CN112280880A - 用于液相芯片多重PCR鉴别猪链球菌17种新cps型的引物组合及其检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及用于液相芯片多重PCR鉴别猪链球菌17种新cps型的引物组合及其检测试剂盒。本发明提供的用于液相芯片多重PCR鉴别猪链球菌17种新cps型的引物组合以wzy基因为检测靶标，包括17个特异性引物对。该引物组合及其液相芯片多重PCR检测方法具有特异性好、灵敏度高，分型结果的可重复性强、检测通量高的优势，极大地增强了现有检测方法对于猪链球菌的血清分型能力，节约了时间，提高了检测效率。

Description

用于液相芯片多重PCR鉴别猪链球菌17种新cps型的引物组合 及其检测试剂盒

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及用于液相芯片多重PCR鉴别猪链球菌17种新cps型的引物组合及其检测试剂盒。

背景技术

猪链球菌(Streptococcus suis)是一种世界性的可致猪疾病的最重要病原菌之一，同时它也是一种人兽共患病病原体。人感染猪链球菌的途径主要是接触病死猪后，致病菌经破损皮肤和黏膜侵入。猪链球菌在临床上主要分为2个类型，即败血症型和脑膜炎型。另外，猪链球菌还可侵入人体的关节、眼睛和心脏等，引起化脓性关节炎、眼内炎、心内膜炎和休克等。

血清分型不仅是用来了解猪链球菌某次特定暴发的流行情况或者监测血清型流行情况的一种很重要并且很有价值的诊断方法，而且还对疫苗的研制有重要指导意义。目前，公认的猪链球菌的血清型有33种(1-31,33,1/2)。目前，猪链球菌的血清型主要通过凝集实验和协同凝集实验检测，但是这种方法是既耗时，又费力，且较为昂贵，结果判读主观差异较大。此外，相当一部分菌株是无法通过凝集实验和协同凝集实验鉴定的。

猪链球菌的血清型主要取决于其荚膜(CPS)的抗原性，而荚膜的产生又受控于基因组中的荚膜合成基因簇(cps)。与传统的利用抗血清检测血清型的方法相比，基于血清型特异cps基因的PCR检测方法是一种简单、可靠、且经济的方法。随着监测菌株规模的不断增加，血清未分型菌株的比例逐年增加，对这些菌株的检测对于猪链球菌的诊断和流行病学监测具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于液相芯片多重PCR(mPCR)鉴别猪链球菌17种新cps型的引物组合，本发明还提供含有该引物组合的检测试剂盒。

具体地，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供用于液相芯片多重PCR鉴别猪链球菌17种新cps型的引物组合，所述引物组合以wzy基因为检测靶标，其包括含有以下核苷酸序列的引物对：SEQ IDNO.1-2，SEQ ID NO.3-4，SEQ ID NO.5-6，SEQ ID NO.7-8，SEQ ID NO.9-10，SEQ ID NO11-12，SEQ ID NO.13-14，SEQ ID NO.15-16，SEQ ID NO.17-18，SEQ ID NO.19-20，SEQ IDNO.21-22，SEQ ID NO.23-24，SEQ ID NO.25-26，SEQ ID NO.27-28，SEQ ID NO.29-30，SEQID NO.31-32，SEQ ID NO.33-34。

为便于液相芯片检测，以上所述的引物组合中，上游引物SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33所示核苷酸序列的5’端还含有与对应编号液相芯片微球的anti-TAG序列反向互补的TAG序列，同时，所述TAG序列与SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33所示核苷酸序列之间插入一个12碳胺基基团。

具体地，所述引物组合包括以下序列的引物对：SEQ ID NO.35-2，SEQ ID NO.36-4，SEQ ID NO.37-6，SEQ ID NO.38-8，SEQ ID NO.39-10，SEQ ID NO.40-12，SEQ ID NO.41-14，SEQ ID NO.42-16，SEQ ID NO.43-18，SEQ ID NO.44-20，SEQ ID NO.45-22，SEQ IDNO.46-24，SEQ ID NO.47-26，SEQ ID NO.48-28，SEQ ID NO.49-30，SEQ ID NO.50-32，SEQID NO.51-34。多重PCR的反应体系中会存在不同引物之间以及不同引物与模板之间的相互作用，对扩增效果产生影响，以上引物组合为发明人经大量筛选和验证得到，能够很好地保证多重PCR扩增的特异性和灵敏度。

为便于液相芯片检测，以上所述的引物组合中，下游引物SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34所示引物的5’端含有生物素标记。

第二方面，本发明提供所述引物组合在制备用于液相芯片多重PCR鉴别猪链球菌的试剂盒中的应用。

第三方面，本发明提供用于液相芯片多重PCR鉴别猪链球菌的试剂盒，该试剂盒含有所述引物组合。

优选地，所述试剂盒还含有管家基因thrA的扩增引物，其核苷酸序列如SEQ IDNO.52-53所示。

优选地，所述试剂盒还可包含用于多重PCR扩增的其他试剂，包括但不限于PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、dNTP、MgCl₂、阳性对照等。

以上所述的试剂盒在用于猪链球菌鉴别时，各引物的在多重PCR反应体系中的终浓度为0.2-0.3μM。

以上所述的试剂盒在用于猪链球菌鉴别时，多重PCR的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s,58℃退火40s，72℃延伸50s，30个循环；最后延伸72℃，10min。

第四方面，本发明提供一种液相芯片多重PCR鉴别猪链球菌的方法，该方法为：以待测样品的DNA为模板，利用以上所述的引物组合进行多重PCR，将PCR扩增产物与液相芯片微球结合形成PCR扩增产物-液相芯片微球-SAPE复合物，检测所述复合物的荧光强度，根据荧光强度判断待测样品的猪链球菌的cps分型情况。

本发明的有益效果在于：本发明对部分血清未分型的猪链球菌菌株进行了Illumina Solexa高通量全基因组测序，发现了17种猪链球菌新的cps型别。基于此，本发明开发了以cps型特异基因wzy为靶基因、用于液相芯片多重PCR鉴别猪链球菌17种新cps型的引物组合和检测试剂盒，并建立了的基于液相芯片的多重PCR检测方法。

本发明提供的引物组合、试剂盒和检测方法的特异性好、灵敏度高，分型结果的可重复性强，便于不同检测环境的结果比对，极大地增强了现有检测方法对于猪链球菌的血清分型能力；

本发明的检测方法具有检测通量高，可在一个反应中同时检测17种新的cps型别，节约了时间，提高了检测效率。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1猪链球菌17种新cps型的发现及其检测引物设计

1、菌株

276株血清未分型菌株用于测序。菌株于哥伦比亚平板37℃、5％CO₂培养过夜，挑单克隆菌落接种于THB培养基中，37℃、5％CO₂培养8h。利用以下菌株检测mPCR方法的特异性：Klebsiella pneumoniae 46117-3和62株其他链球菌属菌株，包括：6株Streptococcuspneumoniae(ATCC700657,ATCC700670,ATCC700676,ATCC700902,ATCC700906和ATCC49619)Streptococcus pyogenes 32003,Streptococcus sanguis 32214,Enterococcusfaecalis 32221,Streptococcus oralis 32231,Streptococcus bovis ATCC33317,Streptococcus lutetiensis 033，猪链球菌33种血清型标准菌株以及2株原来被认为是猪链球菌32(菌株EA1172.91)和34(菌株92-2742)型的Streptococcus orisratti。

2、全基因组测序和cps基因簇的截取

全基因组DNA用Wizard Genomic DNA Purification kit(Promega,Madison,USA)试剂盒提取和纯化。用Illumina Solexa GA IIx(Illumina,San Diego,CA)测序菌株基因组后，构建一个平均插入长度为500bp to 2000bp的paired-end(PE)文库，以SOAP denovo(Release 1.04)组装数据。根据以往对猪链球菌血清2型cps基因簇特征的描述从全基因组序列中截取各血清型的cps基因簇。Artemis program(www.sanger.ac.uk)用来预测和注释cps开放读码框可读框(ORFs)，BLAST和PSI-BLAST软件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)用来搜索GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank),Clusters ofOrthologous Groups(COG；www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)和Pfam(pfam.sanger.ac.uk)蛋白数据库。cps基因的命名也参照于猪链球菌2型cps基因的命名方法，基因共同冠以cps前缀，后跟相应的血清型数字，其后以字母A到Z依次对cps基因命名。

3、cps基因簇中血清型特异wzy基因的确定及新血清型分组

猪链球菌的CPS合成和其他链球菌一样被认为是wzy决定路径。这种CPS合成途径广泛存在于肺炎链球菌中。胞内的寡糖重复单位由翻转酶(Wzx)转运至胞外，不同的Wzy可催化寡糖重复单位形成不同的糖键连接。有研究证明group B Streptococcus(GBS)的血清Ia和III型就是由多糖聚合酶(Wzy)所决定。因此，wzy基因是非常理想的建立mPCR实验引物设计的靶基因。

利用TMHMM v2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析血清未分型菌株cps基因簇中蛋白的疏水性跨膜结构域。存在跨膜结构域的蛋白为wzx或wzy基因，用BLAST网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&BLAST_PROGRAMS＝megaBlast&PAGE_TYPE＝BlastSearch&SHOW_DEFAULTS＝on&LINK_LOC＝blasthome)进行序列及功能比对，最终确定wzy基因。用本地BLAST程序(downloaded fromftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/LATEST)，将全部wzy基因及33个已知血清型标准菌株wzy基因做序列两两比对。E-value设为10^-10，其余参数为默认设置。wzy基因氨基酸同源性超过95％认为属于同一血清型，经比对共发现17种新cps型，分别命名为NCL1-16和Chz。不同型别的wzy基因氨基酸同源性低于70％。

4、引物设计

为了能够使各引物在同一条件和体系中的mPCR实验中有效工作，以Primer-BLASTprogram(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)进行引物设计，使每对引物拥有基本相近的共同特征。长度在20-24bp之间，退火温度在49-52℃。同时也设计了一对被用作内部对照的管家基因thrA的引物。各引物的序列如表1所示。每个wzy基因的上游引物5’端增加一个特异的24bp的“TAG”序列，该序列与相应编号液相芯片微球的“anti-TAG”序列反向互补。“TAG”序列与上游引物间插入一个12碳胺基基团，有助于“TAG”序列与“anti-TAG”序列的共价结合。每个wzy基因下游引物5’端进行生物素标记。

表1用于猪链球菌鉴别的引物及其相关信息

注：*代表引物5’端有生物素标记。

实施例2液相芯片mPCR检测方法的建立

1、mPCR扩增

以17株新型cps型参考菌株的DNA为模板对每对引物进行单重PCR扩增来检测其特异性，在此基础上建立多重PCR检测方法。

用于mPCR扩增的PCR试剂为2×Taq PCR Master Mix(Biomed,Beijing,China)。每个PCR反应体系如下：Taq DNA polymerase:0.05units/μl；MgCl₂:4mM；dNTP:4mM和PCR缓冲液；表1中所示的每条鉴别引物的终浓度为0.2μM，管家基因引物的终浓度为0.3μM。

mPCR的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s,58℃退火40s,72℃延伸50s，30个循环；最后延伸72℃，10min。

2、PCR扩增产物-液相芯片微球-SAPE复合物的结合与检测

步骤1中扩增获得的标记生物素的血清特异的wzy基因扩增产物与相应编号微球的“anti-TAG”序列共价结合而被捕获。Luminex MagPlex-xTAG微球(Luminex公司)使用前振荡30s，使用1×Tm杂交缓冲液(0.2M NaCl，0.1M Tris，0.08％Triton X-100，pH 8.0,过滤除菌)将微球稀释成125个微球/μl的预混液。在每个PCR反应中，每种微球的数量为2500个。1×Tm杂交缓冲液将染料链霉亲和素(Streptavidin),R-藻红蛋白(R-Phycoerythrin)复合物(SAPE,Invitrogen公司)稀释为10μg/ml的预混液。将5μl PCR反应产物与20μl微球预混液和75μl SAPE预混液混匀后，40℃作用30分钟进行杂交反应，将扩增的PCR产物与相应的微球和SAPE特异结合，形成微球-PCR产物-SAPE复合物。

使用Luminex xPONENT 3.1软件(Luminex公司)在Bioplex 200(Bio-Rad)仪器上检测微球-PCR产物-SAPE复合物的荧光强度中位数值(median fluorescenceintensity，MFI)，检测参数设置为：每种微球检测100个，门限值为7366到19262，平台温度设为40℃。每种微球的MFI值超过200即判定为阳性。

实施例3检测方法的敏感度和特异性评价

1、敏感性评价

将17株新型cps型别参考菌株的DNA分别倍比稀释为10ng,1ng,100pg,10pg,1pg,0.5pg,100fg/μl。以上述不同倍比稀释的DNA为模板，利用实施例2的液相芯片多重PCR检测方法对各鉴别引物(表1所示)的检测灵敏度进行分析。

结果表明，本发明的液相芯片多重PCR检测方法(实施例2)的检测灵敏度达到0.5-20pg，多数引物的检测灵敏度达到0.5(相当于2×10²cfu)-1pg(相当于5×10²cfu)。

2、特异性评价

利用分离自北京，江苏，四川屠宰场健康猪的276株猪链球菌血清未分型菌株、33个猪链球菌血清型标准菌株以及62株非猪链球菌验证本发明的液相芯片多重PCR检测方法(实施例2)的特异性。

结果表明，在其他62株链球菌属菌株以及33株猪链球菌已知血清型的参考菌株的检测中均未有任何非特异扩增条带，而276株血清未分型菌株的分型结果与根据序列分析的cps基因簇分型结果完全吻合(表2)，表明本发明的检测方法具有较好的特异性。

表2 17种新cps型序列分析的分型结果与液相芯片多重PCR检测结果的比对

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所

<120> 用于液相芯片多重PCR鉴别猪链球菌17种新cps型的引物组合及其检测试剂盒

<130> KHP201117858.3

<160> 70

<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<212> DNA

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<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

actacttatt ctcaaactct aatagaaaat atgaagagcc atgtcg 46

<210> 53

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

gacaacgaac ataacagaaa cttc 24

<210> 54

<211> 1221

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

agtagaaaaa taaaaatttc gtcattagag ctgtatttga atattatagc aattatacta 60

attttagtgt ctgaaataaa tttttatact cttgagagca taaaaattta ttcggtgcta 120

acaatgacag gtatgattat ttcatatagc ttaggagtgc aatattttcg ctataaagta 180

agattggatc attttattat ttggctttca gtgatttact ttatgttttg tttttatgga 240

atattttttc taagatctgg aattttttct attgattcga tattatatcg gtattttgaa 300

aatattgctt tatatttatc agtttcgtct attttacgaa agaattacat aaaaataaca 360

attccatttg tccttgctgg attgttttca attctatatc tgatttctaa agagggggca 420

gatataatat caggaggcgt acgaataggt ggttccttaa gtggaaacgt aaactctgta 480

ggatttaact ttggtttggt tagttcttta ctggcatgga gatattgtat tactaagaat 540

aagcgcgaca tgattttatt tttagtattt ataattttta tgttgctgac aggatctaaa 600

aagactttat tttttttatt gactaattta tttatttttt attatcataa tcgtcataaa 660

gcgattattt ggttaaaggt catcctatcg ttcttttttt tatggattct aatttttaaa 720

attccctatt tttattcaat tatgggggtt cgaatcgagc agatgttgct gactttactg 780

ggggattcta atgcccttgc atattcttat tcaacggata tgcgtgaaaa aatgttagtt 840

gaatcattac atttttttct ggagcacccg atttttggag gtggatggaa ttattttggt 900

ttaaaaacaa ccttgaacta tgattattca catagtaaca ttgcggaatt atcggtaaca 960

tttggcttga tggggttatt cacatattac gctagataca tatataatat atatatatct 1020

ttgaatggtt tgagggattt agcaaataag aaaaaaaata atttttctct cttatctttt 1080

tctttagtta gtacaatatt gtttattgaa tggtctgcgg taactttctc cgcacaggtt 1140

ttttggtatc tacctattat tatttcctgc gcaatgttga atgaaatttt acagaagtct 1200

gaatccaaat agaagagtaa c 1221

<210> 55

<211> 1509

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

atgaaggagg cacttgtgtt aagaataaag aatgaattga aaggctacat acttctgttc 60

atggtactgt ctgtagtata tttctttgca tcactctatt ttattgatat ccatacacaa 120

aactataata actgtaaatt cttgattatg ctgttctcgt ggttgggctt ttttcaatta 180

ttttttacat taagcagtat aaaaagaaat tttggtagtt atatcagtct ctacagtatc 240

ttttatatgt ttctatttat atttagttat ggccagttta ttatgtgggc attgggcttt 300

cattatgatg ctgaaatgac tgtttctagg catgttcgct tcattgatga gaacacggta 360

gttcgtatac aagtgatgag cttacattta ttatcaattt ttcatttgtt tgcattgttt 420

gcttttggaa agaataattc aataaaaaat gaagtacagg atgttgtgtt tagggacata 480

tcaaggttga tagctactcc tatgattata gtttctttcg taataaatct ttatgtttcc 540

attgtaagtt ttggaactgc tgcaaataac ggatatcttg ctacattcga tataaatctt 600

cctgttttgt taaaatattt tagctatatg tttatacctg caatttttct aaatcttatt 660

gtgcacaatt tttcaaaaaa atcgtttttt attttgtcgg gaatatttct catttatgct 720

attccgcttg cgattgcagg tgatagagga agttggattt attttttggg gccatggcta 780

tggtgttatt tctttagggt agatatacag aaacaggtga tgactcctga taaatataag 840

tggcaacgaa agaaaaaaat ctttcggatg ctcatcattg ttttgacagc attatatgtg 900

tcttctgtat ttgtgtcggt cagggacgtc ggctattctg ttttagtgaa agaagatttt 960

gaattcactt gggaaagctt atataagcct ttcgtaaagc ctttctttga aatgggacaa 1020

tctgcacgga ttcttgggat tattattcaa gatggtcttg ataagacata taattatgga 1080

aatactttca tagctgatgt attggggatg actttatcga gtgtaaaaac atggtttggt 1140

tatcctgaat ggtatgtaga aaactggatg tcatctgatt atcttggtat ggtgaattat 1200

ggagtaggtt tttcatcatt tgctgaagct tatttgaatg gtggagtata tttttcatgg 1260

ttttatatgg caatatttgg gtggtttatt ggtagtttat taaatgtatc ctctgtacca 1320

ggacaatcaa gttctaagag agtgtttgta gcattatcag cgacatcggt gttaggaccg 1380

tctgttaggg ccacattaga tttttggttg agacagtttt tttggggagt tttacttctc 1440

ttgcttgtat gttggggaat tggaattttt gccaaagaaa gtatatctac gagagtagca 1500

cggtattag 1509

<210> 56

<211> 1230

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

ttgttgataa gtaattatag tcaacccacc tctagttcta agagccttag aggttccgaa 60

ataatatttt tatgtttttt gctaggtaaa ccattttatt tttttaattc aggaggtatt 120

caaccaagtg acatactttt gatattctct tttattgcat ttttatatga aaataattgg 180

aggataccat atgataaaaa agaaaaaaat tattcaatat ttttatgttg tattattttg 240

ataaatttat tttattgggg actatatttt atatcaggaa atggttggtc attccttcta 300

tcgacagtat attatctata caatacaatt gtaattttga tgtgtcgaca attttttaaa 360

gggaaacgct ttatagaaag tttgctattt attgttaagg gaggaatata cctccaattc 420

gcattttacg gtattgattt ttttgttcca ctctcgtttg ttgatgctag tgaattaagg 480

tacattggta catttaacga cccaaatcaa cttggttttt ttctactaac tagtatattt 540

atcattatta ttttaaacag attattaggt agaaaagaaa atttatttgt tcattgtttg 600

acgttagtac ttttatttgc aacatcttct acaggtatct ttttaggttt cgctttctta 660

tatttcttta tgtttgctat ttctgaaaat aaggaaaaaa ttattaaaca aattgttatt 720

ctcgttttgg catttttcat tctattttgt ttacattttg ctggtgtttt ccaatttttt 780

gataagatac aggatagctt tctgtatgaa agggtattgc agaaatttgg aagaggtttt 840

actataaatc aaaatcaaac ggaattgtca cttattcaag aaagaggaat tgataggata 900

attttatatc cagagtatct tttatttggt gcaggagaag gttatcctca gcgctttgct 960

ttaagtggta tttcaaatct tgaaatacat tcaacactct ttggcttgct gttttattat 1020

ggtttccttc cttttataat atttgtaaga tggatttgga taaacataag aaaatcaggt 1080

aaccttattt tttatatttt tgttccatta atgtttgaaa gtttaacttt agcaaatcac 1140

aggcaacctt atttttggat gttatttctt ctggcatctt tctttgacga tgatagtaga 1200

aattttagaa aatggagaat tgtaaaatga 1230

<210> 57

<211> 1299

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

ttgctttaca tattacttac gtcgattttc ttgcttatta ttcttgaatt aaaattgaga 60

aagaattttg ctactccaag tgtgctttta ctattatcat ttttaatggc aagtttattg 120

atttttatca attataagaa ttgggatata tctttatcgt ttcattttgt tgtatatgtg 180

ctaacggcca ttatttcttt tatattatcg actcatttag tacatagttt tttaaaaaat 240

agtagcaaga tcccctcgtt atcattgcaa aagcttcaag tactatctag acctcgtgct 300

tcgttgatgc ttattatgac tgttgccttt tctatctata gcatattgta tattagacga 360

gtaggttttt cactagattt gacaacgata ttatctactg cctatagttc aaatgtatta 420

aatagtggct attctggtag ttttttagaa acacaaatgc taaaaataat tactggaatt 480

gcttatatta attattatca atttttatta tcaaaatttg ttgtaaagat gaatttttcg 540

caattcatta atttttataa tattgtatta tttttaataa cagcaacctt atcaactgat 600

cgaaatattc ttcttcgttt ttttatatat gcactagttc tttggatttt gtttttcttt 660

gatataaata aagagtcgat gaggaatatc aatttcaaga ttatcagaag tttagtgata 720

tatggaatcg ttatattgat atcgcttttt ttagcaggca gaataaaagg gtatgtttca 780

gattttcaac gttctattgg actttatggt ggttcaggtc ttaataattt taatcttttt 840

ttgaataatt ttaatggtca ggaattgcag tgggggagag taacttttaa cagtttacga 900

gtattagttc agacgttcct tggaatagag gaatatagtg gtttagctat gtttgatatc 960

cctatcgttt ttaaatcaag tacaggattt gtttatattt caaacgttta ttcagcttta 1020

agaccatttg tactagattt tggatatatt ggaatgttat tatttccggc gatggtaggt 1080

attttttttg aaatactgtt ttcaaccgct ataaaccgta agtttgattt ttcgtggatt 1140

ttttactcag caacggttta ttcccttatt tatttctcta tacaagaaca attttttgct 1200

cgaatgcatt tggggagcct atatgaaatt ttctggttga gtatttttta tttgtatatt 1260

aagtcaccta taaaaattaa attaaggagt aatgtatga 1299

<210> 58

<211> 1389

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

ttggaaaaaa atattatttt cagaatagga tttagtatct tatttctggt attaattatt 60

ttatcgcttt ggaaagggat taacgaagta tttacggcag tactaattgt ttggtttggg 120

gttgtttatt attgttttcg tgatttaccg aaacacttta cactcttctc ttttatgatt 180

acctttttca catttttatt aggtagagat gctacatatt tatttttaga tgcaagaagt 240

tttagaatta tttcagatga gtcagcaagt aatcatgcat attggtcaat attggtatcg 300

cttatatttg tatttttagc atattatttt actaaagcat cttccttgat aaggattaga 360

gaaatacagg ctcaacattc aattgattat atcgtggccg ttagagctgt agctaaatat 420

tctttttatt ttacgtacat atttttgatt attgctctga tatatcaagt tagatatgtt 480

ttgaatgttg gttaccttga atcttactct tccctagagg ctggagcagg aacgccaaat 540

tttatttcgc gtttgtcatc attttctcca tttttatttt ttatatttct agggacaaaa 600

ccaagtaaaa aagaggcttt ttggccaatt ctactgtatt ttgtttatgg catttctact 660

ttattaactg gtcaaagatt tccagttatt gcggtgactt tggttttgat gaattattat 720

gtattccgaa atagagagga gaagtggatt gaaaaatggc atattacagc gattctaatc 780

tctattccat tggtattatc tggtcttttt ttgatggatt atattcgact ttctaaagtt 840

gtagaatctg tgaatttcct tgattcaatc tttaatttct ttgccgttca gggaggttct 900

attaatgtaa taaagtatgc ttatctttat caggatagtc ttgcagaaac tcctttctat 960

tcctttaatt ctattaggag taatatatta aatattaatg agttttcagg taatactata 1020

caacatgcat tatacggttc ttcaatggca catagaatgt catacataat atacggcgag 1080

tacgcctaca ttcacggaag aggttctggc tctagctata ttgccgaatt gttccatgat 1140

tttggttatt taggaatcgc tataggaagc atgttttacg gatatctaat aaaaaaaatt 1200

agtttgatga aatttaatca tttctttaaa aatgcattcc aacttgcaat gttatctcca 1260

ctattcttgg cacccagagg cacatttgat agtgttattg gtcagccatt cagacgttca 1320

aatctttttg ttttgctcat ggtgtttatc gttgcaaaga ctttgtcaga tcgtaataga 1380

aaatactag 1389

<210> 59

<211> 1059

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

atggttgata gagtattgtg gttgatacgg gtactgttga gtattttcta tatttttaaa 60

gtgctttttt cttataaaat cgaaaagcta gatgtcttta ttgtggtatt tttaactagt 120

cagatactgt ctgcacagca gacggacaca ttgtatctag gatatctttc tgggcaaatt 180

acagcacttg ggctatacgc cttcttaaaa tataaattgt tgacccaacc agaagtagta 240

attaaaggta tttttagctt atttcttatt ttcattctct atcaaatttt cacccagctc 300

cgttttccaa ctggatttga tattttacat ccttatggtg atagtagaga atattttttg 360

gggcgaaaaa atgccctgac cccttatcta gtctttacaa tgggttgttt ttatctgctg 420

acaaataaaa tgagtcgaag actatcctat tctgaaataa tatttttaat tttaggtagc 480

tttgtgtcat tgttatctaa ttctagtacg accatacttt gttttgcctt atttgtcttc 540

tttagatttt ggggccttag ggacgtggtc agcaatgctt atttgaagat aacattgata 600

tcttatgcag ttttttcttt tttaatttta tctgcacaga gtcccttttt tagggttctt 660

actggtctat ttggaaagga cataacattt tctggaagac tgagtatttg gcaacaggca 720

atagcgttct ttaagcagaa tcctttgttt ggtaatgggt taaccttgaa ttttactccg 780

tggacaaatg gtgtagttgt gaatacagca cacaattatt tattggactt actagcacgt 840

tttggactga ttacgggaat tctttttatt ctattgttgg ttaattttgt tttaggtaaa 900

aatagaataa aaaataaaac tttatttgct atgttggttt gttacttata ttatatatta 960

atggaaataa gttcaaccag cttttattta gcattaatcg catgtatttt ttatgtgggt 1020

gtgcaagaaa gtagattgaa aaatgaaaaa aatatttaa 1059

<210> 60

<211> 1116

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

atgacaatat atgttctctt tttagcatat atcctcatat gtgccgtaat tatatacttc 60

caaaaaggcg atccagaaag aaagaataag atttttttga attatgtgtt tatagcaatg 120

tttctattgt attcactgcg agcaagttct gtaggaaggg atgtacctgg atatgaaaga 180

gcatatggat tagcaaatgt tgatttattt gcgggactac atatcgggaa ttttgaaaaa 240

ggctatctgt ttctcatgtg gatatgtaat aaattgaatc tttcttttca gtggtttttg 300

acattatgta atgcaattat tttgttcccg atatatcgct atatacgtaa atactctcag 360

aatacttttc tatccgtaat catttatgtt tgctatatat tctttgagtt taatttgacc 420

ggtcttcgcc aagcaatagc aacttcaatt gtattgatgg ctattatggt actgatagaa 480

tccaaacagg actggcttgg acttttgaaa tattgtttaa ttgtattatt ggcacccttg 540

tttcataccg gtgcatttgt tgcgctgttt tatttgccat ttcactttat gaaaaagttc 600

aaaacctata cattgtccat tatggtcact gctattgttt ttctggtagg tagaggctat 660

attatgggat ttgtcaaaaa cttctttgga aaggattcta tgaatgcaag tgccggactg 720

tatattggat tgaatatgct tttcttaatt ggacttgctg ttttatttat aattggtgga 780

aaaaacagag aaattggaga aagcaacaca tcggagggga atacttctgt aacagtcgag 840

gatactccta tgcaagttct tatggaaaag atgttttatt taagcattgc cgtactattc 900

ttgttcggtt ctgacacatc cgttagaagt ttcatgctgt tgaaccaagt aattatagtc 960

ttgcttccga atagcttgcc gtatattttt gaggaaaaat cacagcgaat agcaatctgg 1020

atttttacta ttttctttat aatatttttc tttataaata cgttacttcc aaataatttc 1080

gatattgtcc catataaatt cttctggcaa ttataa 1116

<210> 61

<211> 1206

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

atgaaatcaa agaacaactt agtagcagtg ttagcctggc ttctccccaa ttcttatgct 60

tttatagatg tattgaaggt attttacccg accattaatt tgcaaattgt aagttctttc 120

ttagcggcag tagctattct tctctttttt attcaaattt attataaaaa gtatgaatta 180

atgctttttc aagtagcttt gctatttatc gctttacttt actctacccg atttttttat 240

catgaaaatt ttgaattata tcaatctttt tacaattctt ttttgatacg ttcttttcca 300

gctatactag tagctatgat gttgtctcga tataatagga ttaaggaatt tataaagtgg 360

tcggaaccgt acatgttact ttatacccta gcggtattta taacaagctt tgctccccgt 420

aatagtatta tttcttatca agctttatct tactactcta tgaccgccta catgctaaca 480

atttttagtg ccgtttatcg taaaaatctt ttggcaaatg gtctaacatt tttcaaattt 540

cgttcgtgga cacctatttg ttatggtttg atgatagttc aattgtacac aatgctttat 600

ggtggtggtc ggggggcgtt tatactttgt attattttta cactaatctt tttcaagaaa 660

attttcactt cacctcgact ttttacagta tttcttatgt gtacgcttgt tttggtaata 720

ggaattattt tgactgatta tatagatatt tcccagatac taaacaatga tggtgtgcga 780

cgtctagtga atttctttgg gagatacgac cgtatttcag ggtaccaacg gcttgtactt 840

tatgaacgag cttgggaatc cattcaagaa agacctttgt taggttgggg aatcggatcg 900

actttattaa gatttaatgg ctattctcat aatatttttc tagatatctt gcatgataca 960

ggtctgatag gtctatctat tatggcattt ttgatgacga tttgtaccat tttctggtat 1020

aaaattcgta gcattgattg gaagattgcg ttgtttggat ttatgattat cgaaacaatg 1080

gtacatatga attttagcgg aagttatctt gcagatggtc gcttgtggtt ttggtttact 1140

tttatttatt gttactatag atggaagaag gatgaaaaaa atgaagttag caattctact 1200

atctga 1206

<210> 62

<211> 1245

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

atgaaaaaag ggaacatggc ttcggataaa atcatatgtg cattaattac ttttatgatt 60

atgtcttttt atatatttga aacagcatcc tggggtagat acgttctatt tgggattacg 120

attcttataa cattagttta tgtcgcaaat aattgtttta aattgccctt agtaataaat 180

aagtcatttc atcttcatat tgctatcttt gctctgtttt gctttgcgtc gtctatttgg 240

gcgtggaatc catttcaagc agtatcaaaa gggatgacag ttttttcaat attagtatgt 300

ttttcgttgt tctatccata ttttcaacaa aagcgaagta tagatttgtt attggatgct 360

tttatgtttt caggatatgg aatagctcta tataccgtcg catattacgg aacaagtggt 420

attgcggaaa tgctgaacgg aaatatacgt ttaggtaatg attttacaaa tgctaattct 480

attgggctta ttacggcgac atcatgcatc attcaatttt cttatctatt gagaaaagaa 540

aagaaaaaat atttgatttt cttggttccg tgcattatag ctcttgcgat ttctcagtct 600

cgtaaagcta tgattttcct tgttgttgga attgctttct taattatgtc caacggaagt 660

gttcgtggtt ctatcctaaa aaaggctttc aatatttttg ggggagtcat agcggtttat 720

cttttgatat attcgttatc gcaattagaa attttttctg gtgtatttca tagattcgag 780

actttgtttg aatcaattaa tggtacaaga gtagaagata taagatctgt atataggcga 840

attggaatgc agcaattcta taaaactcct atcttgggta taggaatagg aaactcatta 900

gaattactcg aaagtgttgg gcaaaggaga acttatttac attgtaattt tgtagaacta 960

ctttcgagtg ggggaattgt tgggtttatt atatattatt caatatattt taagctaatt 1020

gttgagctct ggaaatatag gaaatatcgt tttacaacga ccaacctgtg tatcgtccta 1080

ttgtttttga tgctaatcat ggattatgga atggtaacat actatgataa acagcaatac 1140

ctctatttta tgtgcttttt cttacaacta gaatttataa aagaagattg ctatacagat 1200

gtagatgtaa tagaaaagtc agaaaggtgc gaaaacaatg tatga 1245

<210> 63

<211> 1122

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

gtggctattt ttatatactt gtttttaatt tttattaatc tatttttaag tttcaaagat 60

tatatccatc cttttaacaa aaatagtaga cgggctttat gggggatagt aatattcagt 120

tttattataa tctatctatt cttatctgga tatagaaatt atagcggact ttctggtgat 180

ttatataatc tccaaactga gtatgaatat tatttaagaa ctggtaattc tatttatgaa 240

ggtggatata aaatatttat gggtgttgga aaggccttta ccctagaatt ttatacttgg 300

cgtgcaataa ttatattttt tgctttacta ttaaattttt attcaatcat caggtatgca 360

aagaatccgc acttagttat tgctttattt tttatatttc tgattattcc ctcagcggag 420

caacttcgca attttttagc tttttccttt tttcaagttg gaatgtcgca acttatatac 480

tcgactaaat caaataaata taagaatttc atattttctc tatttgtact aattgcaggt 540

tatgtacact cttcttttta tatttatatt gtaatactgc taattgataa aataacgttg 600

aaatacataa aaatattggc ttggtttgtg ttgttatttt gtgttgttat tttcctaaat 660

aacaataata tcccaggatt ttcaataata atcaattatt ttgaaaatag tagagtttct 720

aattatttaa atcagaatat tcgttttggg tttttactat atatgtttct tcacggtctt 780

tctctctata ttctttatgt tactatgtcg cttactcaaa agttgcaaat taaagattta 840

aaaattgata aagtgtttac tactaattta ttgttaataa tttttttccc cctactaatg 900

gtaaatggaa catttattcg gatatttaga aacattctat tactgaatta cttttccttt 960

ggtgaattct tatcactaag gtattttcat tcgaaaaagt taatattcgt cttaatgatc 1020

gttagtagtt gtgtgatgtg ggtctatttg acttacttct ttgcgaatac tccttatgca 1080

ctttattttc catttttttt agacaacata tactttcgtt aa 1122

<210> 64

<211> 1272

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

atgaaaataa atagatcatt aaatatagaa atcttattgc tttctgcagt aattattttt 60

ttgggtcaga tagcattaaa aaatgattca aatgctattc tgctcattgc cttaataatg 120

gtgggttttg cggcagctat tctcccacaa gataacttaa tgccatttat gctttgtatg 180

atagcaccaa atagattatt aacttatggt tcgatatctg caccaataat tattatatta 240

gttgccttgt ttaagggaaa tagatacctt catcaaccga aaaagttttt tttgagttcg 300

atggcgttga ttggatatac tattattaca ttatttatag gggaatcttt aatatttgat 360

gcaataaaaa ttgtagcggt attgttgttc tttattatgt atacaaattg tcaagatatt 420

cacacttcgt atgttaggta cactgttttt tgttcccttg gctgtttgtt atctgcgggc 480

ataactctac taataaataa aaattctatt tcagaagcgg ggagatttac aataaaaggc 540

tctgggcaaa atgttttagg tatcttgtgt gctattatgg caatcaatct attggttatt 600

gtattgaatt atgttaataa aaaaaagtta ttctatgttt ttctatcgac tatcttgtgt 660

ggaattggtt ttctgacagg ttcaagaagc tttttattag caattggcac ggggatattt 720

gggttagtaa taatgatgat ggtaaaacta gattttaaac gattgtttaa aattggtttc 780

atcatttctt tagttacttt tggtgctata tttgcagtta aatttagtag ttttataaat 840

aactattggg atttgataat gtatcgggta acgaaactac agaatgtgga tgtatctaat 900

ggtaggttcg atttatggga acaatatatt acgatattca gagaacaacc aatttatttt 960

tggtttggtg gattaagtat agatgattcg caagtgcaat atgtagcaca taatatgatc 1020

atagaacaaa tcgcatcatt tggggtaatt ggttcaattt ttattttgaa tttatatatt 1080

tcagcagttt tagttattaa aaaatattct aaatgtgaca ttaaaatatt ttcttttaca 1140

gtagtaccat tgattgcctt tttgggttct agtatggttt cacatacaat acttggtatt 1200

ccgcaaacaa caatgttatt tttgtgtata ttttcattat ttagttcaaa aagaacaggg 1260

ggagaattat ga 1272

<210> 65

<211> 825

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

ttgttatgta agatactatt atttacagaa acatcaaata tattggtgag agatttcggt 60

gtagttttaa acgctaatac cattggtatc cagtttgcaa tagcaattgt acttatgatt 120

tggttacaaa aagaaaaaca gattggattg acattggcaa gcgtatcaat ggtgattttt 180

ggtgcgggag tgattttaac aggttcgaag aaagcactat tatctatagc agtaggttta 240

gtagcaagct atttattcac atctgaaaat tttgttcgta agattaggaa tgcctctcta 300

ttattaatcg tagggcttgg aatattctat ctgataaagg ataatgagtt tatttattct 360

ataattggta ggcgattcca aggaatgttc aatggttttt ttctaggaaa gatgtatgct 420

gatgcaagta cttatgcacg aattagtgtt tcggaagtcg cattaatgta ttggagagag 480

cgtccttttt tgggatatgg tttaaatagc ttcgaggcaa ttacacaatt tggattctat 540

actcataata attacattca actacttttt gatgtaggat tgataggttt atttatatat 600

tacagtttgt ttgtttggat aatttggaaa ggaatccgta aaactattat ttactcagta 660

tctgaaatta ttctaccgtt ggttttgata atagtcgttt gtgatgtagg ctatgttagt 720

tatggagata ctttttttca aggaatgtta gcgtttatta gtgctataat agttttatta 780

aataataatc acagtattgt tgaaagtaat ttggaaaggt cataa 825

<210> 66

<211> 1443

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

atgcttgcta ttagattttc aaggaatagt ttatttcata cactatcttt ttcgattgta 60

tcaataattt tattacaagc tcttaacctc tatgtatcag attcggcaat taatttttcg 120

atcgttcaaa ttctctcagt tataactacc ttgtattttt tttattcatt atatacaatt 180

tctcgtgtag aaatgagaat gtttagtctg actagcatat taatgctcat tacttattta 240

tttaatttcg gacaaatgtt tttatggaca tttggtattc atacagaatt tgaattaggg 300

aaagttcctt tgttttccaa ctttccaact ccaagttcgg agcaaatata taatgctcta 360

ttcttttcat tatactgtta ctttgcaatg gttttaggaa tttgtactat tagagttttt 420

caaactaaag agaaaactag aactgttggg actaaaaata tgaatgaaga gcttttgaag 480

cagagtattt ataaagttag tatcttgcta ggtctaatcg tagtgccatt aactttttat 540

aaaatatttt taacgttatc ccaatctata agttatggat atatctcttt gtattattct 600

gatttttcaa tgaatcctct aatagcacgt tcagaagatt acttttttcc tgtaatagtc 660

ggtttattaa ttggaagcga gtataaaaag atcagaattg catatagttt attcgcatta 720

tatatgattt tattcctttt agctggggag cgtggtaatt ggttttacaa gcttattatt 780

ttagtgtata tgcataatat ttactataga aagattagtt ggcgtaaatt cttgagattt 840

gctgctatta gctatgtatt tttaattttt gttgggttta ttattaatgt acgaaatgag 900

ggattatcaa acatttcttt aaatgaacta gtgaacgcat acactattaa tcaaagtcct 960

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tttggacgag gagttttttc acaatttgga aatacatata tctcatcagc tctgacatct 1080

ttctcatcag cactggctac tcaattagga ataaatcatg tttacttggg taattatttg 1140

tcgcaaaatc tgctcaagat tcgctgggga acgggattta attttttttc tgaggccttt 1200

attaatgggg gatggtttgg tgctttttat ctgtacttat ttggtatgct gtttgcaatg 1260

cttattaata ataaaagtac aaaactaaat caatattcct caccagttgc ttgtgcgatt 1320

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ttatttacaa tattactgat tatagtagta aagaatacgt tatataaaag aatctcaact 1440

taa 1443

<210> 67

<211> 1263

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

atgatatata ttgttgtagc aatttttcta ttgttttcat ttattagagt tttaaacatt 60

ccattgacat cacctcctgc aattttttct gttatttgga gtgttttcat attcttctca 120

tacttgattt taagcgagag atatccattc actttttatg gtataacttg gatattctgt 180

agttgttttc tcctgtcttt aggatatgct tttagaattg agacaaaaag tacaaaaaca 240

aaagaaatgg aaagcagtgt gaattcagcc aatatttctt ggagtttgtt agcagtcttt 300

atttttctag gattgactgg ttttattttg agtgctgcaa agtatggtgt ttcattgaat 360

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tcaggatcaa gtgttggttc aagcacttta gaacaaattt taaattcatt tgtttatgtt 480

ttacccctat gtggagggta tagtttagtt tatgcaaatt ctgttaggaa aaaaatactt 540

ataatattga cagcagttcc gtcactatta tccatgctat taactagtgc aaagttggct 600

gttgtagctt acactatatt attttttgtc tcatactatg tctcgtattt atatctaaac 660

aaaaaattta tctctattaa ttataggaaa attttccaat ctttgttttt aggctatatt 720

ttgtatcaat tgttttatct aagtttttta ctgagaattg gtagtacctc tgcaagcatt 780

agtagaataa ttgttactaa attgggaatc tacgcctttg gacatgttca agcttttgat 840

ttatggctcc caatatatat gtcatcagat gccgaacttg gatttggagg aaatacattc 900

ttagcatttt catctttaat tggggtattg gataaaaagc aagggattta tgaattaata 960

agtggaagtt caactaatgt ttttactcaa ttccgaagtt tgattagtga ttttggaata 1020

ctatttggct tattagttat ttttatacta ggtatagtat taagaatttt ttataaaaat 1080

gttattaatt atagtagtaa attaattgta ctacaacagg tattgtttat ctctatactt 1140

ttttatctta tttattttat tgtttctcca tgggtctatc taacatttgt gttgactttt 1200

tttatctttt atttttattt agtagttgca tttcatttta gaattaagat aaaatttcgt 1260

taa 1263

<210> 68

<211> 1434

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 68

atgcagaaaa atctagtttt gaaaaatagt tttattttac tttcagcttt gatgattgta 60

gaaatgatat tagttattac tgcttatgtt aatcaatcag aaaatcttta tgtatatgct 120

attgttacga tgtggggaat tggaattatt tattgtctct tagatattta taatagagta 180

ttctttttta tttacctttt ggcttttttt aattttttaa ttggaagaag tcttttaata 240

attcttggta ttttcaagga accctatcgt tttactctcc aagagagcat ttcaggacaa 300

caaatagtat tatttagttt aattgtttta gtttcatcct atattctact aggtaaatcg 360

atatctagga atatgcaaat tatgaatgca gatagtgtta gtatacaaaa agttcgctta 420

gctagtaaag tgttattttt atcaactttt gtatttttag ttatttctgt tttaggaaca 480

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<210> 69

<211> 1218

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 69

atgtttaata tattactttt gtttttttat attttttctt ttagttttta taatggtggt 60

ttttttgatt cagcattgtt agttttaatt tttctttcta ttcacattat tataaatcaa 120

agttatagaa aaatggtgca aaggtatatt tctacaaaat atttcgttaa tatatttttg 180

ttgtacattg tattgaatat atggttttta ataattttat ttattaatga ttctgtagat 240

tttacttttt taaagacatt tgctaacatg tttcagactt gggtgactgg aggattacta 300

ttccaatatt attgtattca gaataaagaa aaagaaattg ttaatcaatt aatgataatt 360

tttgctgtac aaacactgat tcagtggtta gcattttctg tcccatccat aaaaacatta 420

ataaattata ctaaaagcta ttcgacgata cttaaaggga tgtcgtattc tggaattaga 480

gcgaatgcat tatcaggaag ttcatttttt ggattatctg cagcttatgc tattatatta 540

atactgtttg tttcgaataa aaatcaatta tttgtgaaaa aaccaacttt gaaatttgga 600

ctgtttttgt ttattttaac aggaggattt tttgctggac gtaccacttt tatgggtctt 660

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tatagtactc aagggactat agttatttct agtgttgaga gtctatcaga aatgtatttc 900

attccagaac tatcaacttg gttagtaggt gatggaaaat attctgtggc tactggttat 960

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ttggtattat ttacaatgca atttttattg atgcaggtaa ataaaggtaa agaaaagttt 1080

attaaaattt cgtgtcttat tgcattattg atgttaaatc taaaaggtga agtgatattc 1140

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gatagaaaat ctcgttag 1218

<210> 70

<211> 26876

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 70

atgaaaaaga gaagcggacg aagtaagtcg tccaagttca aattggtaaa ttttgcgctt 60

ttgggacttt atgccattac tctatgtttg ttcttagtga ctatgtatcg ctataacatc 120

ctagatttcc ggtatttaaa ctatattgtg acgcttttgc tagtcggagt ggcagtattg 180

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agtgagatta cagatgttcg tcagcttact agtattcttg ctccagccga atacgaccaa 420

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aaagtaaaaa aaatatatag tttcaaagtg actcagactg ttgaaacagc tactgagcag 660

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actggtttgg aagggtctat ccaaacagat ttgagcttag aaacaattat aggcttggta 1260

aatacccaat tagaatcagg aacacaattt acagtagagt cacaagcatt gacaggaaca 1320

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aaccaagata gtctggagca agcaaaggca gcgattcagt cagtattgga tggaaattaa 1440

aaaaatagga gaaaacatga ataatcaaga aatgaataca atcgaaattg atattttact 1500

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acattacggc aaaaaagcct aatttctcag ataacataag tttgataagt aggtattagt 2880

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gaaagcctga gtttgatagg cgaagcttat cgtcaaggtg ttcgctatat cgtagcgaca 3000

tctcatagac gaaaagggat gtttgaaaca ccagaaaaag ttatcatgac taactttctt 3060

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actgagtttg atatccgctt attcattatt tttaatcatt tcaatgattc tatggcagac 3960

ctttagttat cgtttcatct tagtgtcctt atttttgtcg tatgtaatgc tcattactcc 4020

gaggattgtt tggaaagtct tacatgagac gagaaaaaat gtcattcgaa agaaggatag 4080

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agagaagatt gttgaaatct gtaacactac aggagtgacc gtcaataata tgccgagcat 4380

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tgctaagttt acgcctaaac gcttgttgtt gcttggacat ggagaaaatt caatctatct 4620

cattcatcga gagttactgg aaaagtacca aggtaagatt gagttggtcc ctctcattgc 4680

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aaaaatattt gtgggtcgcg ttacaaataa gcaatcggac attgtcaatt catttatcaa 5400

tggattactc caaaaagata gaaatgaatt aaaagatatc ttgattgaat ttgcaaaaca 5460

agaataagaa agtaaaaaat atttttactt tcctagagtc taaatagtat ttagattcta 5520

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tacgattggt tttgaagaaa attcaaccat aaaggtggat gatattatcg aaacgaccaa 5760

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gataaaggat attcatgcta tcttgaagag aggaacctct gattctcgga agtcatggtt 5880

tcaagtcgga gactataagt cgtacccaaa tgaagttggc ggacgtgaaa cgactttgcc 5940

agaaaaagta gaatccgata tgcaagaatt gctaaacagc tatcaccgct tgcctgagat 6000

ttcctttgag gatattcttg actttcatgt tcgatttgaa cgcattcatc ccttccaaga 6060

tggtaacggg cgagtaggtc gattgattat gtttaaagaa tgtctcaaac atggccatgt 6120

cccctttatc atcggagatg acatgaagta tttttactat cgtggcttag ccgagtgggg 6180

agaacagaat ggtttcttat tagatacttg tctagccgca caagatcgat ttaaggacta 6240

tttagagtat tttaggattg aggattaagg attaaggaga ttggaatgta tccgattatt 6300

aagcgtattt tatctgttat tatttcaggg tgttccatta ttgttttaag tccagttcta 6360

ttattagttg cactggcaat caaactggat tcaaaaggtc cagtactatt taaacaaaaa 6420

cgagttggta agaataagaa atacttcatg atttataagt tccgttcaat gtatgtggat 6480

gcaccaagtg atatgccaac tcatttatta aaagatccga atgctatgat tactaaagta 6540

ggaggctttc ttcgaaaaac gagtttagat gagcttccgc aactatttaa cattttaaaa 6600

ggtgaaatgg ctattgtcgg accacgtcct gctttatgga atcaatatga ccttattgaa 6660

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ttgattttga aatagatacc ttggatttat tagagcctaa ctggaaagac tacgattttt 7020

cagggtatga ttctgttttt catgttgcag ggatagcaca tttttctaaa gacgaaagta 7080

aaaaagaact atattataaa gtaaatactg aactaactga gcatgttgcg aagattgcta 7140

agcaagcagg tgttggtcag tttatattta tgagtagcat tatcgtttat ggtgatagta 7200

cgagtgggga acgagttata actaaggata cccaacctgc accttctgac ttttatggcg 7260

acagtaaatt gcaagctgaa cagagactgg aaaagttagt gggcgataat tttagagttg 7320

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tacatggaaa gaaagtatgt ttgacaaaaa tatttaaccc aatcataaag tttttcttcc 7620

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tatgaaaatt gtaattgtaa attgctttga cacatatgaa cacagagtcg acctcttgct 7800

tgcttatttt ttatctaggg gagacgaagt ttcagttata gcctcaaatt ttaggcacat 7860

tgataaggta aaaagatttg ataaaaagaa acattatact tttgttgacg ctattcctta 7920

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aaagcaagca gcagaatata agaaaagaaa tccttgcacc aaattagtgt ttgatattat 8100

tgatatgtgg ccggaaacaa taccggccaa caaatttaag aatttctttt tgttaaaatt 8160

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ctctattcta tctggggtat catattggga tgcaaaatct ggtcaggttc taaacaaact 22320

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agataacttg gataagttga cagtgtataa gcgagatatt ccttcgaacg ttatatttga 22440

gattgataat cttgatgatt taggacagtt acaagaattt ttaagttccc atacctagtc 22500

atagagtagc tggattttcg gaactattcg aattaatgaa cgtattgctg atgtggtaca 22560

cgataatcgt atgaagaaaa cactgatttc agaaaaccgt attttcatat tttatatagt 22620

cttttagcaa aaatttatgc tataattagt ctgaatttga ggaattattc atgactaaac 22680

gtaaaaacca tgaaaataaa ttgaaaaaag catgtaacaa gaagggctct ttatcaactg 22740

tagtgggtag acgaaaagct aacacctaga gaggacgaaa ttcgttctct ctttttgtat 22800

gtacgacggg catgtcgtac atctgaggtg aaagtcctcc gtggacagta accgcccaat 22860

aacaaggtat ctatccactc actcactcct tcctccagta tactgttata aaaaacaaac 22920

tggaggattt tttatgtctc agcccatcgt cccattgact attcccaaat ctcgccgctt 22980

tgaaaagaaa aggtaaatgc ctcataacaa ggtacctatc caatcatctc attctccact 23040

atacttttta tttattgtga tattaatatt aagaataacc agttaaattg aagtgatgca 23100

aagcatttta atggaatagt ataggggtgt tgtttatcgt ttactcatgc tctgtaaaag 23160

tggaaaagat ttggctacca tgctataata tagctagaat attttccgaa taaataggta 23220

gagagaattt ctcaatcact ttatttggag gaaaaaaatg actaaacgtc gtcaggcagt 23280

cagtcccatg gctgatgtta ttgcaaaaaa gattttcaat gaccacgaaa ttaccattga 23340

ctttattgat acctttttag gttttcgtcc caaatctgtt cagatattga atgggactat 23400

cgcggatgta aaaaaagaaa ggactagaca ctttagtaca acggtagata ttttggctcg 23460

gttagaagat gggacacagg tcattatcga gattcaggtt gcctatcaaa atagttttat 23520

taagcgtttg tggacttatt cctgccaaca tttggtgaag gacttgccca atattcgtga 23580

gaaggtcacg cagacgcatg atatgtataa taaaatttct ccgatttatt cgattgcttt 23640

agtagcgagt aagtatttcg atgatgaaaa acctatacac agttttgtat tgactgaaaa 23700

agatagcggt caaatcttag aattaccatt tggtgaccag gaagaattaa agagggagtg 23760

ggaaagaact cgaccatcca tagaagagtt cgttttccca cccccgcaca gttgattagg 23820

tcagatttgg agtgtaaaac acgaacaaat ctgccaatca accactgcgc tgagatgttg 23880

acacaaaccc tgagaagtgc gctggacttt ttgcccagcc ttatcattga gctgaaaaag 23940

tttcgtaagg gtcgacttgg gaaaaatcaa cgccaatgga ttgaattttt tgcaaataga 24000

gaatttagtc aatcgacatc agatattatt gaaaaggcag agaatctgct aaacagaaat 24060

acatggacag aggaggaaat agaaatggta gatcaatggt tgcgtaatgc ttccaaccac 24120

tttggagaat tggaaagttc ttttatacgt ggtagaaatc gtggaaagga agaaggaaga 24180

gctgaaggtc tagagaaagg tctagaagaa ggaattctac aaaaaagttt agatgttgca 24240

caaaaattat tagctagagg tcttgacata gaggatgtgt tagaaataac aggactaact 24300

tcggaacagt tgactcgatc ttcgcaagaa catcagttct aggaggaaaa tacaaaatat 24360

atgaaacatt acgactactt agttgttggt gcagggctgt tcggtgcggt ctttgctcat 24420

gaggcagcta aaaagggtaa aaaaataaag gttatcgaaa aacgagacca cattgcaggt 24480

aacatctata caaaagaagt agaaggtatt caagtccatg aatatggcgc gcatattttc 24540

catacttctg aaaaagaaat ttgggattat gtgaatcagt ttgcggagtt caaccgctat 24600

acaaacacac cagtcgctaa ctacaagggt gagatttaca atcttccctt caacatgaat 24660

acctttaaca agctttgggg tgtggtgacc cctgctgaag cagcagcgaa gattgcagag 24720

caacgagctg tattgggagg taaaacacct gagaacttgg aagagcaagc catctcacta 24780

gttggtacag acatctatga aaaattgatc aagtcctaca ccgagaaaca atgggaaaag 24840

ccgtgtacgg agttacctgc cttcatcatc cgtcgcttgc ccgtgcgttt gacttatgat 24900

aataactact ttaacgatac ttatcaaggt attccaatcg gcggttacac gcagattgta 24960

gaaaaaatgt tggatcatga aaatatcgat gtggagacaa atgttgattt ctttgctaat 25020

aaggaagaat acttggcaaa ctatccaaaa gttgtcttta caggtatgat tgatgagttc 25080

tttgattatg agcttggtga attggaatat cgtagccttc gctttgaaac agaagttttg 25140

gatatggaaa actatcaagg gaatgcagtt gtcaactaca cagatagcga gacaccgttt 25200

actcgaatca tcgaacacaa acatttcgaa tttggtacac aagaaaaaac cattattacc 25260

cgtgagtatt cgaagacctg gaaacgaggt gatgagccat attatccagt caacagtgat 25320

cgcaacaaca aactctatac gacctacaag cgccttgcag agcagcaaga aaatgttatt 25380

tttggtgggc gtcttggtca ttatcgttac tacgatatgc accaggttat cggtgcggcc 25440

ttgcaatgtg tgagaaatga agttggggaa tgattttgag aagtcatcaa aaaaaccaga 25500

aattctggtt tttttgatta ttgaattgct gccaacaggt cagctgcttg ttgctcgagt 25560

tttgatagag tttcgtcaga taactccaat aaacctgttc cccatgcttc tggattgatg 25620

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tgtaggatag acggtccttt tggattggat aaatcgagcg aacgactgag ccaatcgaga 25800

gcatttttta cgatgcctgg gattgcatag ttatatactg gtgagaaaat ccagatagca 25860

tccacagcgt ctacttgtgc acgtagctct gcaatttcag gaaggatagg tgtctcgatg 25920

tcttggttga ataggggaat ttttgcaaga tcaatgtaag atacttgagc cttatcagcc 25980

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actaaaaaca atacgtttgc catgatggtc tccttttcat aaaaacataa atttagtata 26100

tcgtatttgt cttttgttgg caatcctagg tctgctggtt cttgaatttt ttaagtatct 26160

cggctaattg gtcttgttct tctgaactaa ggacagaaaa aatctctcca acgtgatcat 26220

aatgctctgg aaggattttt tcaatggttt cgcgtccaag tggggtgaga gcaatcaagg 26280

aagcacgacg gtcatttgta tcaatagtct tgtagatata accatctcga atcatgtttt 26340

ttataacgac agtcatgttg ccagaagtac ttaataattt atcaattaag tcttgaatcc 26400

gcagatttcc tttgttgtag agtgcctcca tcactccaaa ctgacaaact gtcagtccgt 26460

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ctagactgtg aagtgcatgc ttgttctcgt ttaaagattg ttcaacagtt ctcatgagaa 26580

tattttagca ataaatagtt cggttatcaa gcaaaaaaag ttaaatccta tattcatagg 26640

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tctgtctgaa ggagaatgaa agtttattgg taaattctca aagtaagttc tagttcccgt 26760

ccttccagaa gttactttga gaaaactgca cagcatcaac agaatttagt ctcagactaa 26820

gttctgtttt tgactaaaaa tgttgatagt agtgagtttt agggttgaaa atgttg 26876

Claims (10)

1.用于液相芯片多重PCR鉴别猪链球菌17种新cps型的引物组合，其特征在于，所述引物组合以wzy基因为检测靶标，包括含有以下核苷酸序列的引物对：SEQ ID NO.1-2，SEQ IDNO.3-4，SEQ ID NO.5-6，SEQ ID NO.7-8，SEQ ID NO.9-10，SEQ ID NO11-12，SEQ IDNO.13-14，SEQ ID NO.15-16，SEQ ID NO.17-18，SEQ ID NO.19-20，SEQ ID NO.21-22，SEQID NO.23-24，SEQ ID NO.25-26，SEQ ID NO.27-28，SEQ ID NO.29-30，SEQ ID NO.31-32，SEQ ID NO.33-34。

2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33所示核苷酸序列的5’端还含有与对应编号液相芯片微球的anti-TAG序列反向互补的TAG序列，所述TAG序列与SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33所示核苷酸序列之间插入一个12碳胺基基团。

3.根据权利要求1或2所述的引物组合，其特征在于，其包括以下引物对：SEQ IDNO.35-2，SEQ ID NO.36-4，SEQ ID NO.37-6，SEQ ID NO.38-8，SEQ ID NO.39-10，SEQ IDNO.40-12，SEQ ID NO.41-14，SEQ ID NO.42-16，SEQ ID NO.43-18，SEQ ID NO.44-20，SEQID NO.45-22，SEQ ID NO.46-24，SEQ ID NO.47-26，SEQ ID NO.48-28，SEQ ID NO.49-30，SEQ ID NO.50-32，SEQ ID NO.51-34。

4.根据权利要求1～3任一项所述的引物组合，其特征在于，SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34所示引物的5’端含有生物素标记。

5.权利要求1～4任一项所述的引物组合在制备用于液相芯片多重PCR鉴别猪链球菌的试剂盒中的应用。

6.用于液相芯片多重PCR鉴别猪链球菌的试剂盒，其特征在于，其含有权利要求1～4任一项所述的引物组合。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有管家基因thrA的扩增引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.52-53所示。

8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中各引物的在多重PCR反应体系中的终浓度为0.2-0.3μM。

9.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组合进行多重PCR的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s,58℃退火40s，72℃延伸50s，30个循环；最后延伸72℃，10min。

10.一种液相芯片多重PCR鉴别猪链球菌的方法，其特征在于，以待测样品的DNA为模板，利用权利要求1～4任一项所述的引物组合进行多重PCR，将PCR扩增产物与液相芯片微球结合形成PCR扩增产物-液相芯片微球-SAPE复合物，检测所述复合物的荧光强度，根据荧光强度判断待测样品的猪链球菌的cps分型情况。