CN103255214A

CN103255214A - 用于鉴别猪链球菌33种血清型的引物组合及检测试剂盒

Info

Publication number: CN103255214A
Application number: CN2013101237626A
Authority: CN
Inventors: 刘志杰; 郑翰; 白雪梅; 纪少博; 徐建国
Original assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Priority date: 2013-04-10
Filing date: 2013-04-10
Publication date: 2013-08-21
Anticipated expiration: 2033-04-10
Also published as: CN103255214B

Abstract

本发明提供了用于鉴别猪链球菌33种血清型的引物组合，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～62所示，利用多重PCR（mPCR）方法，采用本发明提供的引物组合，能够快速准确地检测待测菌是否属于猪链球菌，属于猪链球菌的哪个血清型。本发明还提供了鉴别猪链球菌33种血清型的试剂盒。本发明的检测方法及其试剂盒具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，具有良好的临床标本检测能力。

Description

用于鉴别猪链球菌33种血清型的引物组合及检测试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于检测猪链球菌33种血清型的引物组合和多重PCR（mPCR）检测方法，本发明还涉及利用该引物进行猪链球菌33种血清型检测的试剂盒。

背景技术

猪链球菌（Streptococcus suis）是一种世界性的可致猪疾病的最重要病原菌之一，同时它也是一种人兽共患病病原体。人感染猪链球菌的途径主要是接触病死猪,致病菌经破损皮肤和黏膜侵入，或食入未煮熟的病死猪肉而感染。临床上主要分为2个类型,即败血症型和脑膜炎型。另外，猪链球菌还可侵入人体的关节、眼睛和心脏等，引起化脓性关节炎,眼内炎,心内膜炎和休克等。在近些年，人感染猪链球菌的报道大量增加，而这些病例主要来自亚洲国家。在越南，猪链球菌成为最常见的成人细菌性脑膜炎的病原菌；在香港，猪链球菌认为是第三位最常见的经培养确认的导致社区获得性脑膜炎的病原体；在我国大陆，尤以1998年和2005年爆发的猪链球菌疫情最为严重。其中，2005年6月份我国四川省爆发的猪链球菌疫情中有215例病人，病死率将近20%。

目前，公认的猪链球菌的血清型有33种（1-31,33,1/2），在病猪中，血清2型为最常见的临床分离型，在亚洲国家，其次为3,4,5,7,8,和1/2型；在欧洲其次为9,1和14；而加拿大最常见的血清型为2,3和1/2型，其次为4,7和8。血清2型也是猪链球菌感染人的最常见型别，此外血清1,4,5,14,16,和24在人病例中也有报道。

血清分型不仅是用来了解猪链球菌某一次特定爆发的流行情况或者监测血清型流行情况的一种很重要并且很有价值的诊断方法，而且还对疫苗的研制有重要指导意义。目前，猪链球菌的血清型主要通过凝集实验和协同凝集实验来检测，但是这种方法是既耗时，又费力，且较为昂贵，结果判读主观差异较大。此外，有相当一部分自凝菌株的血清型是无法鉴定的。

猪链球菌的血清型主要取决于其荚膜（CPS）的抗原性，而荚膜的产生又受控于基因组中的荚膜合成基因簇（cps）。与传统的用抗血清检测血清型比较，基于血清型特异cps基因的PCR方法是一种简单，可靠，且经济的方法。有15种血清型1,14,2,1/2,3,4,5,7,8,9,10,16,19,23,和25型的cps基因簇已经公布，同时也针对cps基因发展了一些单重PCR和多重PCR方法来检测这些型别。但是由于缺乏对其他18种型别的序列信息的了解，导致这一分子分型方法还未行成一种完善的检测体系。之前的研究由于对各血清型的基因组信息了解不全，故血清型特异基因的认定只能通过southern杂交的方法来确定，此法也会受一些实验因素的影响，且也较为费时费力。临床实践中，迫切需要建立一套完善的检测体系能够方便、准确、快捷地检测猪链球菌33种血清型。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供用于鉴别猪链球菌33种血清型的靶基因。

本发明的第二个目的在于提供针对上述靶基因的特异性引物；

本发明的第三个目的在于提供鉴别猪链球菌33种血清型的试剂盒。

本发明对猪链球菌（Streptococcus suis）全部33种血清型的参考菌株进行了Illumina Solexa高通量全基因组测序。并且建立了基于cps型特异基因多糖聚合酶（wzy）的多重PCR（mPCR）检测猪链球菌血清型的方法。

对33株参考菌株的基因组DNA通过序列比对发现，在cps基因簇中前四个基因为所有血清型别所共有，血清型特异基因位于基因簇的中部或者尾部。每个型别包括的血清型特异基因有1（33型）到10（31型）个。这些血清型特异基因主要功能为糖基转移酶、乙酰转移酶、磷酸转移酶、多糖聚合酶（wzy）和翻转酶（wzx）。在这些血清型特异基因中，唯有wzy基因是共存于所有血清型菌株中。1与14型，2与1/2型的cps具有高度同源性，这和之前报道相同。所以除了1与14型，2与1/2型的wzy基因外，其他型别的wzy基因的差异度非常大（见图1）。

猪链球菌的CPS合成和其他链球菌一样被认为是wzy决定路径。这种CPS合成途径广泛存在于肺炎链球菌中。胞内的寡糖重复单位由翻转酶（Wzx）转运至胞外，不同的Wzy可催化寡糖重复单位形成不同的糖键连接。有研究证明group B Streptococcus(GBS)的血清Ia和III型就是有多糖聚合酶（Wzy）所决定。

因此本发明选择wzy基因作为建立mPCR检测猪链球菌33种血清型的引物设计的靶基因。

本发明提供了用于检测猪链球菌33种血清型的引物组合，其扩增的目标基因为wzy基因，和一个用于质控的管家基因thrA基因。

进一步地，本发明提供的检测猪链球菌33种血清型的引物组合中，引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～62所示。

进一步地，本发明的引物组合还包括一对针对管家基因thrA的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.63、64所示。

本发明提供了含有上述引物组合的检测试剂盒。

本发明的用于鉴别猪链球菌33种血清型的试剂盒，其mPCR工作程序为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30sec，58℃退火40sec，72℃延伸50sec，共30个循环；72℃延伸5min。

本发明的另一个创新之处在于，用本发明的试剂盒检测猪链球菌33种血清型时，按照A、B、C共3个mPCR检测体系进行，其中A体系的引物组合包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1～20所示的引物，B体系的引物组合包含核苷酸序列如SEQ ID NO.21～40所示的引物，C体系的引物组合包含核苷酸序列如SEQ ID NO.41～62所示的引物。

本发明试剂盒的A、B、C3个体系中均含有一对管家基因thrA的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.63、64所示。

本发明还提供了含有上述引物组合的诊断试剂。

本发明的有益效果在于：（1）本发明的多重PCR检测方法可以检测目前已知的所有33种猪链球菌血清型，使得猪链球菌分子血清分型方法成为一个完整的系统。（2）本发明专门针对常见血清型建立优先检测体系，即A组的mPCR体系。（3）通过高通量测序获得了猪链球菌所有血清型别的基因组序列，通过基因比对来确定血清型特异基因，选择了所有血清型别中共有的一个型特异基因wzy，针对该特异性基因设计引物，并创造性地将这些引物按照表1的分配方法分入3个PCR检测体系中，取得了特异性强、灵敏度高、准确率高的检测效果，同时简化了检测步骤，优化了检测程序。本发明的检测试剂盒可作为猪链球菌传统血清型鉴定方法的替代品，具有良好的市场应用前景。

附图说明

图1为以Neighbor-Joining算法，基于33个参考菌株wzy基因的关系树，线条长短表示非相似性程度。

图2为以A体系对血清1-10，14，1/2型菌株基因组的mPCR扩增电泳凝胶图，M为100bp DNA分子量标准，图上方数字代表血清型别。

图3为以B体系对血清11-21型(14除外)菌株基因组的mPCR扩增电泳凝胶图，M为100bp DNA分子量标准，图上方数字代表血清型别。

图4为以C体系对血清22-31,33型菌株基因组的mPCR扩增电泳凝胶图，M为100bp DNA分子量标准，图上方数字代表血清型别。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。若未特别指明，实施例中所用的生化试剂均为市售。

实施例1猪链球菌33种血清型特异基因的确定与引物的设计

1、33株参考菌株来源于国际猪链球菌菌株参比实验室（加拿大蒙特利尔大学Marcelo Gottschalk教授实验室）用于测序。菌株于哥伦比亚平板37°C培养过夜，挑单克隆菌落接种于THB培养基中，37℃震荡培养8h。

2、全基因组测序和cps基因簇的截取。全基因组DNA用WizardGenomic DNA Purification kit(Promega,Madison,USA)试剂盒提取和纯化。用Illumina Solexa GA IIx(Illumina,San Diego,CA)测序菌株基因组后，构建一个平均插入长度为500bp～2000bp的paired-end(PE)文库，以SOAP denovo(Release1.04)组装数据。根据以往对猪链球菌血清2型cps基因簇特征的描述来从全基因组序列中截取各血清型的cps基因簇。Artemis program(www.sanger.ac.uk)用来预测和注释cps开放读码框可读框(ORFs)BLAST and PSI-BLAST软件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)用来搜索GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank),(COG;www.ncbi.nlm.nih.gov/COG),和Pfam(pfam.sanger.ac.uk)蛋白数据库。cps基因的命名也参照于猪链球菌2型cps基因的命名方法，基因共同冠以cps前缀，后跟相应的血清型数字，其后以字母A到Z依次对cps基因命名。

TMHMM v2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)用来分析蛋白的疏水性跨膜结构域。通过分析证明在猪链球菌中，wzy基因的产物与之前其他菌中Wzy的疏水结构特性相似，均有8-14个疏水性跨膜结构域。

3、在cps基因簇中血清型特异基因的认定。用本地BLAST程序(downloaded from ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/

LATEST)，以各型的cps基因与33株全基因组数据库做序列比对。E-value设为10^-10（既可以避免同源性较低又不会屏蔽高同源序列的显示），其余参数为默认设置。cps基因簇中与其他型别无同源性的基因被认定为血清型特异性基因。

通过序列比对发现，在cps基因簇中前四个基因为所有血清型别所共有，型特异基因位于基因簇的中部或者尾部。每个型别包括的血清型特异基因有1（33型）到10（31型）个。这些血清型特异基因主要功能为糖基转移酶、乙酰转移酶、磷酸转移酶、多糖聚合酶（wzy）和翻转酶（wzx）。在这些血清型特异基因中，唯有wzy基因是共存于所有血清型菌株中。1与14型，2与1/2型的cps具有高度同源性，这和之前报道相同。所以除了1与14型，2与1/2型的wzy基因外，其他型别的wzy基因的差异度非常大（见图1）。

4、引物设计。为了能够使引物的同一条件和体系中的mPCR实验中进行工作，以Primer-BLAST program(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)进行引物设计，使每对引物拥有基本相近的共同特征。长度在20-23bp之间，退火温度在47.91-50.94℃同时也设计了一对针对被用作内部对照的管家基因thrA的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.63、64。各血清型wzy基因的GeneBank号和本发明用于鉴别猪链球菌33种血清型的引物序列见表1，以及序列表SEQ ID NO.1～62。

实施例2检测猪链球菌33种血清型mPCR方法的建立

采用实施例1的引物，以实施例1中的猪链球菌33种血清型参考菌株的基因组DNA为模板，以无核酸双蒸水为阴性对照，先对每对引物进行单重PCR扩增，检测其特异性。结果发现单重PCR中，每对引物对应的血清型具有100%的特异性，进而建立多重PCR方法检测猪链球菌33种血清型的体系。

考虑到实用性和操作简便性，本实施例将多重PCR方法分为A、B、C共3个检测体系，A体系用来检测临床分离株中最常见的血清型，1-10,14和1/2型；B体系检测11-21型（14型除外）；C体系检测22-31和33型。以33株参考菌株的DNA为模板对每组体系进行试验，凝胶电泳分析结果显示所有型别中均有针对内部对照基因thrA的120bp大小片段的阳性条带，而只有相应型别才会出现针对wzy基因的阳性条带，其他型别未见非特异扩增条带，同一组的wzy阳性条带可以依据片段大小不同而得到很好的区分（图2～4）。每条引物扩增的目的条带大小见表1中相应内容。检测结果与预期结果相符，因为1与14型，2与1/2型的cps基因的高度同源性，故1与14型，2与1/2型通过此法不能区分。

条件为94℃预变性5min；94℃变性30s,58℃退火40s,72℃延伸50s,30个循环；最后延伸72℃，5min。扩增结束后，琼脂糖凝胶电泳检测反应条带。各血清型目的条带的大小见表1。A与B体系均为20μL体系，2×Taq PCR Master Mix（北京博迈德提供）10μL，每条引物0.2μL（A体系B体系均为22条引物，C体系为24条引物,3个体系均含有thrA的引物），双蒸水4.6μL，模板1μL。C体系为20μL体系，2×Taq PCR Master Mix（北京博迈德提供）10μL，每条引物0.2μL，双蒸水4.2μL，模板1μL。

实施例3猪链球菌33种血清型的mPCR检测方法的特异性验证

以33株猪链球菌参考菌株为检测对象，结合以下菌株检测本发明mPCR方法的特异性：肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）46117-3和其他链球菌属包括6株肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）ATCC700657,ATCC700670,ATCC700676,ATCC700902,ATCC700906和ATCC49619,化脓链球菌（Streptococcus pyogenes）32003,血液链球菌（Streptococcus sanguis）32214,粪链球菌（Enterococcusfaecalis）32221,口腔链球菌（Streptococcus oralis）32231,牛链球菌（Streptococcus bovis）ATCC33317,巴黎链球菌（Streptococcuslutetiensis）033和2株原来被认为是猪链球菌32(strain EA1172.91)and34(strain92-2742)型的Streptococcus orisratti。

而对1株肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）和其他14株链球菌属菌株的检测中未有任何非特异扩增条带，显示了本发明提供的检测猪链球菌33种血清型的mPCR检测体系有较好的种属特异性。

实施例4猪链球菌33种血清型mPCR检测方法的临床应用

用了1株来自临床病人和67株分离自北京，江苏，四川屠宰场健康猪的猪链球菌分离株来验证本发明的mPCR方法的准确性。这些菌株的血清型均已通过血清凝集实验鉴定。检测结果见表2。

结果说明，用常规血清凝集实验确定了血清型的68株临床分离猪链球菌菌株，对其再用本发明的mPCR方法鉴定其血清型，二者结果的符合率为100%，进一步说明本发明设计的引物组合用于对猪链球菌33种血清型的mPCR检测具有非常优异的准确度。

表1本发明所用到的引物

表2用mPCR方法与用抗血清对68株临床分离株的血清型鉴定对比表

Claims

1.一种用于鉴别猪链球菌（Streptococcus suis）33种血清型的引物组合，其特征在于，其扩增的目标基因为wzy基因。

2.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～62所示。

3.含有权利要求1或2所述引物组合的检测试剂盒。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，其PCR工作程序为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30sec，58℃退火40sec，72℃延伸50sec，共30个循环；72℃延伸5min。

5.如权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，其包含A、B、C共3个PCR检测体系，A体系的引物组合包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1～20所示的引物，B体系的引物组合包含核苷酸序列如SEQ ID NO.21～40所示的引物，C体系的引物组合包含核苷酸序列如SEQ ID NO.41～62所示的引物。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，A、B、C这3个PCR检测体系均包含有一对针对管家基因thrA的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.63、64。

7.含有权利要求1或2所述引物组合的诊断试剂。

8.权利要求1或2所述的引物组合在鉴别链球菌33种血清型中的应用。