CN101638687A

CN101638687A - 检测仔猪常见致病菌的基因芯片、试剂盒及方法

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Publication number: CN101638687A
Application number: CN200910091528A
Authority: CN
Inventors: 陈小玲; 伍诚意; 曹峰子; 梁之昶; 杨兵; 章振华; 周宏专; 季海峰
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2009-08-26
Filing date: 2009-08-26
Publication date: 2010-02-03
Anticipated expiration: 2029-08-26
Also published as: CN101638687B

Abstract

本发明提供一种“检测仔猪常见致病菌的基因芯片、试剂盒及方法”，属于动物医学诊断领域。所述基因芯片上设置有仔猪致病菌的23S rDNA特异性探针序列，能够检出多种仔猪致病菌菌种下属的多种致病菌株；本发明还提供两对通用引物，与基因芯片共同组合成检测试剂盒，通过通用引物扩增待测菌，一方面能数倍扩大其模板浓度，提高芯片检测灵敏性，另一方面，通过通用引物扩增过程获得的荧光标记片段与芯片探针结合的特异性明显高于芯片直接杂交待测菌DNA；本发明还提供上述通用引物和芯片的使用方法。本发明的基因芯片、试剂盒及检测方法为及时检测出致病菌种类，预防仔猪疫情蔓延提供了一种实用方便的工具。

Description

检测仔猪常见致病菌的基因芯片、试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及动物医学诊断领域，特别是涉及一种检测仔猪常见致病菌的基因芯片、试剂盒及方法

背景技术

我国畜禽生产中传染病问题严重，多种病原感染经常发生，细菌感染是最常见的继发和多重感染源。长期以来，细菌的分离鉴定一直是实验室检验的难题。细菌鉴定的传统方法主要有细菌分离培养、生化试验、血清学试验等，程序烦琐，专门的权威检验部门通常需要至少4-7天才能得出结果。还有的细菌在体外很难培养、至今无法培养或属于新发现的细菌，给实验室分离鉴定带来了很大的困难。现有的生化试剂盒需要先判定革兰氏染色阳性或阴性、氧化酶试验阳性或阴性后才能选择适合的生化试剂盒，而染色环节和氧化酶试验也常出现阳性或阴性错判，进口VITEK、API生化试剂盒价格昂贵，国内的生化试剂盒质量参差不齐，不能适应当前市场和公共卫生的需要。

基因芯片技术是20世纪90年代初期发展起来的一种基因分析的高新生物技术，其突出的特点是集成化、微型化、自动化、高通量等。基因芯片检测的目的片段大多是PCR产物，可以高通量、平行化对多种靶基因进行准确鉴定，为微生物菌种识别、毒力因子确定、耐药性检测等提供了新的技术平台，同时在基因表达谱、突变检测、SNP筛查及药物筛选等研究中已经得到越来越广泛的应用。在致病菌检测方面，目前报道的检测方法中以特异性引物多重PCR结合基因芯片方法、通用引物结合基因芯片方法等为主。

目前，已经建立了基于通用引物的基因芯片检测系统，选取的靶基因有16S rRNA基因、16-23S rRNA基因区间或23S rRNA基因等。据报道，该方法已经应用于检测血液和脑脊液中的细菌、肠道致病菌、鱼类致病菌、水中致病菌、食品中的致病菌、环境中的致病菌等。研究人员设计出细菌的通用引物，只通过一次PCR扩增就可以得到大部分细菌的目标片段，解决了多重PCR体系对同时检测和鉴定致病菌数量的限制问题。基于通用引物的基因芯片体系检测的最大优势在于可以在不增加引物对的情况下，通过添加特异性探针进而扩大该体系的检测范围，提高同时检测多种目标细菌的能力。

23S rRNA作为细菌核糖体RNA基因之一，含有与16S rRNA基因类似的特点，比如在细菌基因组中普遍分布、多拷贝、保守性高，有保守区和可变区域。23S rRNA比16S rRNA基因有更长的序列，其变异性对于许多细菌来说高于16S rRNA，研究表明其在一些细菌鉴别中的优越性高于16S rRNA基因。

仔猪阶段的猪由于免疫力低，生理系统功能不全，常常感染致病菌而发生各种疾病，导致存活率低，或者影响后续生长发育的质量，给养殖户带来很大的风险。与发达国家相比，我国对于仔猪致病菌的检测仍处在较低水平，因此有必要利用分子生物学技术建立针对多种病原的高通量、快速、准确的检测体系，研制适合突发传染病病原检验且操作简便的试剂盒，在较短的时间内对感染性疾病做出正确诊断，防止传染性疾病传播，提高我国对动物感染性疾病的控制能力，降低养殖风险。

发明内容

本发明针对上述领域的空白和需要，提供一种检测仔猪常见致病菌的基因芯片、试剂盒及方法，能够同时检测目前已知的多种仔猪常见致病菌，为正确防治疫病提供充裕的时间。

一种检测仔猪致病菌的基因芯片，其特征在于芯片基质上设置有仔猪致病菌的23S rRNA特异性探针序列，所述仔猪致病菌及其23S rRNA特异性探针序列如下：

猪放线杆菌(A.suis)，ATAGCAGTAGACACAGAAGAACGAGC；

胸膜肺炎放线杆菌(A.pleuropneumoniae)，AGTGATAATGGTTTTGTTAGGAGAAT；

多杀性巴氏杆菌(P.multocida)，CCGTACTCGAAAGTATGTTAGTGGAACTAA；

副猪嗜血杆菌(H.parasuis)，GTAGGTTGTAAGAGTATACCTCCGA；

猪链球菌(Strep.suis)，TAAGCAGTGAGGTGTGATATGAGTC；

支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)，ATGAAGGGGTCGCAGAGAATCGGTG；

表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，GTTTCCTCGAGTCGTTGATTTCACAC；

空肠弯曲菌(Campylobacter.jejuni)，GGATAGAAGAACCCCTGATGCCGTC；

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)，AACCGAAGTACATGATTCCACGCTGCCA；

猪肺炎支原体菌株(Mycoplasma hyopneumoniae)，

AGTACCGAATTAAATGACTCTCTGTT；

肠道沙门菌(Salmonella enterica)，CACGTAGGTGAAGTGATTTACTCATG；

大肠杆菌(Escherichia coli)，GTAGGTGAAGCGACTTGCTCGTGGA；和/或

大肠杆菌(Escherichia coli)，GCTGATATGTAGGAGAAGTCCCTCGCGG。

一种检测仔猪致病菌的基因芯片试剂盒，其特征在于包括如下两组寡核苷酸：

(1)上述基因芯片；

(2)如下两对通用引物：

23S-F1：5’AACDGGTTRATATTCC3’，

23S-R1：5’GCTACCTTAGGACCGTTAT3’；

23S-F2：5’GAGGAAAAGAAATCAACCGAGA3’，

23S-R2：5’TGGTTCACTATCGGTCAATCAG3’，且所述23S-R1与23S-R2的5’端用Cy3荧光标记。

所述试剂盒还包括除通用引物和DNA探针之外的PCR扩增所需试剂和杂交液，所述杂交液的成分为：5×SSC溶液，2.5％甲酰胺，0.2％SDS。

所述试剂盒还包括PCR阴性对照模板和阳性对照模板，所述阴性对照模板为双蒸水，所述阳性对照模板为上述任一致病菌的基因组DNA。

一种检测仔猪致病菌的基因芯片方法，包括如下步骤：

(1)提取待测菌的基因组DNA，

(2)用如下两对通用引物扩增待测菌的基因组DNA，

23S-F1：5’AACDGGTTRATATTCC 3’，

23S-R1：5’GCTACCTTAGGACCGTTAT 3’；

23S-F2：5’GAGGAAAAGAAATCAACCGAGA 3’，

23S-R2：5’TGGTTCACTATCGGTCAATCAG 3’，且所述23S-R1与23S-R2的5’端用Cy3荧光标记。

(3)扩增产物与上述基因芯片杂交，

(4)杂交后处理及扫描结果。

所述通用引物扩增待测菌的基因组DNA的PCR体系中，通用引物终浓度比为：23S-R1∶23S-F1等于10，23S-R2∶23S-F2等于30；

在所述步骤(2)前，先对基因芯片进行如下预处理：用0.2％SDS清洗2次，接着以双蒸水清洗2次，晾干后用于杂交。

所述步骤(2)中以所述任一致病菌参考株的基因组DNA为阳性对照模板，以双蒸水为阴性对照模板。

所述杂交步骤如下：扩增产物变性，98℃10min后冰浴10min，将变性的PCR产物与杂交液体积比1∶4混匀，取10μl转移至所述基因芯片反应区，将所述基因芯片置于杂交盒内，连同杂交盒浸入42℃水浴中反应60min。

所述杂交后清洗步骤如：杂交后的基因芯片依次在洗液A：1×SSC、0.2％SDS，洗液B：0.2×SSC和洗液C：0.1×SSC中于室温各洗涤1min。

本发明提供一种能够同时检测12种仔猪致病菌的基因芯片，包括该基因芯片的试剂盒，以及利用该试剂盒或者基因芯片检测仔猪致病菌的方法。

(一)本发明的基因芯片制作过程及优点如下：从Genbank收集12种目标细菌的23S rRNA全基因或接近完全的基因序列108条，对108条序列按种建库，用DNAStar软件的clustalW程序进行比对，选出每种细菌的代表序列1或2条，共14条，对这14条序列进行比对，找出它们的保守区和变异区。利用Biosun 2.0软件(军事医学科学院基础医学研究所计算生物学中心)，在变异区对每种细菌的序列数据库设计各自的种特异性探针，共设计了12种细菌的36条种特异性候选探针，分布在23S rRNA序列的2个变异区域内；借助Primer Premier 5.0软件在设计出上述36条候选探针序列的2个变异区域外侧的保守区设计了2对通用引物，两对通用引物联合扩增，能够扩增出多种细菌的23S rRNA基因序列。

利用通用引物对12种目标细菌的参考菌株(见表1中带星号的菌株)的基因组DNA进行PCR扩增，然后将PCR产物分别与杂交液混匀后与点有36条候选探针的基因芯片杂交、扫描及结果分析，扣除背景值，以探针的特异性和荧光信号的强度值(荧光信号强度由强到弱分别为白色，红色，黄色，绿色)作为最终筛选探针的指标。结果从36条候选探针中选出13条探针(大肠杆菌有2条)，作为该仔猪常见致病菌的终选探针(表6)。终选探针与对应参考菌株PCR靶标的特异性杂交结果见图6。

将12种细菌的终选特异性探针固定在常用的基因芯片基质上，形成检测这12种致病菌的特异性基因芯片，本发明选取的特异性探针能特异地检测出属于同一个菌种的菌株，如表1中没有带星号的菌株也能被这些特异性探针捕获出来，本发明的基因芯片可检测的范围包括12种致病菌下属的多种致病菌株，集实用性与高效性于一身，可用于高通量地检测仔猪感染情况，为高效率检测或鉴别疫情提供了最关键的方法。

(二)本发明还提供一种检测12种致病菌的试剂盒，该试剂盒的特征在于包含有本发明提供的上述基因芯片和两对通用引物。该试剂盒在具备芯片扫描仪的分子生物学实验室条件下，可方便快捷地检测待测仔猪的细菌感染状况，作为优选，在试剂盒中还可以包括除芯片和通用引物之外的PCR试剂和杂交液，使得该试剂盒更便于使用。试剂盒中还包括12种致病菌中任意一种菌的基因组DNA为PCR阳性对照模板，用于排除假阴性；双蒸水为阴性模板，用于排除污染造成的假阳性。

(三)本发明还提供了检测12种致病菌的检测方法，该方法主要特征在于采用本发明提供的基因芯片及两对通用引物PCR。通用引物将待测菌模板进行扩大若干倍，从而提高了菌的检出灵敏度，尽管芯片可检测多种致病菌，但PCR只需要两对引物，并不需要与每种致病菌一一对应的多对引物，因此，检测过程既简便又灵敏。

本发明提供了优化的方案是：通用引物中下游引物5’端用荧光进行标记，通用引物浓度比为：23S-R1∶23S-F1等于10，23S-R2∶23S-F2等于30；即以上下游通用引物浓度不对称的方式扩增待测模板，不对称PCR的目的是通过多加荧光标记的下游通用引物，少加非荧光的上游通用引物获得大量的单链PCR产物，单链PCR产物可提高芯片上单链探针杂交的效率。

为了提高芯片杂交的准确性，排除假阳性或假阴性，芯片上点有阳性对照探针、阴性对照探针和空白对照。

综上所述本发明提供了一种检测仔猪常见致病菌的基因芯片，同时提供了试剂盒与优化的检测方法，能针对多种病原进行高通量、快速、准确的检测，适合于突发传染病病原检验，提供的试剂盒使检测方法简便高效，使兽医实验室工作人员能在较短的时间内对感染性细菌病做出正确诊断，防止传染性疾病传播，提高我国对动物感染性疾病的控制能力，降低养殖风险。

说明书附图

图1：12种目标细菌的14条23S rRNA代表序列比对结果及通用引物位置标记(后800nt序列未显示)。

图2：第一对通用引物的扩增产物550bp(能扩增所有目标细菌)。

M：DL2000；1：空白；2：胸膜肺炎放线杆菌；3：副猪嗜血杆菌；4.多杀性巴氏杆菌；5：猪放线杆菌；6：大肠杆菌-1；7：大肠杆菌-2；8：肠道沙门菌；9：猪链球菌；10：表皮葡萄球菌；11：产气荚膜梭菌；12：空肠弯曲菌；13：支气管败血波氏杆菌；14：猪肺炎支原体菌株。

图3：第二对通用引物的扩增产物250bp(能扩增部分目标细菌)

M：DL2000；1：空白；2：胸膜肺炎放线杆菌；3：副猪嗜血杆菌；4：多杀性巴氏杆菌；5：猪放线杆菌；6：大肠杆菌-1；7：大肠杆菌-2；8：肠道沙门菌；9：空肠弯曲菌；10：支气管败血波氏杆菌；11：猪肺炎支原体菌株；12：猪链球菌；13：表皮葡萄球菌；14：产气荚膜梭菌。

图4：550bp片段上下游通用引物比例优化杂交信号分析

横坐标表示引物比例，纵坐标表示杂交信号强度，黑色柱子代表表皮葡萄球菌，白色柱子代表副猪嗜血杆菌

图5：250bp片段上下游通用引物比例优化杂交信号分析

横坐标表示引物比例，纵坐标表示杂交信号强度，黑色柱子代表多杀性巴氏杆菌，白色柱子代表胸膜肺炎放线杆菌

图6：终选探针与对应参考菌株PCR靶标的特异性杂交

1：肠道沙门菌；2：大肠杆菌；3：多杀性巴氏杆菌；4：胸膜肺炎放线杆菌；5：副猪嗜血杆菌；6：猪放线杆菌；7：猪链球菌；8：表皮葡萄球菌；9：猪肺炎支原体；10：产气荚膜梭菌；11：支气管败血波氏杆菌；12：大肠杆菌；13：空肠弯曲菌。

图7：猪肺炎支原体探针(上)和胸膜肺炎放线杆菌探针(下)灵敏度实验

图8-1：芯片的特异性评价，

实验菌为表1中部分非目标相关参考株的检测结果：1-金黄色葡萄球菌，2-兽疫链球菌，3-鼠伤寒沙门氏菌，4-猪放线杆菌，5-丝状支原体丝状亚种，6-猪丹毒丝菌，7-假单胞菌，8-变形杆菌

图8-2：芯片的特异性评价

为部分临床分离株的检测结果

1：支气管败血波氏杆菌；2：多杀性巴氏杆菌；3：副猪嗜血杆菌；4：大肠杆菌；5：猪链球菌；6：空肠弯曲菌；7：产气荚膜梭菌；8：肠道沙门菌；9：猪肺炎支原体；10：大肠杆菌；11：胸膜肺炎放线杆菌；12：大肠杆菌。

图9：大肠杆菌和胸膜肺炎放线杆菌探针重复性和4℃保存期实验

1和4：4℃保存3天的芯片；2和5：4℃保存3个月的芯片；3和6：4℃保存6个月的芯片。

具体实施方式

主要试剂

API生化试剂盒为法国生物梅里埃公司产品

TaqDNA聚合酶、dNTPs、DNAMarker(DL2000，MarkerIII)、细菌基因组提取试剂盒均为北京天根生化科技有限公司产品。

Tris碱、RNaseA、蛋白酶K为Promega公司产品。

琼脂糖凝胶染料Goldview为赛百盛公司产品。

醛基片(Telechem)

甲酰胺、SDS

主要仪器设备

PixSys 5000芯片点样仪(Cartesian Technologies，Irvine，CA)

芯片扫描仪GenePix 4000B(Axon Instrument)

梯度PCR仪：Eppendorf公司产品。

制冰机：Grant公司产品。

Power-PAC 200电泳仪：Bio-RAD公司产品。

超净工作台：北京半导体设备一厂生产。

DYT-III型电泳槽：北京市六一仪器厂生产。

Gel Doc2000凝胶成像系统：Bio-RAD公司产品。

5415D台式离心机：Eppendorf公司产品。

5804R台式冷冻离心机：Eppendorf公司6131型核酸测定仪：Eppendorf公司产品。

D-1型自动蒸汽灭菌锅：北京发恩科贸有限公司生产。

试验菌株

探针筛选用的13个参考菌株(见表1中带星号的菌株)：表皮葡萄球菌(S.epi)、副猪嗜血杆菌(Hps)、胸膜肺炎放线杆菌(App)、多杀性巴氏杆菌(Pm)、猪放线杆菌(A.suis)来自澳大利亚昆士兰州动物研究所，支气管败血波氏杆菌(Bb)、产气荚膜梭菌(Clp)、肠道沙门菌(SE)、猪链球菌(S.suis)、2株大肠杆菌(E.coli)来自中国兽医微生物菌种保藏中心，猪肺炎支原体菌株(Mhp)来自美国康奈狄格大学病理生物学系，空肠弯曲菌(Cj)DNA来自丹麦技术大学兽医学院。

芯片特异性评价用的另外33个参考菌株来自澳大利亚昆士兰州动物研究所、中国兽医微生物菌种保藏中心、美国康奈狄格大学病理生物学系、中国医学微生物菌种保藏中心(表1)。

芯片特异性和临床检验评价用的61个临床分离菌株中44株来自本实验室、17株来自江西农业大学动物科技学院、江苏省农科院兽医研究所和哈尔滨兽医研究所。

上述菌株在本实验室均有保存，公众在各菌株的原保存中心或实验室不能获取时，本实验室可向其发放，作验证实验使用。

表1本试验使用的参考菌株

^*该菌株用于探针筛选

^**ARI：澳大利亚昆士兰州动物研究所，CVCC：中国兽医微生物菌种保藏中心，DBUC：美国康奈狄格大学病理生物学系，CMCC：中国医学微生物菌种保藏中心，VDTU：丹麦技术大学兽医学院。

实施例1.基因芯片特异性探针的设计

步骤1：目标细菌的23S rRNA序列比对分析

从Genbank收集12种目标致病菌的23S rRNA全基因或接近完全的基因序列108条(个别细菌可用的序列太少，本实验室测序了6条提交给Genbank。A.suis无奈只有我们提交的一条序列)。对108条序列按种建库，用DNAStar软件的clustalW程序进行比对，选出每种细菌的代表序列1或2条(共14条)，其中表皮葡萄球菌(S.epi)的代表序列登录号为CP000029、副猪嗜血杆菌(Hps)为AB303974、胸膜肺炎放线杆菌(App)为NC009053、多杀性巴氏杆菌(Pm)为NC_002663、猪放线杆菌(A.suis)为EU333989，支气管败血波氏杆菌(Bb)为NC_002927、产气荚膜梭菌(Clp)为NC_008621、肠道沙门菌(SE)为EU146942和SEU77919、猪链球菌(S.suis)为NC_009442、大肠杆菌(E.coli)为BA000007和EU146962，猪肺炎支原体菌株(Mhp)为X68421，空肠弯曲菌(Ci)为NC_003912

对这14条序列进行比对，找出它们的保守区和变异区。利用Biosun 2.0软件(军事医学科学院基础医学研究所计算生物学中心)，在变异区对每种细菌的序列数据库设计各自的种特异性探针。共设计了12种细菌的36条种特异性候选探针，分布在23S rRNA序列的2个变异区域。

设计出的探针先后用Biosun 2.0软件的BLAST工具和Genbank的BLAST工具进行检索，同时按照寡核苷酸探针设计的一般原则进行微调，尽量使每种细菌的探针序列与他种细菌的23S rRNA序列的同源性小于75％，探针连续同源的碱基数≤18个，使各探针的Tm值相差不过15℃、GC含量在50-70％、探针长度接近、避免单一碱基连续重复5次以上、探针分子内部互补碱基少于6bp。对备选探针进行筛选时，各种参数尽量控制在最佳范围，以保证打印在同一张芯片上的探针在相同的杂交、清洗条件下得到最佳的杂交效果。

步骤2：通用引物的设计

借助Primer Premier 5.0软件在设计出的上述36条候选探针序列的2个变异区域外侧的保守区设计了2对通用引物。12种目标细菌的14条代表23S rRNA序列的Biosun 2.0比对结果设计出的2对通用引物位置标记见图1和表2。

表2.两对PCR通用引物

^*以胸膜肺炎放线杆菌为参考序列，GenBank检索号为NC_009053。

表2的通用引物由赛百盛生物技术公司或军科院放射所合成，下游通用引物的5′端用荧光染料Cy3进行了标记。

步骤3筛选探针

以12种目标细菌的参考菌株(表1中带星号的13个菌株)的基因组DNA为模板，用步骤2中的通用引物分别进行PCR扩增，然后将其产物分别与杂交液混匀后与点有36条候选探针的基因芯片杂交、扫描及结果分析，扣除背景值，以探针的特异性和荧光信号的强度值(荧光信号强度由强到弱分别为白色，红色，黄色，绿色)作为最终筛选探针的指标。结果从36条候选探针中选出13条探针(大肠杆菌有2条)，作为该仔猪常见致病菌基因芯片的终选探针(表3)。终选探针与对应参考菌株PCR靶标的特异性杂交结果见图6。

表3.仔猪常见致病菌检测基因芯片终选探针序列

特异性探针由专业公司采用标准亚磷酰胺化学方法在自动合成仪(ABI8909)上合成。全部的特异性探针在3’端进行氨基修饰，氨基基团与探针序列之间以间隔臂聚乙二醇磷酰化试剂相连，以排除杂交时的空间位阻来提高杂交荧光信号的强度。

合成完毕后，用浓氨水55℃作用15小时脱保护/切割，用OPC柱纯化后用紫外分光光度计定量，冻存备用。

步骤4制备低密度的基因芯片

将100μM的探针序列用2×点样液(6×SSC，0.1％SDS)稀释至终浓度50μM，取6μl转移至384孔板。用PixSys 5000芯片点样仪(Cartesian Technologies，Irvine，CA)将探针点到醛基片(Telechem)上，每点体积约为0.5nl，点心间距为500μm，点直径约为200μm，点样时保持湿度90％，温度23℃。点样后的芯片在使用前于室温放置至少24h，然后4℃保存待用。

终选探针在芯片上的布局见表4。芯片为7×8方阵，每条探针重复点3次。芯片上还点有定位标记链(Cy3标记的下游通用引物23S-R1 and R2的反向互补链序列)、阳性对照探针(PP，未标记的下游通用引物23S-R1的反向互补链序列)、阴性对照探针(NP，未标记的一段植物基因序列)和空白对照(灭菌双蒸水)。

表4.终选13条探针的矩阵图

实施例2.引物通用性检验

步骤1.提取DNA

取表1中12种目标细菌(即表1带星号的参考菌株)的适量培养物，用天根公司细菌基因组试剂盒提取细菌基因组DNA。DNA经紫外分光光度计测定纯度及浓度，用1ng/μl DNA做PCR。

或用煮沸法获得粗制DNA：取细菌悬液，12,000rpm离心2分钟，倒净上清或挑取菌落，加100-400μl双蒸水震荡悬浮，OD600为1.0-2.0，置沸水浴中煮沸或金属浴95-100℃加热10-15分钟，冰浴10分钟，12,000rpm离心2分钟，取2μl上清为PCR模板。

分别用每对实施例1设计的通用引物对12种致病菌的DNA做常规单重PCR，验证通用引物的通用性。反应体系：上下游通用引物各1μl(0.4uM)、dNTP 2μl(200uM)、模板1-2μl、Taq酶1U、10×Buffer2.5μl、MgCl₂ 1.5μl(1.5mM)，灭菌去离子水补足至25μl。PCR的反应程序：94℃/5min；94℃/30s、54℃/30s、72℃/30s，循环30次；72℃延伸8min。

PCR结果见图2、图3。第一对通用引物能扩增所有12种细菌的13个样品，第二对通用引物能扩增7种细菌的8个样品，说明两对通用引物联合扩增具有预期的通用性和针对性，后者扩增的7种细菌涵盖了A.suis、App和Pm探针相对应的细菌。

实施例3.优化扩增体系

不对称PCR的目的是通过多加荧光标记的下游通用引物，少加非荧光的上游通用引物获得大量的单链PCR产物，增加PCR产物与单链探针杂交的效率。

每对通用引物分别用2种致病菌的基因组DNA为模板进行了3次重复优化试验。在PCR反应体系中将下游通用引物的终浓度固定为1μM，加入系列稀释的上游通用引物，使其终浓度递减(1μM、0.2μM、0.1μM、0.05μM等)，即上下游通用引物比例呈1∶1、1∶5、1∶10...1∶60。

两对通用引物优化的结果为

23S-F1∶23S-R1为1∶10，23S-F2∶13S-R2为1∶30。两对通用引物之间的比例优化为1∶1。

两对通用引物比例优化杂交信号分析结果见图4和图5。

表5显示优化后的PCR反应体系。

表5.优化后的PCR反应体系

^*模板DNA采用试剂盒提取的基因组DNA(浓度为1ng/μl)。

将上述各组分加入无菌离心管中，混匀、瞬时离心，PCR反应程序如下

实施例4芯片的敏感性评价

杂交液：含5×SSC、2.5％甲酰胺和0.2％SDS

洗液A：含1×SSC和0.2％SDS

洗液B：0.2×SSC

洗液C：0.1×SSC

步骤1.芯片预处理和PCR扩增

实施例1制备的基因芯片用0.2％SDS清洗2次，接着以超纯水清洗2次，晾干后用于杂交。

用煮沸法提取猪肺炎支原体和胸膜肺炎放线杆菌的基因组DNA，将起始浓度为10ng/μl的DNA做10倍系列稀释至10fg/μl，以系列浓度的DNA为模板，采用实施例3的PCR优化程序及实施例1设计的通用引物进行PCR扩增。

步骤2.杂交及杂交后处理

步骤1扩增产物与实施例1获得的基因芯片杂交：PCR产物在98℃变性10min后冰浴10min，将变性的PCR产物与杂交液按1∶4混匀，取10μl转移至芯片反应区，芯片置于杂交盒内，连同杂交盒浸入42℃水浴中反应60分钟；杂交后的芯片依次在洗液A、洗液B和洗液C中于室温各洗涤1min。置室温晾干。

步骤3.杂交结果扫描

芯片用芯片扫描仪GenePix 4000B进行扫描，用GenePix Pro 4.0软件分析结果。共聚焦扫描仪GenePix 4000B(Axon Instrument)的参数设置：激发波长540nm，发射波长570nm扫描，PMT为580，Power(％)为33，产生分析精度为10μm的16位TIFF图像。

杂交结果见图7-1、7-2。芯片检测猪肺炎支原体和胸膜肺炎放线杆菌的灵敏度分别为10pg/μl和100fg/μl DNA。

实施例5芯片的特异性和临床分离株检验

以来自澳大利亚昆士兰州动物研究所和中国兽医微生物菌种保藏中心等单位的33株参考菌株(表1中不带星号的菌株)和来自患病仔猪的61个临床分离株培养物为样本，用煮沸法制备粗提DNA为PCR模板，实施例1设计的通用引物扩增，扩增产物用实施例1制得的基因芯片进行杂交鉴定，杂交步骤同实施例4。

芯片杂交结果显示：33份参考菌株的基因芯片检测结果与其菌株分类高度符合。图8-1列举了部分相关参考菌株的检测结果，其中鼠伤寒沙门氏菌为肠道沙门菌内的一个血清型，与肠道沙门菌探针呈阳性反应是正确的，它通常不是猪的感染菌或污染菌；金黄色葡萄球菌与表皮葡萄球菌探针呈阳性反应，它通常也不是猪的感染菌或污染菌。兽疫链球菌与猪链球菌探针呈阳性反应，因为兽疫链球菌是猪的另一种致病菌，所以有意忽略区分这2个种。

图8-2列举了临床分离株与芯片的杂交结果，61个临床分离株芯片检测结果与API生化或测序结果基本一致，有1份测序为腐生葡萄球菌的样品与表皮葡萄球菌探针杂交，2份API生化确认的阴沟肠杆菌和2份API生化确认的产气肠杆菌与大肠杆菌探针杂交。分析原因，腐生葡萄球菌23S rRNA序列上有与表皮葡萄球菌探针完全一致的序列，所以二者分不开；GenBank里没有阴沟肠杆菌和产气肠杆菌的23S rRNA，不知是否与大肠杆菌探针序列相近，生化试验表明它们是大肠杆菌的近亲，是人医院常见的污染菌和条件致病菌。因此，遇到大肠杆菌探针检测阳性时，需要具体分析，或进一步鉴定其是否具有致病性大肠杆菌的毒力基因。

从上述的临床样本验证实验中，说明本实验所建立的方法比较准确、可靠，对于一些检测呈阳性的菌种，由于该菌种下菌株中存在非致病菌，因此需要进一步具体分析是否是致病菌株。总体而言，本发明提供的基因芯片携带12种致病菌菌种的特异性片段，覆盖了目前大多数仔猪致病菌，可以应用于临床仔猪感染致病菌的鉴定或筛查，指导临床用药，达到快速控制疫病的目的。

实施例6芯片的重复性和保存期评价

用4℃保存了3天、3个月和6个月的3批芯片各取一张检测猪大肠杆菌和巴氏杆菌探针与相应PCR样品的杂交效果，步骤同实施例5，从信号强度看，不同批次和保存时间的芯片重复性好，检测效果稳定，见图9。

附录：

SEQUENCE LISTING

<110>北京市农林科学院

<120>一种检测仔猪常见致病菌的基因芯片、试剂盒及方法

<130>P09356/NLK

<160>17

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>26

<212>DNA

<213>猪放线杆菌探针

<400>1

atagcagtag acacagaaga acgagc 26

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>胸膜肺炎放线杆菌探针

<400>2

agtgataatg gttttgttag gagaat 26

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>多杀性巴氏杆菌探针

<400>3

ccgtactcga aagtatgtta gtggaactaa 30

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>副猪嗜血杆菌探针

<400>4

gtaggttgta agagtatacc tccga 25

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>猪链球菌探针

<400>5

taagcagtga ggtgtgatat gagtc 25

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>支气管败血波氏杆菌探针

<400>6

atgaaggggt cgcagagaat cggtg 25

<210>7

<211>26

<212>DNA

<213>表皮葡萄球菌探针

<400>7

gtttcctcga gtcgttgatt tcacac 26

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213>空肠弯曲菌探针

<400>8

ggatagaaga acccctgatg ccgtc 25

<210>9

<211>28

<212>DNA

<213>产气荚膜梭菌探针

<400>9

aaccgaagta catgattcca cgctgcca 28

<210>10

<211>26

<212>DNA

<213>猪肺炎支原体菌株探针

<400>10

agtaccgaat taaatgactc tctgtt 26

<210>11

<211>26

<212>DNA

<213>肠道沙门菌探针

<400>11

cacgtaggtg aagtgattta ctcatg 26

<210>12

<211>25

<212>DNA

<213>大肠杆菌探针1

<400>12

gtaggtgaag cgacttgctc gtgga 25

<210>13

<211>28

<212>DNA

<213>大肠杆菌探针2

<400>13

gctgatatgt aggagaagtc cctcgcgg 28

<210>14

<211>16

<212>DNA

<213>通用引物23S-F1

<400>14

aacdggttra tattcc 16

<210>15

<211>19

<212>DNA

<213>通用引物23S-R1

<400>15

gctaccttag gaccgttat 19

<210>16

<211>22

<212>DNA

<213>通用引物23S-F2

<400>16

gaggaaaaga aatcaaccga ga 22

<210>17

<211>22

<212>DNA

<213>通用引物23S-R2

<400>17

tggttcacta tcggtcaatc ag 22

Claims

1.一种检测仔猪致病菌的基因芯片，其特征在于芯片基质上设置有仔猪致病菌的23S rRNA特异性探针序列，所述仔猪致病菌及其23S rRNA特异性探针序列如下：

猪放线杆菌(A.suis)，ATAGCAGTAGACACAGAAGAACGAGC；

胸膜肺炎放线杆菌(A.pleuropneumoniae)，AGTGATAATGGTTTTGTTAGGAGAAT；

多杀性巴氏杆菌(P.multocida)，CCGTACTCGAAAGTATGTTAGTGGAACTAA；

副猪嗜血杆菌(H.parasuis)，GTAGGTTGTAAGAGTATACCTCCGA；

猪链球菌(Strep.suis)，TAAGCAGTGAGGTGTGATATGAGTC；

支气管败血波氏杆(Bordetella bronchiseptica)，ATGAAGGGGTCGCAGAGAATCGGTG；

表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，GTTTCCTCGAGTCGTTGATTTCACAC；

空肠弯曲菌(Campylobacter.jejuni)，GGATAGAAGAACCCCTGATGCCGTC；

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)，AACCGAAGTACATGATTCCACGCTGCCA；

猪肺炎支原体菌株(Mycoplasma hyopneumoniae)，

AGTACCGAATTAAATGACTCTCTGTT；

肠道沙门菌(Salmonella enterica)，CACGTAGGTGAAGTGATTTACTCATG；

大肠杆菌(Escherichia coli)，GTAGGTGAAGCGACTTGCTCGTGGA；和/或

大肠杆菌(Escherichia coli)，GCTGATATGTAGGAGAAGTCCCTCGCGG。

2.根据权利要求1所述的基因芯片，所述芯片基质采用固相载体醛基化玻片。

3.一种检测仔猪致病菌的基因芯片试剂盒，其特征在于包括如下两组寡核苷酸：

(1)权利要求1所述的基因芯片；

(2)如下两对通用引物：

23S-F1：5’AACDGGTTRATATTCC3’，

23S-R1：5’GCTACCTTAGGACCGTTAT3’；

23S-F2：5’GAGGAAAAGAAATCAACCGAGA3’，

23S-R2：5’TGGTTCACTATCGGTCAATCAG3’，

所述23S-R1与23S-R2的5’端用Cy3荧光标记。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，还包括除通用引物和DNA芯片之外的PCR试剂和杂交液，杂交液的成分为：5×SSC、2.5％甲酰胺和0.2％SDS。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，还包括PCR阴性对照模板和阳性对照模板，所述阴性对照模板为双蒸水，所述阳性对照模板为权利要求1所述的基因芯片上设置的任一种23S rRNA特异性探针序列所属的致病菌的基因组DNA。

6.一种检测仔猪致病菌的基因芯片方法，包括如下步骤：

(1)提取待测菌的基因组DNA，

(2)用权利要求3～5所述的任一试剂盒中所包括的通用引物扩增待测菌的基因组DNA。

(3)扩增产物与权利要求1所述的基因芯片杂交，

(4)杂交后处理及扫描结果。

7.根据权利要求6所述的方法，所述通用引物扩增待测菌的基因组DNA的PCR体系中，所述通用引物的终浓度比为：23S-R1：23S-F1等于10，23S-R2：23S-F2等于30；

8.根据权利要求6所述的方法，所述步骤(2)前先对所述基因芯片进行如下预处理：用0.2％SDS清洗2次，接着以双蒸水清洗2次，晾干后用于杂交。

9.根据权利要求6所述的方法，所述杂交步骤如下：扩增产物变性98℃10min后，冰浴10min，将变性的扩增产物与杂交液体积比1∶4混匀，取10μl转移至芯片反应区，将芯片置于杂交盒内，连同杂交盒浸入42℃水浴中反应60min。

10.根据权利要求6所述的方法，所述杂交后处理步骤为：杂交后的基因芯片依次在洗液A：1×SSC，0.2％SDS、洗液B：0.2×SSC和洗液C：0.1×SSC中于室温各洗涤1min。