。さらに、続いて好ましくは洗浄液をフィルター上に添加し、フィルター上に結合した標識体を測定することによっても核酸配列の検出が可能である。したがって、本発明の方法によれば、従来法のように煩雑な検出操作が不要で、試料核酸中の標的核酸を明確に検出することができる。

通液性フィルターとしては、液をフィルターに滴下した際に、液がフィルター表層を通過していくものであればどのような形態でも良く、織布、不織布、多孔質体が挙げられる。フィルターの素材としては、ガラス、セラミック、金属、プラスチックなどが挙げられ、プラスチックとしては、ポリアミド、ポリアミドイミド、ポリアリレート、ポリイミド、ポリエーテルイミド、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエチレン、ポリエチレンオキサイド、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリサルホン、ポリエーテルサルホン、ポリパラメチルスチレン、ポリアリルアミン、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルブチラール、ポリビニルホルマール、ポリフェニレンエーテル、ポリフェニレンサルファイド、ポリブチレンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、アクリル樹脂、メタクリル樹脂、エポキシ樹脂、キシレン樹脂、グアナミン樹脂、ジアリルフタレート樹脂、ビニルエステル樹脂、フェノール樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、フラン樹脂、ポリイミド、ポリ−ｐ−ヒドロキシ安息香酸、ポリウレタン、マレイン酸樹脂、メラミン樹脂およびユリア樹脂樹脂などが例示される。
具体的には、ガラス繊維織布、ガラス繊維不織布、多孔質ガラス、多孔質セラミック（セラミック焼結体）、金属焼結体、独立気泡型の発泡樹脂、各種繊維の織布、不織布が挙げられる。
これらの中でも好ましくはガラス繊維フィルターであり、繊維の平均直径が０．３〜２．０μｍのものが好ましく、平均繊維長は０．５〜２ｍｍのものが好ましい。好ましいガラス繊維フィルターの具体例は特開平４−３１８４６２号公報に記載されており、これをそのまま用いることができる。また、用いられうるプラスチック製のフィルターの例としては特開２０００−６５８３２号公報に詳細が記載されており、この技術をそのまま用いることができる。

なお、フィルターは容器に収納して使用することができる。容器は、液体不透過性の材料で構成されており、試薬を適用する範囲を限定するための開口部を有している。多孔性担体は開口部の下部に設置される。そしてフィルターの下部に、フィルターを通過した試薬を吸収する吸収層が設けられている。必要に応じて、多孔性担体と吸収層の間に逆流防止層を設け、吸収層に収納された試薬が多孔性担体に逆流するのを防ぐ場合もある。液体不透過性の材料としては、液体を透過させない物質であればよく、例えばポリエチレン、ポリスチレン、ＡＢＳ樹脂、塩化ビニル樹脂、ポリアミド樹脂、ポリプロピレン、ポリカーボネート等の樹脂が液体不透過性、成形の容易さ等の点で好ましい。吸収層としては、液体を吸収し得るものであれば特に限定されないが、例えば液体の吸収性が高いセルロース、またはセルロース誘導体を主成分とする紙の重層物などが挙げられる。また、上記逆流防止層としては、疎水性の不繊布シート、ウェーブ材などが例示される。なお、この技術は特開２００４−１５６９８５号公報に具体的に記載されている。
また、このようなフィルターを使用することにより、自動検出にも容易に展開が可能である。

以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

実施例１Helicobacter pylori23srRNAの検出
（１）Helicobacter pylori23srRNAを検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１〜４に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ１〜４と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社ＯＰＣカラムにて実施した。もしくはＤＮＡ合成受託会社（（株）日本バイオサービス、（株）サワディー、プロリゴジャパン、シグマジェノシス（株）等）に依頼した。
オリゴ１はセンス鎖であり、オリゴ２がアンチセンス鎖であり組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。オリゴ３はプローブとして使用され、３’末端がビオチンによって標識されている。オリゴ４は通液性フィルター上に固定化され、オリゴ４の５’末端がアミノ基で標識されている。

（２）通液性フィルターへのオリゴの固定
オリゴ４を５０ｍＭホウ酸、１００ｍＭ塩化マグネシウム溶液にて１０ｐＭの濃度に希釈する。
ガラス繊維フィルターへ１００μｌ添加し２５℃にてｏｖｅｒ ｎｉｇｈｔインキュベーション後、２０μＭ ｄＮＴＰｓ溶液を３００μｌ添加し２５℃にて２時間インキュベーションする。乾燥機にて２時間乾燥する。
（３）Helicobacter pylori23srRNA のＰＣＲ法による増幅
ＰＣＲ法による増幅反応
胃生検材料よりフェノール・クロロフォルム法により抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりHelicobacter pylori23srRNAを検出した。

試薬
以下の試薬を含む２５μｌ溶液を調製した。
ｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ１ ５ｐｍｏｌ、
オリゴ２ ５ｐｍｏｌ、
オリゴ３（３’末端をビオチンにより標識） １５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液 ２．５μｌ、
２ｍＭ ｄＮＴＰ ２．５μｌ、
２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２ ２μｌ、
ｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ １．３Ｕ（東洋紡績製）
抽出ＤＮＡ溶液 １００ｎｇ

増幅条件
９５℃・５分、
９５℃・３０秒、
６７℃・３０秒、
７２℃・３０秒（４０サイクル）
７２℃・２分、
９５℃・３分、
１５℃・１５分。

（４）通液性フィルターを用いた検出
増幅反応液２０μｌをＰＯＤ標識アビジン（ＤＡＫＯ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ製）の溶液３０μｌに加えて、室温にて５分間反応させた。これによって、増幅されたHelicobacter pylori23srRNA断片と結合したビオチン標識オリゴヌクレオチドとＰＯＤ標識アビジンが結合する。この反応液をオリゴ４の結合した通液性フィルターに添加するとフィルター上に増幅されたHelicobacter pylori23srRNAが捕捉される。次に、上部より洗浄液およびＰＯＤ基質液を順次添加後、フィルター表面の発色を目視によって確認した。

実施例２
Cytochrome P450 2D6遺伝子の検出
（１）Cytochrome P450 2D6遺伝子を検出するオリゴヌクレオチドの合成
パーキンエルマー社製ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号５〜８に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ５〜８と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社ＯＰＣカラムにて実施した。もしくはＤＮＡ合成受託会社（（株）日本バイオサービス、（株）サワディー、プロリゴジャパン、シグマジェノシス（株）等）に依頼した。オリゴ５はセンス鎖であり、オリゴ６がアンチセンス鎖であり組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。オリゴ７はプローブとして使用され、オリゴ７の３’末端がビオチンによって標識されている。オリゴ８は通液性フィルター上に固定化され、オリゴ８の５’末端がアミノ基で標識されている。

（２）通液性フィルターへのオリゴの固定
オリゴ８を５０ｍＭホウ酸、１００ｍＭ塩化マグネシウム溶液にて１０ｐＭの濃度に希釈する。
ガラス繊維フィルターへ１００μｌ添加し２５℃にてｏｖｅｒ ｎｉｇｈｔインキュベーション後、２０μＭ ｄＮＴＰｓ溶液を３００μｌ添加し２５℃にて２時間インキュベーションする。乾燥機にて２時間乾燥する

（３）Cytochrome P450 2D6のＰＣＲ法による増幅
ＰＣＲ法による増幅反応
胃生検材料よりフェノール・クロロフォルム法により抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりCytochrome P450 2D6を検出した。

試薬
以下の試薬を含む２５μｌ溶液を調製した。
ｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ５ ５ｐｍｏｌ、
オリゴ６ ５ｐｍｏｌ、
オリゴ７（３’末端をビオチンにより標識） １５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液 ２．５μｌ、
２ｍＭ ｄＮＴＰ ２．５μｌ、
２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２ ２μｌ、
ｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ １．３ Ｕ（東洋紡績製）
抽出ＤＮＡ溶液 １００ｎｇ

増幅条件
９５℃・５分、
９５℃・３０秒、
６０℃・３０秒、
７２℃・３０秒（４０サイクル）
７２℃・２分、
９５℃・３分、
１５℃・１５分。

（３）通液性フィルターを用いた検出
増幅反応液２０μｌをＰＯＤ標識アビジン（ＤＡＫＯ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ製）の溶液３０μｌに加えて、室温にて５分間反応させた。これによって、増幅されたＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ２Ｄ６断片と結合したビオチン標識オリゴヌクレオチドとＰＯＤ標識アビジンが結合する。この反応液をオリゴ８の結合した通液性フィルターに添加するとフィルター上に増幅されたCytochrome P450 2D6が捕捉される。次に、上部より洗浄液およびＰＯＤ基質液を順次添加後、フィルター表面の発色を目視によって確認した。

上記のように、増幅された核酸とリガンドが結合したオリゴヌクレオチドとの反応後、標識されたリガンドに結合する生理活性物質と反応後、標的核酸を特異的に認識するオリゴヌクレオチドの結合した通液性フィルター上に添加し、さらに、洗浄液を随時フィルター上に添加し、フィルター上に結合した標識体を測定することによって、容易にかつ迅速に核酸の存在を明確に判定することができた。

上述したように、本発明により、試料中の核酸配列を明確にまた簡便に検出できる方法が提供される。本発明の方法では、これまでの方法のように煩雑な操作を必要としないので、迅速で容易に再現性の良い結果が得られた。

Claims (10)

1. 特定の核酸配列を含む試料溶液に核酸配列増幅用オリゴヌクレオチドを用いて増幅反応と同時およびまたは増幅反応後、該核酸配列に特異的に結合するリガンドが結合されたオリゴヌクレオチドを接触させ、特定の核酸配列と結合したリガンドを検出することによって試料溶液中に含まれる核酸配列を検出する方法において、増幅された核酸配を特異的に認識するオリゴヌクレオチドが結合された通液性フィルターおよび上記リガンドに結合する、標識された生理活性物質を用いることを特徴とする核酸配列の検出方法。
2. 特定の核酸配列を含む試料溶液に核酸配列増幅用オリゴヌクレオチドを用いて増幅反応と同時およびまたは増幅反応後、該核酸配列に特異的に結合するリガンドが結合されたオリゴヌクレオチドを接触させ、特定の核酸配列と結合したリガンドを検出することによって試料溶液中に含まれる核酸配列を検出する方法において、増幅された核酸配列を特異的に認識するオリゴヌクレオチドが結合された通液性フィルターに増幅された核酸断片を結合させる工程；該通液性フィルターの表面に、上記リガンドに結合する、標識された生理活性物質の溶液を滴下して、この標識を持つ生理活性物質を、リガンドに結合させる工程；通液性フィルターに結合した標識を測定する工程からなることを特徴とする、核酸配列の検出方法 。
3. 特定の核酸配列を含む試料溶液に核酸配列増幅用オリゴヌクレオチドを用いて増幅反応と同時およびまたは増幅反応後、該核酸配列を特異的に認識するリガンドが結合したオリゴヌクレオチドを接触させ、特定の核酸配列と結合したリガンドを検出することによって試料溶液中に含まれる核酸配列を検出する方法において、上記増幅された核酸断片と該核酸配列を特異的に認識するリガンドが結合したオリゴヌクレオチドとの複合体にリガンドに結合する、標識された生理活性物質の溶液を混合後、増幅された核酸配列を特異的に認識するオリゴヌクレオチドが結合された通液性フィルターに滴下し、増幅された核酸断片を結合させる工程；通液性フィルターに結合した標識を測定する工程からなることを特徴とする、核酸配列の検出方法 。
4. 該特定核酸配列増幅用オリゴヌクレオチドに結合されているリガンドが抗原、抗体、蛍光物質、発光団および酵素よりなる群から選ばれたいずれかである請求項１〜３に記載の方法。
5. 増幅反応がＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＡ、ＴＭＡ、ＬＡＭＰおよびＩＣＡＮよりなる群から選ばれたいずれかの方法であることを特徴とする請求項１〜３記載の方法。
6. リガンドに特異的に結合する生理活性物質が抗体、オリゴヌクレオチド、レセプター、核酸特異的結合物質、アビジンよりなる群から選ばれたいずれかである請求項１〜３に記載の方法
7. 生理活性物質の標識が、磁性体、電子伝達体、蛍光物質、発光団および酵素よりなる群から選ばれたいずれかである請求項１に記載の方法。
8. 通液性フィルターとして、繊維質通液性フィルターを用いることを特徴とする請求項１に記載の方法
9. 少なくとも核酸増幅用のオリゴヌクレオチド、リガンドが結合した核酸配列特異的に認識するオリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ、増幅した核酸配列と結合するオリゴヌクレオチドが結合した通液性フィルター、標識されたリガンドと結合する生理活性物質を含む特定核酸検出キット。
10. 通液性フィルターとオリゴヌクレオチドがスペーサを介して結合している繊維質通液性フィルター を用いることを特徴とする請求項１乃至９のうちのいずれかの項に記載の方法。