JP2014039552A - マイコバクテリウム・アビウム検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたマイコバクテリウム・アビウムの検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】特定の塩基配列の一部若しくは全部、又は該配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを含有する、M.アビウム検出用プライマー並びにプローブ、該プライマ及び/又はプローブを用いるM.アビウムの検出方法。
【選択図】なし
Description
本発明は上記課題を解決する目的で成されたもので、以下の構成よりなる。
(1)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135及び配列番号136から選択される塩基配列(但し、Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン、Tはチミンを表す。また、任意の位置のTはウラシル(U)と置換されていてもよい。以下同じ。)の一部若しくは全部、又は配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135及び配列番号136から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つマイコバクテリウム・アビウム(Mycobacterium avium)遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
(2)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135及び配列番号136から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135及び配列番号136から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つマイコバクテリウム・アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する、マイコバクテリウム・アビウム検出用プライマー。
(3)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135及び配列番号136から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135及び配列番号136から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つマイコバクテリウム・アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する、マイコバクテリウム・アビウム検出用プローブ。
(4)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135及び配列番号136から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135及び配列番号136から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つマイコバクテリウム・アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマー又は/及びプローブとして用いることを特徴とするマイコバクテリウム・アビウムの検出方法。
(5)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135及び配列番号136から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135及び配列番号136から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つマイコバクテリウム・アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマー又は/及びプローブとして含んでなる、マイコバクテリウム・アビウム検出用試薬キット。
(1)PCR用DNA試料中の初期DNAの濃度が105コピーで、新規候補配列13をターゲットとしてリアルタイムPCRを行った場合。
(2)PCR用DNA試料中の初期DNAの濃度が104コピーで、新規候補配列13をターゲットとしてリアルタイムPCRを行った場合。
(3)PCR用DNA試料中の初期DNAの濃度が103コピーで、新規候補配列13をターゲットとしてリアルタイムPCRを行った場合。
(4)PCR用DNA試料中の初期DNAの濃度が102コピーで、新規候補配列13をターゲットとしてリアルタイムPCRを行った場合。
(5)PCR用DNA試料中の初期DNAの濃度が10コピーで、新規候補配列13をターゲットとしてリアルタイムPCRを行った場合。
(6)PCR用DNA試料中の初期DNAの濃度が0コピーで、新規候補配列13をターゲットとしてリアルタイムPCRを行った場合。
(7)PCR用DNA試料中の初期DNAの濃度が105コピーで、M.アビウムの19キロダルトンタンパク質遺伝子領域をターゲットとしてリアルタイムPCRを行った場合。
(8)PCR用DNA試料中の初期DNAの濃度が104コピーで、M.アビウムの19キロダルトンタンパク質遺伝子領域をターゲットとしてリアルタイムPCRを行った場合。
(9)PCR用DNA試料中の初期DNAの濃度が103コピーで、M.アビウムの19キロダルトンタンパク質遺伝子領域をターゲットとしてリアルタイムPCRを行った場合。
(10)PCR用DNA試料中の初期DNAの濃度が102コピーで、M.アビウムの19キロダルトンタンパク質遺伝子領域をターゲットとしてリアルタイムPCRを行った場合。
(11)PCR用DNA試料中の初期DNAの濃度が10コピーで、M.アビウムの19キロダルトンタンパク質遺伝子領域をターゲットとしてリアルタイムPCRを行った場合。
(12)PCR用DNA試料中の初期DNAの濃度が0コピーで、M.アビウムの19キロダルトンタンパク質遺伝子領域をターゲットとしてリアルタイムPCRを行った場合。
(1)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135及び配列番号136から選択される塩基配列に対する相補配列と約70%以上、好ましくは約80%以上、より好ましくは約90%以上、更に好ましくは約95%以上の相同性を有する塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド、又は
(2)配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135及び配列番号136から選択される塩基配列に対する相補配列中の、連続する10塩基以上、好ましくは15塩基以上、より好ましくは20塩基以上を含有することを特徴とするオリゴヌクレオチド、
等が挙げられる。
まず、M.アビウム由来精製ゲノムDNAを得る。例えば市販のM.アビウム由来ゲノムDNAを入手してもよいし、常法によりM.アビウム菌株からDNAを抽出・精製してもよい。また、業者にM.アビウム菌株からゲノムDNAを抽出・精製を依頼し、それを入手してもよい。
M.アビウムのWhole Genome Shotgun Libraryの作製を行う方法の一例として、Venter et al., Science. 2001 Feb 16;291(5507):1304-1351 に記載のWhole Genome Shotgun法を改変した方法を、以下に説明する。
続いて、下記の方法でマイクロアレイを作製する。
i)標的ゲノムDNAの蛍光色素標識
例えばヘキシルアミノ-UTPを用いた間接標識法等の常法により、例えば上記(1)の方法で得られたM.アビウム由来精製ゲノムDNAを標識物質で標識する。また、対照用ゲノム(例えばM.イントラセルラー等の非結核型抗酸菌、ウシ型結核菌等の結核菌等)DNAを、上記のM.アビウム由来精製ゲノムDNAを標識する標識物質とは異なる標識物質で標識する。
上記(4)i)で得られた乾燥状態の各ゲノム由来DNAの標識産物に対して、0.04M Tris-acetate(pH8.1)、0.1M 酢酸カリウム、0.03M酢酸マグネシウム四水和物の組成の溶液を調製したものを加える。該溶液に乾燥状態のゲノム由来DNAの標識産物を懸濁混和させる。94℃で15 分間程度加熱処理し、100base〜300 base の、各ゲノム由来DNAの標識産物の、断片化生成物を得る(Cy3標識産物、Cy5標識産物)。
次に、M.アビウム由来ゲノムDNAのWhole Genome Shotgun cloneのマイクロアレイに対して、常法によりCy3Cy5標識産物のハイブリダイゼーションを行う。
蛍光読み取りスキャナーを用いて、上記(5)で得られたマイクロアレイ・ハイブリダイゼーション処理したマイクロアレイ上の蛍光強度を測定する。この際、Cy3及びCy5の、2チャンネルでの蛍光強度を測定して、蛍光検出データを得る。蛍光シグナルの数量化を行うには、市販のDNAチップ発現イメージ解析ソフトウェア等を用いればよい。そして、ソフトの操作手順に従って、スポット自動認識、バックグラウンド計算、蛍光強度比の正規化を行えば良い。
配列番号6(003Fw_1):804位〜823位、
配列番号7(003Rv_1):707位〜725位、
配列番号8(003Fw_2):20位〜37位、
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配列番号10(007Fw_1):3位〜21位、
配列番号11(007Rv_1):122位〜139位。
配列番号12(11Fw_1):481位〜500位、
配列番号13(11Rv_1):346位〜366位。
配列番号14(12Fw_1):12位〜32位、
配列番号15(12Rv_1):143位〜161位、
配列番号16(12Fw_4):126位〜145位、
配列番号17(12Rv_4):287位〜308位、
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配列番号47(RE01Fw_03):204位〜221位、
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配列番号59(RE04Fw_03):611位〜630位、
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配列番号99(RE24FW_04):387位〜406位、
配列番号100(RE24Rv_04):537位〜555位。
配列番号137(Mac_06Fw01):88位〜105位、
配列番号138(Mac_06Rv01):223位〜241位、
配列番号139(Mac_06Fw02):156位〜175位、
配列番号140(Mac_06Rv02):312位〜331位、
配列番号141(Mac_06Fw03):460位〜478位、
配列番号142(Mac_06Rv03):604位〜623位、
配列番号143(Mac_06Fw04):604位〜623位、
配列番号144(Mac_06Rv04):743位〜760位、
配列番号145(Mac_10Fw01):94位〜113位、
配列番号146(Mac_10Rv01):228位〜245位、
配列番号147(Mac_10Fw02):280位〜299位、
配列番号148(Mac_10Rv02):453位〜472位、
配列番号149(Mac_11Fw01):71位〜88位、
配列番号150(Mac_11Rv01):228位〜248位、
配列番号151(Mac_11Fw02):477位〜496位、
配列番号152(Mac_11Rv02):596位〜615位、
配列番号153(Mac_11Fw03):536位〜554位、
配列番号154(Mac_11Rv03):617位〜635位、
配列番号155(Mac_11Fw04):558位〜575位、
配列番号156(Mac_11Rv04):671位〜688位、
配列番号157(Mac_11Fw05):299位〜316位、
配列番号158(Mac_11Rv05):391位〜410位、
配列番号159(Mac_12Fw01):271位〜290位、
配列番号160(Mac_12Rv01):416位〜433位、
配列番号161(Mac_12Fw02):603位〜622位、
配列番号162(Mac_12Rv02):747位〜765位、
配列番号163(Mac_12Fw03):58位〜75位、
配列番号164(Mac_12Rv03):198位〜216位、
配列番号165(Mac_13Fw01):108位〜126位、
配列番号166(Mac_13Rv01):288位〜305位、
配列番号167(Mac_13Fw02):321位〜339位、
配列番号168(Mac_13Rv02):453位〜472位、
配列番号169(Mac_13Fw03):576位〜595位、
配列番号170(Mac_13Rv03):720位〜739位、
配列番号171(Mac_15Fw01):233位〜250位、
配列番号172(Mac_15Rv01):326位〜346位、
配列番号173(Mac_15Fw02):442位〜460位、
配列番号174(Mac_15Rv02):527位〜546位、
配列番号175(Mac_16Fw02):848位〜867位、
配列番号176(Mac_16Rv02):952位〜969位、
配列番号177(Mac_16Fw03):135位〜152位、
配列番号178(Mac_16Rv03):222位〜240位、
配列番号179(Mac_16Fw05):544位〜562位、
配列番号180(Mac_16Rv05):669位〜688位、
配列番号181(Mac_16Fw07):703位〜720位、
配列番号182(Mac_16Rv07):792位〜812位、
(A)本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて核酸増幅反応を行い、得られたプライマー伸長産物を検出する方法、
(B)本発明のオリゴヌクレオチドを標識物質で標識したものを標識プローブとして用いる方法、
等が挙げられる。以下に、夫々の方法について説明する。
(A−2)TaqManTMリアルタイムPCR法(TaqManTMプローブ法)、
(A−3)核酸増幅反応を行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行い、その結果に基づいて行う方法、
(A−4)標識プライマーを用いた核酸増幅反応を行い、得られたプライマー伸長産物の標識を測定する方法。
公知のインターカレーターを利用してリアルタイムPCRを行う、通常のインターカレーター法が利用できる。
5'末端を例えばFAM等の蛍光色素(レポーター)で、3'末端を例えばTAMRA等のクエンチャー色素で標識したプローブを用いたリアルタイムPCR法により、目的の微量なDNAを高感度且つ定量的に検出する方法である(例えば米国特許第5,538,848号の記載参照)。
「下記工程を包含することを特徴とする、M.アビウムの検出方法、
(i)配列番号1,配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135及び配列番号136から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135及び配列番号136から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つM.アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマー(本発明のプライマー)として用い、試料中の核酸を鋳型として核酸増幅反応を行う、
(ii)(i)で得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行い、その結果に基づいてM.アビウムの有無を判定する。」
が挙げられる。
(A−3−1)目的とする大きさ(塩基対数)のプライマー伸長産物画分を確認することにより判定する方法、
(A−3−2)標識プローブを用いたハイブリダイゼーションにより検出する方法、
等が挙げられる。
これらの中でも、番号39〜61の方法が、特に好ましい。
(1)M.アビウム由来DNA試料の調製
Mycos Research社(米国)より、高純度に精製されたMycobacterium avium TMC16741株由来のgenomic DNAを入手した。
上記(1)で得られたM.アビウム由来DNA試料24μgを材料として用い、以下の方法(Science, 2001 Feb 16;291(5507):1304-1351, Venter et al.に記載のWhole Genome Shotgun法を改変)で、Whole Genome Shotgun Libraryの作製を行った。
上記(2)で得られた形質転換体のlibrary(M.アビウム由来ゲノムDNAのWhole Genome Shotgun clone Library)を用い、下記の方法でPCRを行って、スライドガラス上に固定するプローブ材料を調製した。
熱変性: 94℃、0.5分
アニーリング:55℃、1分
重合反応: 75℃、0.5分。
i)標的ゲノムDNAの蛍光色素標識
BioPrime DNA labeling system(インビトロジェン社製)を利用し、標的ゲノムDNAの蛍光色素標識を行った。
上記(4) i)で得られた乾燥状態の各ゲノムDNAの標識産物に対して、終濃度が0.04M Tris-acetate(pH8.1)、0.1M 酢酸カリウム、0.03M酢酸マグネシウム四水和物の組成の溶液40μLを調製したものを加え、懸濁混和させた。次いで94℃で15 分間加熱処理し、100base〜300 base の、各ゲノムDNAの標識産物の、断片化生成物を得た。
salmon sperm DNA(10mg/mL) ;0.5μL
formamide ;5μL
Total 40〜50μL
得られたCy3Cy5標識産物混合溶液を95℃で5 分インキュベートし、ハイブリダイゼーションまで70℃に保っておいた。
上記(3)の工程で得られた、M.アビウム由来ゲノムDNAのWhole Genome Shotgun clone Libraryのマイクロアレイ上に、上記(4)ii)で調製したCy3Cy5標識産物混合溶液を全てのせ、気泡が入らないようにカバーガラスをかぶせた。これをハイブリカセットにセットし、タッパーに蒸留水で湿らせたキムタオルをひいたものの上にのせて密閉し、遮光下に65℃で8 時間以上反応させてハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイをカバーグラスごと2×SSC-0.1%SDS 溶液に室温で浸し、溶液中でマイクロアレイを静かに揺らしてカバーグラスをはずした。次いで1×SSC、0.03%SDS溶液(60℃)で10 分間洗浄、 0.2×SSC 溶液(42℃)で10 分間洗浄、0.05×SSC溶液(室温)で10 分間洗浄した後、新しい乾いたラックにマイクロアレイをすばやく移し、すぐに800prm で5 分間遠心を行って乾燥させた。
蛍光読み取りスキャナー GenePix 4000B(Axon Instruments Inc.製)を用いて、上記(5)で得られた、マイクロアレイ・ハイブリダイゼーション処理したマイクロアレイ上の蛍光強度を測定した。この際、Cy3標識産物とCy5標識産物の競合ハイブリダイゼーションの結果を解析するため、2チャンネル、すなわち2ch(Cy3、Cy5)での蛍光を検出した。
次に、上記(6)で選択された候補24クローンについて、下記の方法で塩基配列決定を行った。
M13 Primer M1 ;1μL(5pmol)
premix ;8μL
上記の混合物に、総volume=20μLとなるように脱イオン化滅菌水を加え、MJ Research社のDNAサーマルサイクラー(DNA Engine PTC200)を使用して、下記の反応条件で30サイクルのPCRを行った。
96℃ 2 min → (96℃ 10sec→50℃ 5sec→60℃ 4min)×25 →4℃
(1)本発明のプライマーの合成
まず、上記した実施例1で決定された候補の24クローンのうち、候補クローン13のシークエンス(塩基配列)の解析結果に基づき、その候補配列13から、プライマーデザイン用のWebツールPrimer3(Whitehead Institute for Biomedical Research.)を用いてPCRに用いるためのプライマー配列、すなわち「5’−AAGGCTCATGGCTACCAAGTC−3’」(配列番号14。以下、12Fw_1と呼ぶ)、及び「5’−TGGCCGAGTTCGTGATTCT−3’」(配列番号15。以下、12Rv_1と呼ぶ)を設計した。
以下に示す各細菌のDNA試料を、それぞれ下記の方法で調製した。
b:Mycobacterium tuberculosis(マイコバクテリウム・ツベルクローシス、ヒト型結核菌)(TMC102[H37Rv])
c:Mycobacterium kansasii(M.カンサシ)(ATCC12478)
d:Mycobacterium marinum(マイコバクテリウム・マリナム)(ATCC927)
e:Mycobacterium simiae(マイコバクテリウム・シミアエ)(ATCC25275)
f:Mycobacterium scrofulaceum(マイコバクテリウム・スクロフラセウム)(ATCC19981)
g:Mycobacterium gordonae(マイコバクテリウム・ゴルドネア)(ATCC14470)
h:Mycobacterium szulgai(マイコバクテリウム・スズルガイ)(ATCC35799)
i:M.アビウム(TNC16741)
j:M.イントラセルラー(マイコバクテリウム・イントラセルラー)(ATCC13950)
k:Mycobacterium gastri(マイコバクテリウム・ガストリ)(ATCC15754)
l:Mycobacterium xenopi(マイコバクテリウム・ゼノピ)(ATCC19250)
m:Mycobacterium nonchromogenicum(マイコバクテリウム・ノンクロモゲニカム)(ATCC19530)
n:Mycobacterium terrae(マイコバクテリウム・テレ)(ATCC15755)
o:Mycobacterium triviale(マイコバクテリウム・トリビアレ)(ATCC23292)
p:Mycobacterium fortuitum(マイコバクテリウム・フォーチュイタム)(ATCC6841)
q:Mycobacterium chelonei(マイコバクテリウム・セロネイ)(ATCC35752)
r:Mycobacterium abscessus(マイコバクテリウム・アプセッサス)(ATCC19977)
s:Mycobacterium peregrinum(マイコバクテリウム・ペレグリナム)(ATCC14467)
上記(1)で設計、合成した12Fw_1をフォワードプライマーとして、12Rv_1をリバースプライマーとして用い、下記の通りPCRを行った。
上記(1)で得られたプライマー12Fw_1及び12Rv_1を各300nM、SYBRTM Green I (Molecular Probe社商品名)を原液の30倍希釈(最終濃度は原液の30000倍希釈)、1.5mM MgCl2 、80mM KCl、500μg/ml BSA、0.1% コール酸ナトリウム、0.1% TritonX-100、それぞれ0.2mMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP、及びTaq DNA ポリメラーゼ(ニッポンジーン製)40単位/ml を含有する10mM Tris-HCl(pH8.9)を調製し、PCR用反応液とした。
PCRにおける増幅ターゲットとなる鋳型DNAとして、上記(2)で調製した各マイコバクテリウム属細菌由来又は大腸菌由来のDNA試料を用い、以下の通り、インターカレーション法によるリアルタイムPCRを行い、蛍光の定量モニタリングを行った。
各DNA試料に対して各々増幅されてきた産物について、横軸をプライマー伸長産物(2本鎖DNA)の解離温度、縦軸に蛍光強度の1次微分(変化量)をとった融解曲線を作成し、ピークの検出を行った。
各DNA試料について得られた融解曲線解析の結果を1つのグラフにまとめて、図1に示す。
(1)本発明のプライマーの合成
実施例1で決定された候補の24クローンのうち、候補クローン08のシークエンス(塩基配列)の解析結果に基づき、その候補配列08から、プライマーデザイン用のWebツールPrimer3(Whitehead Institute for Biomedical Research.)を用いてPCRに用いるためのプライマー配列、すなわち「5’−cattgtgcgctgcttatgac−3’」(配列番号6。以下、003Fw_1と呼ぶ)及び「5’−gaagtgaatcggccttgct−3'」(配列番号7。以下、003Rv_1と呼ぶ)を設計した。
実施例2(2)で用いたのと同じ細菌を用い、実施例2(2)と同様の方法で、DNA試料を調製した。
上記(1)で設計、合成したプライマーを、下記表6の組み合わせで用いる以外は、実施例2(3)と同様の方法で、リアルタイムPCRを行った。
実施例2(4)と同様の方法で、各DNA試料に対して各々増幅されてきた産物について、横軸をプライマー伸長産物(2本鎖DNA)の解離温度、縦軸に蛍光強度の1次微分(変化量)をとった融解曲線を作成し、ピークの検出を行った。
実施例2と同様に、本発明のプライマーを用いて、SYBR Green I存在下で増幅された核酸の融解曲線解析を行った結果、表6記載のどのプライマーの組み合わせを用いた場合でも、M.アビウム由来のDNA試料を鋳型として用いてリアルタイムPCRを行った場合のみに、核酸増幅の結果生じる蛍光が確認でき、陽性と判定できた。
(1)本発明のプライマーの合成
実施例1で決定された候補の24クローンのうち、候補クローン10のシークエンス(塩基配列)の解析結果に基づき、その候補配列10から、プライマーデザイン用のWebツールPrimer3(Whitehead Institute for Biomedical Research.)を用いてPCR増幅検出のためのプライマー配列、すなわち「5’−caccggccaatccctaac−3’」(配列番号67。以下、RE10Fw_02と呼ぶ)及び「5’−agcgcgatgcgtagttcc−3'」(配列番号68。以下、RE10Rv_02と呼ぶ)を設計した。
実施例2(2)で用いたのと同じ細菌を用い、同様の方法で、DNA試料を調製した。
上記(1)で調製したプライマーを、上記表7の組み合わせで用いる以外は、実施例2(3)と同様の方法で、リアルタイムPCRを行った。
実施例2(4)と同様の方法で、各DNA試料に対して各々増幅されてきた産物について、横軸をプライマー伸長産物(2本鎖DNA)の解離温度、縦軸に蛍光強度の1次微分(変化量)をとった融解曲線を作成し、ピークの検出を行った。
実施例2と同様に、本発明のプライマーを用いて、SYBR Green I存在下で増幅された核酸の融解曲線解析を行った結果、表7記載のどのプライマーの組み合わせを用いた場合でも、M.アビウム由来のDNA試料を鋳型として用いてリアルタイムPCRを行った場合、核酸増幅の結果生じる蛍光シグナルが確認でき、陽性と判定できた。
リアルタイム検出法を利用し、候補配列13をターゲットとした場合の検出感度の検定を行った。
実施例2(1)と同じ機器を用い、同様の操作で12Fw_1、及び12Rv_1のオリゴヌクレオチドを合成した。これをプライマーとして用いた。
Mycos Research社(米国)より、高純度に精製されたM.アビウム由来のgenomic DNAを入手した。これを10mM Tris-HCl緩衝液に溶解し、吸光度を測定して試料中のDNA量を測定した。得られたDNA量を、濃度既知のM.アビウムのゲノムDNAを試料として同様に吸光度を測定して得られた測定値と比較することにより、試料中のゲノムDNA量(ゲノムコピー数)を決定した。
i)PCR用反応液の調製
上記(1)で得られたプライマー12_Fw1及びプライマー12_Rv1を各300nM、SYBRTM Green I (Molecular Probe社商品名)を原液の30倍希釈(最終濃度は原液の30000倍希釈)、1.5mM MgCl2 、80mM KCl、500μg/ml BSA、0.1% コール酸ナトリウム、0.1% TritonX-100、各0.2mMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP、及びTaq DNA ポリメラーゼ(ニッポンジーン製)40単位/ml を含有する10mM Tris-HCl(pH8.9)を調製し、PCR用反応液とした。
PCRにおける増幅ターゲットとなる鋳型DNAとして、上記(2)で調製したM.アビウム由来のPCR用DNA試料を用い、以下の通り、インターカレーション法によるリアルタイムPCRを行い、蛍光の定量モニタリングを行った。
得られた実験データから、リアルタイムPCR法において行われている常法に従って、検量線を作成した。
R2=0.996
リアルタイムPCR検出法を利用し、新規候補配列13(候補クローン13の塩基配列、配列番号4で表される塩基配列からなる。)をターゲットとした場合のM.アビウムの検出を行った。
実施例2(1)と同じ機器を用い、同様の操作で12Fw_1(配列番号14)、及び12Rv_1(配列番号15)のオリゴヌクレオチドを合成・精製した。
実施例2(2)でM.アビウム菌体から調製したDNA試料を用いた。まず、該DNA試料について、吸光度を測定して試料中のDNA量を測定した。得られたDNA量を、濃度既知のM.アビウムのゲノムDNAを試料として同様に吸光度を測定して得られた測定値と量と比較することにより、試料中のゲノムDNA量(ゲノムコピー数)を決定した。108コピー/μlのゲノムDNAが得られた。
i)PCR用反応液の調製
上記(1)で得られたプライマー12_Fw1及びプライマー12_Rv1を各300nM、SYBR Green I (Molecular Probe社)を原液の30倍希釈(x0.3 concentrate、最終濃度は原液の30000倍希釈)、1.5mM MgCl2、80mM KCl、500μg/ml BSA、0.1% コール酸ナトリウム、0.1%TritonX-100、それぞれ0.2mM のdATP、dCTP、dGTP、dTTP、及びTaq DNA ポリメラーゼ(ニッポンジーン製)40単位/ml を含有する10mM Tris-HCl(pH8.9)を調製し、PCR用反応液とした。
上記(3)i)で得られたPCR用反応液20μlに、上記(2)で調製したPCR用DNA試料1μLを添加し、PCR用試料とした。
(2)PCR用DNA試料中の初期DNAの濃度が104コピーで、新規候補配列13をターゲットとしてリアルタイムPCRを行った場合。
(3)PCR用DNA試料中の初期DNAの濃度が103コピーで、新規候補配列13をターゲットとしてリアルタイムPCRを行った場合。
(4)PCR用DNA試料中の初期DNAの濃度が102コピーで、新規候補配列13をターゲットとしてリアルタイムPCRを行った場合。
(5)PCR用DNA試料中の初期DNAの濃度が10コピーで、新規候補配列13をターゲットとしてリアルタイムPCRを行った場合。
(6)PCR用DNA試料中の初期DNAの濃度が0コピーで、新規候補配列13をターゲットとしてリアルタイムPCRを行った場合。
公知のプライマー配列を使用し、M.アビウムの19キロダルトンタンパク質遺伝子領域をターゲットとした場合のM.アビウムの検出を行った。
特開平11−69999号(特許文献1、EP0887425)に開示された公知のM.アビウム検出用プライマーMAV19K_F1(配列「5’−cggctgttcgagtggcaacaagtc−3’」、配列番号35)をもとに、プライマー配列「5’−ctgttcgagtggcaacaagtc−3’」(以下、MAV19K_F1sと呼ぶ。配列番号33)を設計し、MAV19K_R1(配列「5’−ccgtcgatgatgaccttggtccc−3’」、配列番号36)をもとに「5’−gtcgatgatgaccttggtcc−3’」(以下、MAV19K_R1sと呼ぶ。配列番号34)を設計した。
実施例6で調製したものと同じものを用いた。
上記(1)で調製したMAV19K_F1sをフォワードプライマーとして、MAV19K_R1sをリバースプライマーとして用る以外は、実施例6(3)と同様の方法で、リアルタイムPCRを行った。
(8)PCR用DNA試料中の初期DNAの濃度が104コピーで、M.アビウムの19キロダルトンタンパク質遺伝子領域をターゲットとしてリアルタイムPCRを行った場合。
(9)PCR用DNA試料中の初期DNAの濃度が103コピーで、M.アビウムの19キロダルトンタンパク質遺伝子領域をターゲットとしてリアルタイムPCRを行った場合。
(10)PCR用DNA試料中の初期DNAの濃度が102コピーで、M.アビウムの19キロダルトンタンパク質遺伝子領域をターゲットとしてリアルタイムPCRを行った場合。
(11)PCR用DNA試料中の初期DNAの濃度が10コピーで、M.アビウムの19キロダルトンタンパク質遺伝子領域をターゲットとしてリアルタイムPCRを行った場合。
(12)PCR用DNA試料中の初期DNAの濃度が0コピーで、M.アビウムの19キロダルトンタンパク質遺伝子領域をターゲットとしてリアルタイムPCRを行った場合。
以上の結果より、本発明のプライマー12Fw_1と12Rv_1を用い、新規候補配列13をターゲットとしてM.アビウムの検出を行った場合(実施例6)と、特開平11-69999号に開示された公知のプライマーを用い、公知のM.アビウムの持つ配列をターゲットとした場合(比較例1)で、リアルタイムPCRによるM.アビウム検出法を比較した。
(1)M.アビウム由来DNA試料の調製
まず、M.アビウムの基準株であるMycobacterium avium IID 585 (日本細菌学会より分譲された。国立大学法人 東京大学 医科学研究所 感染症国際センター 病原微生物資源室由来)を精製水に懸濁し、オートクレーブ処理(120℃・2気圧、20分)した。次いで、菌体を粉砕処理(直径2mmガラスビーズによる物理的破砕)した後、遠心分離し、上清を得た。得られた上清から、(株)キアゲン製のイオン交換樹脂タイプ DNA抽出精製キットGenomic-tipを用いてDNAの抽出、精製を行い、M.アビウム(Mycobacterium avium IID 585)由来の精製ゲノムDNAを得た。
上記(1)で得られたM.アビウム由来DNA試料24μgを材料として用い、上記実施例1(2)〜(3)と同じ試薬を用い、同様の方法で、Whole Genome Shotgum Libraryの作製、マイクロアレイ(M.アビウム由来ゲノムのWhole Genome Shotgun clone libraryのマイクロアレイ、合計1000クローン)を作製した。
i)標的ゲノムDNAの蛍光色素標識
BioPrime DNA labeling system(インビトロジェン社製)を利用し、標的ゲノムDNAの蛍光色素標識を行った。
上記(3) i)で得られた乾燥状態の各ゲノムDNAの標識産物に対して、終濃度が0.04M Tris-acetate(pH8.1)、0.1M 酢酸カリウム、0.03M酢酸マグネシウム四水和物の組成の溶液40μLを調製したものを加え、懸濁混和させた。次いで94℃で15 分間加熱処理し、100base〜300 base の、各ゲノムDNAの標識産物の、断片化生成物を得た。
salmon sperm DNA(10mg/mL) ;0.5μL
formamide ;5μL
Total 40〜50μL
上記(3)の工程で得られたAlexa555Alexa647標識産物混合溶液を用いる以外は、上記実施例1(5)と同様の方法で、上記(2)で得られたM.アビウム由来ゲノムDNAのWhole Genome Shotgun clone libraryのマイクロアレイに対する、Alexa555標識産物とAlexa647標識産物の競合ハイブリダイゼーションを行った。
蛍光読み取りスキャナー GenePix 4000B(Axon Instruments Inc.製)を用いて、上記(4)で得られた、マイクロアレイ・ハイブリダイゼーション処理したマイクロアレイ上の蛍光強度を測定した。この際、Alexa555標識産物とAlexa647標識産物の競合ハイブリダイゼーションの結果を解析するため、2チャンネル、すなわち2ch(Alexa555、Alexa647)での蛍光を検出した。
下記表10に記載のM.アビウム菌株各種(日本細菌学会より分譲された)を用い、上記(1)と同様の方法で、各菌株から「M.アビウム由来DNA試料」を調製した。
以上の結果を基に、コンセンサス配列としての候補を選択する上での一つの目安として、上記(6)の検出で、これらのM.アビウム菌株とハイブリダイズし、且つ上記(5)の検出で、M.イントラセルラーとはハイブリダイズしなかったスポットをM.アビウム由来ゲノムDNAのWhole Genome Shotgun cloneのマイクロアレイ上から選択した。その結果、7つのスポット(候補クローン)が選択された。
次に、上記(7)で選択された候補7クローンについて、実施例1(7)と同様の方法でシークエンス解析を行い、それぞれのクローンの塩基配列決定を行った。
(1)本発明のプライマーの合成
実施例7(8)で決定された候補クローンのうち、候補クローンDのシークエンス(塩基配列)の各解析結果に基づき、その候補配列Dから、プライマーデザイン用のWebツールPrimer3(Whitehead Institute for Biomedical Research.)を用いて、PCRに用いるためのプライマー配列、すなわち「5'−AGTGGGCAACAATCCAAGAG−3'」(配列番号159、以下、「Mac_12 Fw01」と呼ぶ。)、及び「5'−CCCGACACAACGAGGTTT−3'」(配列番号160,以下、「Mac_12 Rv01」と呼ぶ。)を設計した。
実施例2(2)のマイコバクテリウム属細菌の調製方法に従って、上記表10に記載のM.アビウム菌株を処理し、DNAの抽出、精製を行った。得られたそれぞれの精製DNAを、最終1ng/μl(10mM Tris-HCl緩衝液、pH8.9)になるように調製し、各M.アビウム菌株由来のDNA試料とした。
上記(1)で設計、合成したMac_12Fw01をフォワードプライマーとして、Mac_12Rv01をリバースプライマーとして用い、下記の通りPCRを行った。
上記(1)で得られたプライマーMac_12Fw01及びMac_12Rv01を各300nM、SYBRTM Green I (Molecular Probe社商品名)を原液の30倍希釈(最終濃度は原液の30000倍希釈)、1.5mM MgCl2 、80mM KCl、500μg/ml BSA、0.1% コール酸ナトリウム、0.1% TritonX-100、dATP、それぞれ0.2mMのdCTP、dGTP、dTTP、及びTaq DNA ポリメラーゼ(ニッポンジーン製)40単位/ml を含有する10mM Tris-HCl(pH8.9)を調製し、PCR用反応液とした。
PCRにおける増幅ターゲットとなる鋳型DNAとして、上記(2)で調製した各M.アビウム菌株由来のDNA試料を用い、以下の通り、インターカレーション法によるリアルタイムPCRを行い、蛍光の定量モニタリングを行った。
各DNA試料に対して各々増幅されてきた産物について、横軸をプライマー伸長産物(2本鎖DNA)の解離温度、縦軸に蛍光強度の1次微分(変化量)をとった融解曲線を作成し、ピークの検出を行った。
各DNA試料について得られた融解曲線解析の結果を1つのグラフにまとめて、図4に示す。
実施例7(8)で決定された候補クローンA〜Gのシークエンス(塩基配列)の解析結果に基づき、その各候補クローンの候補配列A〜Gから、プライマーデザイン用のWebツールPrimer3(Whitehead Institute for Biomedical Research.)を用いて、PCR増幅検出のためのプライマー配列をそれぞれ設計した。
(1)プライマーの合成
実施例8(1)と同じ機器を用い、同様の操作で、Mac_12Fw01、及びMac_12Rv01のオリゴヌクレオチドを合成、精製した。
以下に示す、実施例2で用いたのと同じ細菌を用い、実施例2(2)と同様の方法で調製したDNA試料を得た。
b:Mycobacterium tuberculosis(マイコバクテリウム・ツベルクローシス、ヒト型結核菌)(TMC102[H37Rv])
c:Mycobacterium kansasii(M.カンサシ)(ATCC12478)
d:Mycobacterium marinum(マイコバクテリウム・マリナム)(ATCC927)
e:Mycobacterium simiae(マイコバクテリウム・シミアエ)(ATCC25275)
f:Mycobacterium scrofulaceum(マイコバクテリウム・スクロフラセウム)(ATCC19981)
g:Mycobacterium gordonae(マイコバクテリウム・ゴルドネア)(ATCC14470)
h:Mycobacterium szulgai(マイコバクテリウム・スズルガイ)(ATCC35799)
i:M.アビウム(IIID 585)
j:M.イントラセルラー(マイコバクテリウム・イントラセルラー)(ATCC13950)
k:Mycobacterium gastri(マイコバクテリウム・ガストリ)(ATCC15754)
l:Mycobacterium xenopi(マイコバクテリウム・ゼノピ)(ATCC19250)
m:Mycobacterium nonchromogenicum(マイコバクテリウム・ノンクロモゲニカム)(ATCC19530)
n:Mycobacterium terrae(マイコバクテリウム・テレ)(ATCC15755)
o:Mycobacterium triviale(マイコバクテリウム・トリビアレ)(ATCC23292)
p:Mycobacterium fortuitum(マイコバクテリウム・フォーチュイタム)(ATCC6841)
q:Mycobacterium chelonei(マイコバクテリウム・セロネイ)(ATCC35752)
r:Mycobacterium abscessus(マイコバクテリウム・アプセッサス)(ATCC19977)
s:Mycobacterium peregrinum(マイコバクテリウム・ペレグリナム)(ATCC14467)
上記(1)で設計、合成したプライマーMac_12Fw01、及びMac_12Rv01を用いる以外は、実施例2(3)と同様の方法でリアルタイムPCRを行った。
実施例2(4)と同様の方法で、各DNA試料に対して各々増幅されてきた産物について、横軸をプライマー伸長産物(2本鎖DNA)の解離温度、縦軸に蛍光強度の1次微分(変化量)をとった融解曲線を作成し、ピークの検出を行った。
各DNA試料について得られた融解曲線解析の結果を1つのグラフにまとめて、図5に示す。
(1)本発明のプライマーの合成
実施例8(1)と同じ機器を用い、同様の操作で、上記表12に記載された、Mac_12Fw01及びMac_12Rv01以外のオリゴヌクレオチドを合成、精製した。
実施例10で用いたのと同じ細菌を用い、実施例2(2)と同様の方法で、DNA試料を調製した。
上記(1)で設計、合成したプライマーを、上記表12の組み合わせで用いる以外は、実施例2(3)と同様の方法で、リアルタイムPCRを行った。
実施例2(4)と同様の方法で、各DNA試料に対して各々増幅されてきた産物について、横軸をプライマー伸長産物(2本鎖DNA)の解離温度、縦軸に蛍光強度の1次微分(変化量)をとった融解曲線を作成し、ピークの検出を行った。
実施例10の結果と同様、本発明のプライマーを用いて、SYBR Green I存在下で増幅された核酸の融解曲線解析を行った結果、表12記載のどのプライマーの組み合わせを用いた場合でも、M.アビウム由来のDNA試料を鋳型として用いてリアルタイムPCRを行った場合のみに、核酸増幅の結果生じる蛍光シグナルが確認でき、陽性と判定できた。
リアルタイムPCR検出法を利用し、候補配列Dをターゲットとした場合の検出感度の検定を行った。
実施例2(1)と同じ機器を用い、同様の操作でMac_12Fw01、及びMac_12Rv01のオリゴヌクレオチドを合成・精製した。これをプライマーとして用いた。
実施例7(1)で、M.アビウム(Mycobacterium avium IID 585)から調製したDNA試料を用いた。
i)PCR用反応液の調製
上記(1)で得られたプライマーMac_12Fw1及びプライマーMac_12Rv1を各300nM、SYBR Green I (Molecular Probe社)を原液の30倍希釈(最終濃度は原液の30000倍希釈)、1.5mM MgCl2、80mM KCl、500μg/ml BSA、0.1% コール酸ナトリウム、0.1%TritonX-100、それぞれ0.2mM のdATP、dCTP、dGTP、dTTP、及びTaq DNA ポリメラーゼ(ニッポンジーン製)40単位/ml を含有する10mM Tris-HCl(pH8.9)を調製し、PCR用反応液とした。
上記(3)i)で調製したPCR用反応液20μlに、上記(2)で調製したPCR用DNA試料1μLを添加したものを、PCR用試料とした。
得られた実験データから、リアルタイムPCR法において行われている常法に従って、各PCR用DNA試料毎に、実施例5(4)と同様の方法で、PCRのサイクル数(x軸)に対するSYBR Green Iの蛍光強度(Rn、y軸)をプロットした増幅曲線を作成した。得られた増幅曲線を図6に示す。
R2=0.994
更に、本発明の検出方法によれば、複数の血清型のM.アビウムを、一回の測定で検出することが出来、迅速且つ簡便なM.アビウムの検出、診断が可能となるという効果を奏する。
Claims (13)
- 配列番号136で表される塩基配列(但し、Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン、Tはチミンを表す。また、任意の位置のTはウラシル(U)と置換されていてもよい。以下同じ。)若しくはその相補配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号136で表される塩基配列の連続した少なくとも15塩基の塩基配列若しくはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含み、且つマイコバクテリウム・アビウム(Mycobacterium avium)遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするが、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(TMC102[H37Rv])、マイコバクテリウム・カンサシ(ATCC12478)、マイコバクテリウム・マリナム(ATCC927)、マイコバクテリウム・シミアエ(ATCC25275)、マイコバクテリウム・スクロフラセウム(ATCC19981)、マイコバクテリウム・ゴルドネア(ATCC14470)、マイコバクテリウム・スズルガイ(ATCC35799)、マイコバクテリウム・イントラセルラー(ATCC13950)、マイコバクテリウム・ガストリ(ATCC15754)、マイコバクテリウム・ゼノピ(ATCC19250)、マイコバクテリウム・ノンクロモゲニカム(ATCC19530)、マイコバクテリウム・テレ(ATCC15755)、マイコバクテリウム・トリビアレ(ATCC23292)、マイコバクテリウム・フォーチュイタム(ATCC6841)、マイコバクテリウム・セロネイ(ATCC35752)、マイコバクテリウム・アプセッサス(ATCC19977)、マイコバクテリウム・ペレグリナム(ATCC14467)の遺伝子の塩基配列とはハイブリダイズしないオリゴヌクレオチド。
- 配列番号136で表される塩基配列の連続した少なくとも18塩基の塩基配列又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含み、且つマイコバクテリウム・アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするが、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(TMC102[H37Rv])、マイコバクテリウム・カンサシ(ATCC12478)、マイコバクテリウム・マリナム(ATCC927)、マイコバクテリウム・シミアエ(ATCC25275)、マイコバクテリウム・スクロフラセウム(ATCC19981)、マイコバクテリウム・ゴルドネア(ATCC14470)、マイコバクテリウム・スズルガイ(ATCC35799)、マイコバクテリウム・イントラセルラー(ATCC13950)、マイコバクテリウム・ガストリ(ATCC15754)、マイコバクテリウム・ゼノピ(ATCC19250)、マイコバクテリウム・ノンクロモゲニカム(ATCC19530)、マイコバクテリウム・テレ(ATCC15755)、マイコバクテリウム・トリビアレ(ATCC23292)、マイコバクテリウム・フォーチュイタム(ATCC6841)、マイコバクテリウム・セロネイ(ATCC35752)、マイコバクテリウム・アプセッサス(ATCC19977)、マイコバクテリウム・ペレグリナム(ATCC14467)の遺伝子の塩基配列とはハイブリダイズしない、マイコバクテリウム・アビウム検出用プライマー。
- 配列番号136で表される塩基配列の連続した少なくとも18塩基の塩基配列又はその相補配列が配列番号175〜182から選択される塩基配列又はその相補配列である、請求項2に記載のプライマー。
- 下記から構成される、マイコバクテリウム・アビウム検出用プローブ、
(1)配列番号136で表される塩基配列若しくはその相補配列からなるポリヌクレオチド、又は
(2)配列番号136で表される塩基配列の連続した100〜600塩基の塩基配列若しくはその相補配列又は配列番号136で表される塩基配列の連続した15〜40塩基の塩基配列若しくはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含み、且つマイコバクテリウム・アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするが、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(TMC102[H37Rv])、マイコバクテリウム・カンサシ(ATCC12478)、マイコバクテリウム・マリナム(ATCC927)、マイコバクテリウム・シミアエ(ATCC25275)、マイコバクテリウム・スクロフラセウム(ATCC19981)、マイコバクテリウム・ゴルドネア(ATCC14470)、マイコバクテリウム・スズルガイ(ATCC35799)、マイコバクテリウム・イントラセルラー(ATCC13950)、マイコバクテリウム・ガストリ(ATCC15754)、マイコバクテリウム・ゼノピ(ATCC19250)、マイコバクテリウム・ノンクロモゲニカム(ATCC19530)、マイコバクテリウム・テレ(ATCC15755)、マイコバクテリウム・トリビアレ(ATCC23292)、マイコバクテリウム・フォーチュイタム(ATCC6841)、マイコバクテリウム・セロネイ(ATCC35752)、マイコバクテリウム・アプセッサス(ATCC19977)、マイコバクテリウム・ペレグリナム(ATCC14467)の遺伝子の塩基配列とはハイブリダイズしないオリゴヌクレオチド。 - 請求項2又は3に記載のプライマーを用いることを特徴とするマイコバクテリウム・アビウムの検出方法。
- 請求項2又は3に記載のプライマーを用い、試料中の核酸を鋳型として核酸増幅反応を行い、得られたプライマー伸長産物を検出することを特徴とする、請求項5に記載の検出方法。
- 更に、標識物質で標識された標識プローブを用いる、請求項5又は6に記載の検出方法。
- 下記工程を包含することを特徴とする、請求項5又は6に記載の検出方法、
(1)請求項2又は3に記載のプライマーを用い、試料中の核酸を鋳型として核酸増幅反応を行う、
(2)(1)で得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行い、
下記のいずれかの場合に、被検試料がマイコバクテリウム・アビウム陽性であると判定する、
(i)電気泳動を行った後、得られた電気泳動画分について、目的とする塩基対数のプライマー伸長産物の画分を確認し、目的とする塩基対数のプライマー伸長産物が確認された場合、
(ii)電気泳動を行った後、得られた電気泳動画分について、配列番号136で表される塩基配列の連続する15塩基以上若しくはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含み、且つマイコバクテリウム・アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするが、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(TMC102[H37Rv])、マイコバクテリウム・カンサシ(ATCC12478)、マイコバクテリウム・マリナム(ATCC927)、マイコバクテリウム・シミアエ(ATCC25275)、マイコバクテリウム・スクロフラセウム(ATCC19981)、マイコバクテリウム・ゴルドネア(ATCC14470)、マイコバクテリウム・スズルガイ(ATCC35799)、マイコバクテリウム・イントラセルラー(ATCC13950)、マイコバクテリウム・ガストリ(ATCC15754)、マイコバクテリウム・ゼノピ(ATCC19250)、マイコバクテリウム・ノンクロモゲニカム(ATCC19530)、マイコバクテリウム・テレ(ATCC15755)、マイコバクテリウム・トリビアレ(ATCC23292)、マイコバクテリウム・フォーチュイタム(ATCC6841)、マイコバクテリウム・セロネイ(ATCC35752)、マイコバクテリウム・アプセッサス(ATCC19977)、マイコバクテリウム・ペレグリナム(ATCC14467)の遺伝子の塩基配列とはハイブリダイズしないオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認された場合。 - プライマーが標識物質で標識化されており、当該標識プライマーを用いて試料中の核酸を鋳型とした核酸増幅反応を行い、得られたプライマー伸長産物の標識を測定する、請求項6に記載の検出方法。
- 下記(1)〜(4)から選択されるプライマー対を用いて行う、請求項5〜9のいずれかに記載の検出方法、
(1)配列番号175で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号176で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーとのプライマー対、
(2)配列番号177で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号178で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーとのプライマー対、
(3)配列番号179で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号180で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーとのプライマー対、
(4)配列番号181で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号182で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーとのプライマー対。 - 請求項2又は3に記載のプライマー又は/及び請求項4に記載のプローブを含んでなる、マイコバクテリウム・アビウム検出用試薬キット。
- 下記(1)〜(4)から選択されるプライマー対を含んでなる、請求項11に記載のキット、
(1)配列番号175で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号176で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーとのプライマー対、
(2)配列番号177で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号178で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーとのプライマー対、
(3)配列番号179で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号180で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーとのプライマー対、
(4)配列番号181で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号182で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーとのプライマー対。 - 配列番号136で表される塩基配列又はその相補配列からなり、且つマイコバクテリウム・アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの、マイコバクテリウム・アビウム検出に使用するプライマーおよび/又はプローブ設計への使用。
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