CN104673927A - 绿脓杆菌pcr检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明揭示了一种绿脓杆菌PCR检测试剂盒，包括含有引物A和荧光探针A的PCR反应液，引物A分为上游引物A和下游引物A，上游引物A的核苷酸序列为：5’-AGCGCAACTATCCCACTG-3’；下游引物A的核苷酸序列为：5’-GTAGCCGACGAACACATAG-3’；荧光探针A的核苷酸序列为：5’-FAM-GGGTGTTGAAGCTGACGT-BHQ-3’。本发明还揭示了一种绿脓杆菌PCR检测方法。本发明具有DNA提取效果好，操作简单、耗时短、结果客观可靠、灵敏度高和特异性高等优点。

Description

绿脓杆菌PCR检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，尤其是涉及一种绿脓杆菌PCR检测试剂盒及检测方法。

背景技术

绿脓杆菌(p.aeruginosa)或称铜绿色假单胞菌，是一种致病力较低但抗药性强的杆菌。广泛存在于自然界，是伤口感染较常见的一种细菌。能引起化脓性病变。感染后因脓汁和渗出液等病料呈绿色，故名。绿脓杆菌属假单胞菌属(pseudomonas)，广泛分布于自然界及正常人皮肤、肠道和呼吸道，是临床上较常见的条件致病菌之一。

绿脓杆菌感染可发生在人体任何部位和组织、常见于烧伤或创伤部位、中耳、角膜、尿道和呼吸道。也可引起心内膜炎、胃肠炎、脓胸甚至败血症。

现代化战争中的战伤主要是因为现代化火器造成的，因此常常伴有不同程度的烧伤，绿脓杆菌的感染非常普遍，一旦感染往往会使创伤迁延不愈，给部队战斗力和后勤供给带来极大压力和负担，准确早期确诊创伤是否合并绿脓杆菌感染可使创伤的治疗提供可靠依据。

本菌为需氧或兼性厌氧菌，在普通培养基上易于生长，培养适宜温度为35度，PH值为7.2。普通琼脂形成光滑，微隆起，边缘整齐波状的中等大菌落。由于产生水溶性的绿脓素(呈蓝绿色)和荧光素(呈黄绿色)，故能渗入培养基内，使培养基变为黄绿色。数日后，培养基的绿色逐渐变深，菌落表面呈现金属光泽。血液琼脂由于绿脓杆菌能产生绿脓酶，可将红细胞溶解，故菌落周围出现溶血环。

传统的绿脓杆菌检测主要依据该菌的生物学特征：革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素，此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在42℃条件下生长等。虽然传统检测方法具有一定的特异性和敏感性，但该方法操作起来费时耗力，在大规模样品检测是不易推广，另外在临床上还有可能延误诊断和治疗。因此，研究绿脓杆菌的快速检测方法具有十分重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种绿脓杆菌PCR检测试剂盒及检测方法，采用聚合酶链式反应(PCR)及Taqman荧光探针技术对绿脓杆菌基因中高保守特异性核酸序列进行扩增检测，以实现对绿脓杆菌的存在进行判断，进而实现对绿脓杆菌感染的辅助诊断。

为实现上述目的，本发明提出如下技术方案：一种绿脓杆菌PCR检测试剂盒，包括待测的DNA靶基因和PCR反应液，所述PCR反应液中包括所述引物A和荧光探针A，所述引物A分为上游引物A和下游引物A，

所述DNA靶基因的核苷酸序列为：

12 AGCGCAACTATCCCACTGGCGCGGAGTTCCTCGGCGACAGCGGCGACG，

61 TCAGCTTCAACACCCGCGGCACGCAGAACTGGACGGTGGAGCGGCTGCTC，

111 CAGGCGCACCGCCAACTGGAGGAGCGCGGCTATGTGTTCGTCGGCTAC；

所述上游引物A的核苷酸序列为：5’-AGCGCAACTATCCCACTG-3’；

所述下游引物A的核苷酸序列为：5’-GTAGCCGACGAACACATAG-3’；

所述荧光探针A的核苷酸序列为：5’-FAM-GGGTGTTGAAGCTGACGT-BHQ-3’。

优选地，还包括：

DNA提取液，按十二烷基硫酸钠1％、乙基苯基聚乙二醇0.5％浓度配制成所述DNA提取液，充分混匀后按1mL/管分装；

tap酶：浓度5u/ul，包括10×PCR Buffer、25mmol/L MgCl₂；

UNG酶：浓度＞1U/μl；

dNTPs：在室温下，按体积分别为100ul∶100ul∶100ul∶100ul∶550ul加入dATP、dCTP、dGTP、dUTP和超纯水，搅拌混匀；

阳性对照：106copies/mL～107copies/mL含所述DNA靶基因片段质粒，0.5mL/管分装；以及

阴性对照：组成为1×TE溶液。

优选地，所述1×TE溶液的配制：称取0.12114g的Tris，0.292g EDTA加入已含60mL蒸馏水的100mL烧杯中，振摇使之充分溶解，移入100mL的容量瓶中，用10mL蒸馏水洗涤烧杯3次并移入容量瓶中，用HCl调pH值为8.0，最后用蒸馏水定容到100ml，翻转容量瓶使之充分混匀。

优选地，还包括一GAPDH内参照基因，所述内参照基因包括引物B和荧光探针B，所述引物B分为上游引物B和下游引物B，

所述上游引物B的核苷酸序列为：5’-TATGACAACAGCCTCAAGAT-3’；

所述下游引物B的核苷酸序列为：5’-AGTCCTTCCACGATACCA-3’；

所述荧光探针B的核苷酸序列为：5’-HEX-CAGCAATGCCTCCTGCACCACCAACTGC-BHQ-3’。

优选地，所述荧光探针A的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ淬灭基团；所述荧光探针B的5’端标记HEX荧光基团，3’端标记BHQ淬灭基团。

本发明还揭示一种绿脓杆菌PCR检测方法，包括以下步骤：

S1，取一定量的所述PCR反应液、Taq UNG酶加入一个离心管中振荡混匀，瞬时离心后，分装到复数管PCR反应液管中，盖上管盖备用；

S2，制备待测DNA样本、阴性对照样本和阳性对照样本，并将制备好的所述待测样本、阳性对照样本和阴性对照样本瞬时离心后、干浴、离心，上清液用于PCR扩增；

S3，向准备好的所述PCR反应液管中分别加入所述上清液待测样品、阴性对照样品、阳性对照样品，盖紧管盖后瞬时离心后，将其放置于PCR仪上，编辑样本信息按照相应的循环参数进行扩增反应；

S4，根据相应的质控标准分析检测结果。

优选地，所述待测DNA样本、阴性对照样本和阳性对照样本的制备：

阴性对照样本：取出所述阴性对照，8000r/min离心，吸取100μl至1.5ml灭菌离心管中，加入20μl所述内参照；

阳性对照样本：取出所述阳性对照，8000r/min离心，吸取100μl至1.5ml灭菌离心管中，加入20μl所述内参照；

待测DNA样本：用生理盐水充分洗涤带有创面拭子的棉签，并挤干棉签，将盛有棉签洗涤液的离心管，13000r/min离心5min，弃上清，沉淀中加入所述DNA提取液，备用。

优选地，所述步骤S1：确定需要进行的反应管数n，将n×44.3μl绿脓杆菌PCR反应液，n×0.5μl热启动Taq酶和n×0.2μl UNG酶加入一个离心管中并振荡混匀，瞬时离心后，向每一个PCR反应液管中分装45μl，盖上管盖后转移到加样区，避光放于4℃冰箱备用。

优选地，所述循环参数包括：

第一阶段37℃，扩增2min；

94℃，扩增5min；

第二阶段94℃，扩增15s；

60℃，扩增40s；

循环40次。

优选地，所述质控标准为同时满足阳性质控和质控时，实验有效，否则无效，

所述阴性质控为：FAM通道Ct值＝40或“No Ct”或“undet.”，内参照HEX通道Ct值＜40；

所述阳性质控：FAM通道Ct值≤35，且有相应的对数增长曲线，内参照HEX通道Ct值≤40。

本发明的有益效果是：

1、本发明试剂盒具有DNA提取效果好，操作简单、耗时短(1～2小时)，结果客观可靠，仪器自动收集和分析数据，最低检出限为102copies/mL，具有灵敏度高和特异性高等优点。

2、本发明试剂盒使用了大肠杆菌磷酸脱氢酶基因(GAPDH基因)作为内参照基因，它在绿脓杆菌基因组和人类基因组中均无同源基因，因此可作为内参照以检测每次PCR反应中是否有PCR抑制物存在，从而确保PCR结果的可信性。

附图说明

图1是本发明绿脓杆菌PCR检测方法的流程示意图；

图2是本发明绿脓杆菌基因灵敏度检测结果示意图；

图3是本发明绿脓杆菌基因精密度结果示意图；

图4是本发明绿脓杆菌基因特异性结果示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整的描述。

本发明揭示了一种绿脓杆菌PCR检测试剂盒和检测方法，采用PCR反应及Taqman荧光探针技术对绿脓杆菌基因中高保守特异性核酸序列进行扩增检测，从而判断绿脓杆菌的存在与否，指导战地医生对绿脓杆菌感染的病人用药，帮助愈后判断。

内参照原理：本发明试剂盒设置了内参照，该内参照为含管家基因：磷酸脱氢酶基因(GAPDH基因)的质粒，GAPDH基因是一种管家基因，在人体细胞中能稳定表达，进行绿脓杆菌核酸提取时，能同步有效得到，因此可作为内参照以检测每次PCR反应中是否有PCR抑制物存在，从而确保PCR结果的可信性。当内参照结果为阳时，表示PCR反应体系以及操作正常；因此当目的基因结果为阴时，内参照结果为阳就显得十分重要了；但当目的基因结果为阳时，内参照的扩增曲线较目的基因扩增曲线要推迟，或是内参照结果为阴都是正常的；然而目的基因和内参照基因结果都为阴时，该实验视为无效，需再重复。

阳性对照原理：每次试验都需同时做阳性对照。阳性对照结果为阳，表明对靶基因的检测系统是正常的；而当结果为阴时，表明该次实验无效，需重复。

阴性对照原理：为证明有否污染存在，每次试验也需同时做阴性对照。阴性对照结果为阴，表明本次试验无污染；如结果为阳，则表明该次实验无效，需重复。

实施例1

本发明试剂盒的原材料及制备：

1)Tris：分析纯，含量99.7％，红外合格，pH(5％水)10.3～10.9，水份0.3％，熔点167～171℃，吸收系统合格，杂质最高含量合格。

2)MgCl₂：分析纯，含量不少于99％，水溶液反应合格，杂质最高含量合格。

3)EDTA：分析纯，为白色结晶状粉末，溶于水，溶液呈酸性，难溶于醇，含量不少于99.5％，水溶液反应合格，络合力试验合格，杂质最高含量合格。

4)HCl：分析纯。

5)纯化水：纯净水，经纯水机处理，电阻率18.2MΩ。

6)合成的引物和探针：

绿脓杆菌外毒素A基因保守序列，即DNA靶基因序列：

12 AGCGCAACTATCCCACTGGCGCGGAGTTCCTCGGCGACAGCGGCGACG，

61 TCAGCTTCAACACCCGCGGCACGCAGAACTGGACGGTGGAGCGGCTGCTC，

111 CAGGCGCACCGCCAACTGGAGGAGCGCGGCTATGTGTTCGTCGGCTAC。

绿脓杆菌外毒素A基因保守序列的最优引物A和荧光探针A序列：

上游引物A的核苷酸序列为：5’-AGCGCAACTATCCCACTG-3’。

下游引物A的核苷酸序列为：5’-GTAGCCGACGAACACATAG-3’。

荧光探针A的核苷酸序列为：5’-FAM-GGGTGTTGAAGCTGACGT-BHQ-3’。

其中，用于PCR反应的引物A，紫外检测结果A260nm：A280nm≥1.5，于-20℃保存；荧光探针A：在寡核苷酸5’端标记FAM，3’端标记BHQ，紫外检测结果A260nm：A280nm≥1.5，在FAM荧光素的激发波长494nm处有吸收峰，于-20℃保存。

GAPDH内参照基因的引物B、探针B序列组合如下：

上游引物B的核苷酸序列为：5’-TATGACAACAGCCTCAAGAT-3’。

下游引物B的核苷酸序列为：5’-AGTCCTTCCACGATACCA-3’。

荧光探针B的核苷酸序列为：5’-HEX-CAGCAATGCCTCCTGCACCACCAACTGC-BHQ-3’。

其中，GAPDH内参照基因的荧光探针B：在寡核苷酸5’端标记HEX，3’端标记BHQ，紫外检测结果A260nm：A280nm≥1.5，在HEX荧光素的激发波长555nm处有吸收峰，于-20℃保存。

引物和探针的稀释：

取出合成的引物和探针，在高速台式冷冻离心机上离心10000r/min，2min。取出待测引物和探针，加入计算好的超纯水稀释引物和探针到100μM，在涡旋混匀器上混合均匀，然后在手掌型离心机离心。

7)dNTPs：包括dATP、dCTP、dGTP、dUTP，HPLC纯，无DNase和RNase污染，于-20℃保存。dNTPs的配制如表1：

名称	dATP	dCTP	dGTP	dUTP	超纯水
						体积	100ul	100ul	100ul	100ul	550ul

表1

从冰柜中取出表1中所需试剂，平衡至室温。按表1中的比例加入所有试剂后用磁力搅拌器混匀，制备得到所需的dNTPs。

8)热启动Taq酶：浓度5u/ul，含10×PCR Buffer、25mmol/L MgCl2，具有DNA聚合酶活性，无3’-5’核酸外切酶活性及核酸内切酶活性；具热稳定性，94℃保温1小时后仍保持50％活性，于-20℃保存。

9)UNG酶：浓度＞1u/μl，具有尿嘧啶糖基化酶活性，无核酸外切酶及核酸内切酶活性，1u UNG在50℃、2min能降解至少103copies含dUTP的模板，使其不能产生扩增产物，于-20℃保存。

9)DNA提取液：按SDS(十二烷基硫酸钠)1％、NP-40(乙基苯基聚乙二醇)0.5％浓度配制成DNA提取液，充分混匀后按1mL/管分装。

10)1×TE缓冲溶液：称取0.12114g的Tris，0.292g的EDTA加入已含60mL蒸馏水的100mL烧杯中，振摇使之充分溶解，移入100mL的容量瓶中，用10mL蒸馏水洗涤烧杯3次并移入容量瓶中，用HCl调pH值为8.0，最后用蒸馏水定容到100ml，翻转容量瓶使之充分混匀。

11)内参照：组成为10³copies/mL含内参照基因质粒；临用经分光光度计精确定量的含内参照基因的高浓度质粒，用1×TE溶液作10倍梯度稀释至10³copies/mL作为内参照，0.5mL/管分装。

12)阳性对照：组成为10⁶copies/mL～10⁷copies/mL含目的片段质粒；临用经紫外分光光度计精确定量的含目的片段的高浓度质粒，用预先配制好的1×TE溶液作10倍梯度稀释至10⁶copies/mL～10⁷copies/mL作为阳性对照，0.5mL/管分装。阳性对照品为含目的基因的质粒。

13)阴性对照：组成为1×TE溶液，将配制好的1×TE作为阴性对照，1mL/管分装。

绿脓杆菌PCR反应液的配方如下表2：

表2

最后，试剂盒组成部分如表3：

表3

本发明还揭示了一种利用实施例1的试剂盒实现绿脓杆菌PCR检测方法。

实施例2

一、试剂准备：

1、将试剂盒从-20℃拿出，室温平衡20分钟。

2.将热启动Taq酶和UNG酶瞬时离心后，放于-20℃中备用。

3.确定需要进行的反应管数n后，取出绿脓杆菌的PCR反应液，将n×44.3μl绿脓杆菌PCR反应液，n×0.5μl热启动Taq酶和n×0.2μl UNG酶加入一个离心管中并振荡混匀，瞬时离心后，向每一个PCR反应管中分装45μl，盖上管盖后避光放于4℃冰箱备用。

4.将阳性对照、阴性对照、内参照放于4℃冰箱中备用。

二、待测样本处理：

适用标本类型：创面拭子

1、向1.5ml离心管中加入1ml生理盐水，充分洗涤带有创面拭子的棉签，并挤干棉签；

2、将盛有棉签洗涤液的1.5mL离心管，13000r/min离心5min；

3、弃上清，沉淀中加入100μL DNA提取液，备用。

三、样本DNA提取：

1、阴性对照样本制备：取出阴性对照，8000r/min离心数秒，吸取100μl至1.5ml灭菌离心管中，加入20μl内参照。

2、阳性对照样本制备：取出阳性对照，8000r/min离心数秒，吸取100μl至1.5ml灭菌离心管中，加入20μl内参照。

3、将待测样本、阳性对照样本和阴性对照样本瞬时离心后95℃干浴10min，13000r/min离心1min，上清液用于PCR扩增。

四、PCR反应

l、加样

向准备好的PCR反应液管中分别加入5μl上清液待测样品、阴性对照样品、阳性对照样品，盖紧管盖后瞬时低速离心。

2、PCR扩增

将准备好的PCR反应管放置于PCR仪上，编辑样本信息并按下表4的循环参数进行扩增反应。

五、检验结果的分析

1.结果分析条件设定

1.1 ABI7500基线设定：取2到最小ct值前3个循环值作为基线，阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，即阴性对照的Ct＝40或者“undet.”为准。

1.2 STRATAGENEMx3000P基线设定：选择“适合基线(Adaptivebaseline)”设定时的荧光信号。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，即Ct＝40或者“NoCt”为准。

2.质控标准

本试剂盒阴、阳性对照应同时满足以下条件，否则本次实验视为无效：

2.1 阴性质控：FAM通道Ct值＝40或“No Ct”或者“undet.”，内参照HEX通道Ct值＜40。

2.2 阳性质控：FAM通道Ct值≤35，且有较好的对数增长曲线，内参照HEX通道Ct值≤40。

3、检测结果

3.1 绿脓杆菌阴性(低于检测下限)：FAM通道Ct值＝40或者“NoCt”或者“undet.”，内参照HEX通道Ct值＜40。

3.2 绿脓杆菌阳性：FAM通道Ct值≤35，且有较好的对数增长曲线；内参照HEX通道Ct值≤40。

3.3 反应无效，应重新测定：FAM通道Ct值＝40或者“NoCt”或者“undet.”，内参照HEX通道Ct值＝40或者“NoCt”或者“Undet.”。

另外，通过对本发明试剂盒灵敏度和精密度进行研究，如图2、图3、图4所示，显示其具备以下性能：

图2：绿脓杆菌基因灵敏度参比品检测结果图，所测浓度依次为1.0×10⁷copies、ml、1.0×10⁶copies/ml、1.0×10⁵copies/ml、1.0×10⁴copies/ml、1.0×10³copies/ml、1.0×10²copies/ml，最低检出限为1.0×10²copies/ml。

图3：绿脓杆菌基因精密度检测结果图，依次1.0×10⁶copies/ml、1.0×10⁵copies/ml，各重复10次。内参照结果为阳，PCR反应体系以及操作正常，如图3所示本实验结果精密度达到100％。

图4：绿脓基因特异性结果，如图所测为1.0×10⁶copies/ml、1.0×10⁴copies/ml的阳性对照，大肠杆菌、肺炎杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌，结果如图4所示，除阳性对照外结果全为阴性。

因此，结合图2～图4可以看出，本试剂盒具有如下特点：

1、DNA提取效果好；

2、具有很高的准确性、灵敏度和特异性；

3、无须PCR后处理，完全闭管扩增和检测，采用了dUTP-UNG系统，有助于避免扩增产物的污染；

4、操作简单、耗时短(1～2小时)；

5、结果客观可靠，仪器自动收集和分析数据。

综上，经过我们前期的研究实验及最后的临床验证等证明，该产品明显优于目前临床主要采用的科玛嘉培养基鉴别方法，适于临床样本检测绿脓杆菌使用。

本发明的技术内容及技术特征已揭示如上，然而熟悉本领域的技术人员仍可能基于本发明的教示及揭示而作种种不背离本发明精神的替换及修饰，因此，本发明保护范围应不限于实施例所揭示的内容，而应包括各种不背离本发明的替换及修饰，并为本专利申请权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种绿脓杆菌PCR检测试剂盒，其特征在于：包括待测的DNA靶基因和PCR反应液，所述PCR反应液中包括所述引物A和荧光探针A，所述引物A分为上游引物A和下游引物A，

所述DNA靶基因的核苷酸序列为：

12 AGCGCAACTATCCCACTGGCGCGGAGTTCCTCGGCGACAGCGGCGACG，

61 TCAGCTTCAACACCCGCGGCACGCAGAACTGGACGGTGGAGCGGCTGCTC，

111 CAGGCGCACCGCCAACTGGAGGAGCGCGGCTATGTGTTCGTCGGCTAC；

所述上游引物A的核苷酸序列为：5’-AGCGCAACTATCCCACTG-3’；

所述下游引物A的核苷酸序列为：5’-GTAGCCGACGAACACATAG-3’；

所述荧光探针A的核苷酸序列为：5’-FAM-GGGTGTTGAAGCTGACGT-BHQ-3’。

2.根据权利要求1所述的绿脓杆菌PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括：

DNA提取液，按十二烷基硫酸钠1％、乙基苯基聚乙二醇0.5％浓度配制成所述DNA提取液，充分混匀后按1mL/管分装；

tap酶：浓度5u/u l，包括10×PCR Buffer、25mmol/L MgCl₂；

UNG酶：浓度＞1U/μl；

dNTPs：在室温下，按体积分别为100ul：100ul：100ul：100ul：550ul加入dATP、dCTP、dGTP、dUTP和超纯水，搅拌混匀；

阳性对照：106copies/mL～107copies/mL含所述DNA靶基因片段质粒，0.5mL/管分装；以及

阴性对照：组成为1×TE溶液。

3.根据权利要求2所述的绿脓杆菌PCR检测试剂盒，其特征在于，所述1×TE溶液的配制：称取0.12114g的Tris，0.292g EDTA加入已含60mL蒸馏水的100mL烧杯中，振摇使之充分溶解，移入100mL的容量瓶中，用10mL蒸馏水洗涤烧杯3次并移入容量瓶中，用HCl调pH值为8.0，最后用蒸馏水定容到100ml，翻转容量瓶使之充分混匀。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的绿脓杆菌PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括一GAPDH内参照基因，所述内参照基因包括引物B和荧光探针B，所述引物B分为上游引物B和下游引物B，

所述上游引物B的核苷酸序列为：5’-TATGACAACAGCCTCAAGAT-3’；

所述下游引物B的核苷酸序列为：5’-AGTCCTTCCACGATACCA-3’；

所述荧光探针B的核苷酸序列为：5’-HEX-CAGCAATGCCTCCTGCACCACCAACTGC-BHQ-3’。

5.根据权利要求4所述的绿脓杆菌PCR检测试剂盒，其特征在于，所述荧光探针A的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ淬灭基团；所述荧光探针B的5’端标记HEX荧光基团，3’端标记BHQ淬灭基团。

6.一种利用权利要求2～5任意一项所述的试剂盒检测绿脓杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，取一定量的所述PCR反应液、Taq UNG酶加入一个离心管中振荡混匀，瞬时离心后，分装到复数管PCR反应液管中，盖上管盖备用；

S2，制备待测DNA样本、阴性对照样本和阳性对照样本，并将制备好的所述待测样本、阳性对照样本和阴性对照样本瞬时离心后、干浴、离心，上清液用于PCR扩增；

S3，向准备好的所述PCR反应液管中分别加入所述上清液待测样品、阴性对照样品、阳性对照样品，盖紧管盖后瞬时离心后，将其放置于PCR仪上，编辑样本信息按照相应的循环参数进行扩增反应；

S4，根据相应的质控标准分析检测结果。

7.根据权利要求6所述的绿脓杆菌的检测方法，其特征在于，所述待测DNA样本、阴性对照样本和阳性对照样本的制备：

阴性对照样本：取出所述阴性对照，8000r/min离心，吸取100μl至1.5ml灭菌离心管中，加入20μl所述内参照；

阳性对照样本：取出所述阳性对照，8000r/min离心，吸取100μl至1.5ml灭菌离心管中，加入20μl所述内参照；

待测DNA样本：用生理盐水充分洗涤带有创面拭子的棉签，并挤干棉签，将盛有棉签洗涤液的离心管，13000r/min离心5min，弃上清，沉淀中加入所述DNA提取液，备用。

8.根据权利要求6所述的绿脓杆菌的检测方法，其特征在于，所述步骤S1：确定需要进行的反应管数n，将n×44.3μl绿脓杆菌PCR反应液，n×0.5μl热启动Taq酶和n×0.2μl UNG酶加入一个离心管中并振荡混匀，瞬时离心后，向每一个PCR反应液管中分装45μl，盖上管盖后转移到加样区，避光放于4℃冰箱备用。

9.根据权利要求6所述的绿脓杆菌的检测方法，其特征在于，所述循环参数包括：

第一阶段37℃，扩增2min；

        94℃，扩增5min；

第二阶段94℃，扩增15s；

        60℃，扩增40s；

循环40次。

10.根据权利要求6所述的绿脓杆菌的检测方法，其特征在于，所述质控标准为同时满足阳性质控和质控时，实验有效，否则无效，

所述阴性质控为：FAM通道Ct值＝40或“No Ct”或“undet.”，内参照HEX通道Ct值＜40；

所述阳性质控：FAM通道Ct值≤35，且有相应的对数增长曲线，内参照HEX通道Ct值≤40。