CN111235283B - 云杉花墨天牛特异性引物及快速分子检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了属于生物的分子检测领域的云杉花墨天牛特异性引物及其快速检测的方法。该方法提取天牛样本的基因组DNA，运用PCR的方法，经琼脂糖凝胶电泳显像，即可实现对云杉花墨天牛快速准确地鉴定。本发明完成整个鉴定仅需2‑3小时，与DNA条形码试剂盒检测技术相比，具有检测时间短，不需要第三方公司测序的优点。该发明能在不受虫态和地理种群的限制下完成鉴定工作，尤其针对卵、低龄幼虫和蛹。本发明可用于对木质包装材料、疫木、电缆盘、光缆盘中云杉花墨天牛的快速准确鉴定，防止媒介昆虫被人为传播到其他地区，能有效控制松材线虫的进一步传播和扩散。

Description

云杉花墨天牛特异性引物及快速分子检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及生物的分子检测，更具体涉及云杉花墨天牛特异性引物，以及利用该引物对云杉花墨天牛进行快速检测的方法。

背景技术

松材线虫病是由松材线虫寄生松树引起的具有毁灭性的检疫性森林病害。中国是目前遭受松材线虫病威胁最严重的国家，发生面积大，扩散速度快，我国所有松树树种都是松材线虫的潜在寄主；致病力强且寄主死亡速度快，松科树种感病后最快40d左右死亡，感病后若不采取有效措施，只需3-5年即可造成整片松林死亡，造成损失巨大，自松材线虫入侵我国的30年来，已致死数十亿株松树。松材线虫自身无法转移，其自然扩散需要借助媒介昆虫的自然活动，携带线虫的媒介昆虫还可以借助人为运输实现远距离的人为扩散。墨天牛属(Monochamus)昆虫是松树的蛀干害虫，同时，也是松材线虫最主要的传播媒介。目前，已知能携带松材线虫的昆虫全球共有46种，其中能作为松材线虫传播媒介的昆虫共13种，均为墨天牛属的昆虫，其中云杉花墨天牛已成为我国东北地区松材线虫的主要媒介昆虫，红松、樟子松、长白落叶松、日本落叶松和华北落叶松在我国已被证实为松材线虫的自然感病寄主。

目前，云杉花墨天牛的鉴定主要依据成虫的形态特征，与同域分布的同属天牛(如云杉大墨天牛、云杉小墨天牛、樟子松墨天牛等)的形态特征十分相似，在其形态学鉴定工作中，需要专业的昆虫分类学知识；同时，处于卵、低龄幼虫、蛹三个虫态下，云杉花墨天牛与其他天牛科昆虫的形态亦极其相似；并且，不同地理种群的云杉花墨天牛的形态特征也存在差异，无法准确进行种类鉴定。因此，在不受虫态和地理因素的限制下，如何实现对云杉花墨天牛快速准确地鉴定，已成为亟待解决的问题。

近些年，分子生物学的快速发展已为昆虫快速准确地鉴定提供了强有力的技术支撑。线粒体DNA严格母系遗传，其中的细胞色素氧化酶I基因(CO I)具有高度保守，结构稳定，无内含子且种间变异大的特点。因此，CO I基因常作为昆虫DNA条形码用于物种分类、鉴定和亲缘关系的研究。在墨天牛属昆虫鉴定，Koutroumpa等用线粒体基因中的CO I基因和28S基因研究了欧洲樟子松墨天牛(Monochamus galloprovincialis)和云杉小墨天牛(M.sutor)间的关系；安榆林等运用RAPD技术分析了松墨天牛、云杉大墨天牛、和云杉小墨天牛的DNA多态性，可对三种天牛幼虫进行准确鉴定；陈梦义等运用DNA条形码试剂盒(DNAbarcoding identification kit technology)检测技术，对墨天牛属8个种的CO I基因进行扩增，获得了云杉花墨天牛的标记性碱基位点(Specific bases)，以此作为鉴定云杉花墨天牛的依据。然而，上述方法均需要第三方公司参与测序，耗费时间较长，无法快速鉴定云杉花墨天牛。

发明内容

本发明的主要目的在于利用分子生物学手段，在短时间内快速、准确地对我国松材线虫的媒介昆虫——云杉花墨天牛，在不受虫态和地理种群的限制下完成鉴定工作，尤其针对除成虫和老熟幼虫以外其它虫态(卵、低龄幼虫和蛹)的鉴定工作。

本发明提供的技术方案是：一种用于检测云杉花墨天牛引物对，其上游引物核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，即5’-CTTTAATTGGAGATGACCAAATTTAT-3’，其下游引物核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示，即5’-GTTTATACCACTAGGTCGTATATTAATAACG-3’。

该引物对是采用PCR技术，经过大量的筛选实验得到，利用PCR扩增，可获得云杉花墨天牛的特异性DNA片段。

本发明还提供了一种用于检测云杉花墨天牛的试剂盒，其包含上述的引物对。进一步地，试剂盒还包含PCR缓冲液、dNTP、MgCl₂、TaqDNA聚合酶和ddH₂O。

本发明还提供了一种利用上述的引物对检测云杉花墨天牛的方法，提取待测物的基因组DNA作为模板，以权利要求1所述的引物对作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行检测，若出现394bp的DNA条带，则检测为云杉花墨天牛。

上述方法中，PCR扩增的反应程序为：94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行30个循环；最后72℃延伸2分钟，置于4℃下保存。

本发明还提供了一种利用所述引物对检测云杉花墨天牛的PCR反应体系，其包括2×Taq Plus PCR MasterMix(北京睿博兴科生物技术有限公司)12.5μL，上下游引物各1μL，基因组DNA模2μL，ddH₂O 8.5μL。

具体地，本发明所述的检测云杉花墨天牛的方法如下：

(1)提取云杉花墨天牛的DNA；

(2)SS-CO I种特异性引物的扩增，使用2×Taq Plus PCR MasterMix(北京睿博兴科生物技术有限公司)，利用上述PCR反应体系，PCR反应程序为：94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行30个循环；最后72℃延伸2分钟，置于4℃下保存。

(3)将扩增完成之后的原液通过1.5％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测(电压130V，时间25分钟，1×TAE作为电泳缓冲液)。制备琼脂凝胶时，加入浓缩的无毒染料10000×AidRed，使其在凝胶中的终浓度为1×，轻轻摇匀，倒胶，并用DL2000 DNA Marker标记，在Omega LumG显像仪器下拍照，若出现394bp的DNA条带，则检测为云杉花墨天牛。

与现有技术相比，本发明的有益效果：采用本发明的方法，可快速、大批量的检测云杉花墨天牛。本发明的检测方法完成整个鉴定仅需2-3小时，与DNA条形码试剂盒检测技术相比，具有检测时间短，不需要第三方公司测序的优点。该发明能在不受虫态和地理种群的限制下完成鉴定工作，尤其针对除成虫和老熟幼虫以外其它虫态(卵、低龄幼虫和蛹)。本发明可用于对木质包装材料、疫木、电缆盘、光缆盘中云杉花墨天牛的快速准确鉴定，防止媒介昆虫被人为传播到其他地区，能有效控制松材线虫的进一步传播和扩散。

附图说明

图1为七种天牛利用COⅠ通用引物PCR扩增产物的电泳图；其中M：DL2000 DNAmarker(从上至下2000,1000,750,500,250,100bp)；泳道：1-7泳道分别为云杉花墨天牛Monochamus saltuarius；云杉大墨天牛M.urussovi；云杉小墨天牛M.sutor；樟子松墨天牛M.galloprovincialis，松墨天牛M.alternatus，蓝墨天牛M.guerryi，麻斑墨天牛M.fascioguttatus；泳道8的模板为无菌水。

图2为七种天牛利用云杉花墨天牛特异性SS-COⅠ引物MsF/MsR扩增产物电泳图；其中M：DL2000 DNA marker(从上至下2000,1000,750,500,250,100bp)；泳道：1-7泳道分别为云杉花墨天牛Monochamus saltuarius；云杉大墨天牛M.urussovi；云杉小墨天牛M.sutor；樟子松墨天牛M.galloprovincialis，松墨天牛M.alternatus，蓝墨天牛M.guerryi，麻斑墨天牛M.fascioguttatus；泳道8的模板为无菌水。

图3为利用云杉花墨天牛特异性SS-CO I引物MsF/MsR对不同地理区系的云杉花墨天牛成虫扩增产物电泳图；其中M：DL2000 DNA marker(从上至下2000,1000,750,500,250,100bp)；泳道：1-5泳道分别代表来自丹东宽甸、抚顺苍什村、抚顺清原县苍石林场、白山市抚松县露水河镇、吉林帽儿山的云杉花墨天牛成虫；泳道6的模板为无菌水。

图4为特异性引物MsF/MsR扩增云杉花墨天牛成虫、蛹、幼虫、卵DNA样本电泳图；其中M：DL2000 DNA marker(从上至下2000,1000,750,500,250,100bp)；泳道：1-2泳道：云杉花墨天牛成虫；3-4泳道：云杉花墨天牛蛹；5-6泳道：云杉花墨天牛幼虫；7泳道：10个云杉花墨天牛卵；8泳道：5个卵；9泳道：1个卵；泳道10的模板为无菌水。

图5为琼脂糖凝胶电泳检测云杉花墨天牛种特异性引物MsF/MsR的灵敏度图；其中M：DL2000 DNA marker(从上至下2,000,1000,750,500,250,100bp)；泳道：1-6泳道分别代表20ng，2ng，200pg，20pg(条带较淡)，2pg，200fg的云杉花墨天牛基因组DNA；泳道7为阴性对照(20fg的云杉花墨天牛基因组DNA)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

实施例1云杉花墨天牛的引物对设计

1.昆虫基因组DNA的提取

利用DNA微量提取试剂盒提取采自国内9个地区墨天牛属7种天牛的基因组DNA，见表1。

表1样品信息表

昆虫基因组DNA的提取步骤如下：

(1)将整个虫体放入1.5ml离心管中，加入200ul buffer PBS，用研磨棒研磨充分研磨。

(2)加入150ul buffer PBS和0.9ul Rnase A后温和地研磨30s。

(3)收集350ul研磨好的组织匀浆并转入2ml离心管。如匀浆体积不足350ul，补充PBS至350ul。

(4)加入150ul buffer C-L和20ul proteinase K。立即旋涡震荡1min混合均匀。短暂离心后，将离心管置56℃水浴10min。

(5)加入350ul buffer P-D，漩涡震荡30s混合均匀，12000×g离心10min。

(6)将DNA制备管置于2ml离心管中，将上步中的混合液转移至制备管中，12000×g离心1min。

(7)弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，加入500ul buffer W1，12000×g离心1min。

(8)弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，加入700ul buffer W2，12000×g离心1min，以同样的方法，用700ul buffer W2再洗涤一次。

(9)弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，12000×g离心1min。

(10)弃滤液，将制备管置回原来的2ml离心管中，在制备管膜中央加100ulEluent，室温静置1min，12000×g离心1min洗脱DNA。

(11)DNA浓度检测，利用超微量分光光度计检测所提DNA的浓度。使用Nanodrop8000(Thermo公司)，检测前用先用去离子水对检测孔进行清洗，擦干后吸取1ul提取DNA时所用的洗脱缓冲液Eluent进行修正，修正完成后吸取1ul样品点入检测孔中，分别测定所提取的DNA浓度。

2.墨天牛属天牛CO I基因序列的扩增

根据文献报道，合成天牛科昆虫CO I基因序列扩增通用引物：

LCO1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’

HCO2198：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’

PCR扩增反应使用2×Taq Plus PCR MasterMix(北京睿博兴科生物技术有限公司)，总体系为25μl，各成分如表2所示：

表2 PCR反应体系

混匀后放入PCR仪中进行扩增，PCR反应程序为：94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行30个循环；最后72℃延伸2分钟，置于4℃下保存。将扩增完成之后的原液通过1.5％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测(电压130V，时间25分钟，1×TAE作为电泳缓冲液)。制备琼脂凝胶时，加入浓缩的无毒染料10000×AidRed，使其在凝胶中的终浓度为1×(例如，制备100ml的凝胶，加入染料10ul)，轻轻摇匀，倒胶，并用DL2000 DNA Marker标记以确定是否为目标片段。最后在Omega LumG显像仪器下选择波长302nm检测拍照。

3.近缘种多重序列对比及种特异性引物设计

将PCR产物送睿博兴科(北京)公司进行双向测序，得到CO I序列。使用BioEdit对序列进行拼接，去除冗余序列，将序列结果在GeneBank中进行Blastn序列比对。根据7种天牛的测序结果以及数据库中已公开的4个云杉花墨天牛的碱基序列和其他6种墨天牛属的天牛的碱基序列数据，共13种墨天牛的数据进行对比分析，运用软件Primer Primer 6.0软件设计云杉花墨天牛特异性SS-CO I引物1对(MsF/MsR)：

MsF：5’-CTTTAATTGGAGATGACCAAATTTAT-3’

MsR：5’-GTTTATACCACTAGGTCGTATATTAATAACG-3’

4.云杉花墨天牛SS-CO I引物的种特异性及灵敏度检验

以国内常见的7种墨天牛属内天牛的DNA为模板，以云杉花墨天牛DNA为阳性对照，以剩余其他6种墨天牛DNA和无菌水为阴性对照，检验云杉花墨天牛SS-CO I引物MsF/MsR的特异性。以不同浓度的云杉花墨天牛DNA标准品为模板，检验该引物的灵敏度。

(1)标准品的制备

将云杉花墨天牛的DNA进行浓度和纯度测定后，配置成20ng/μl浓度的母液。并将DNA母液按照(1:10)的比例依次稀释成20ng/μl、2ng/μl、200pg/μl、20pg/μl、2pg/μl、200fg/μl的标准液，20fg/μl为阴性对照。所有标准液储存于4℃备用。

(2)SS-CO I种特异性引物的扩增

PCR扩增反应使用2×Taq Plus PCR MasterMix(北京睿博兴科生物技术有限公司)，反应体系见表3，PCR反应程序为：94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行30个循环；最后72℃延伸2分钟，置于4℃下保存。将扩增完成之后的原液通过1.5％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测(电压130V，时间25分钟，1×TAE作为电泳缓冲液)。制备琼脂凝胶时，加入浓缩的无毒染料10000×AidRed，使其在凝胶中的终浓度为1×(例如，制备100ml的凝胶，加入染料10ul)，轻轻摇匀，倒胶，并用DL2000DNA Marker标记以确定是否为目标片段。最后在Omega LumG显像仪器下选择波长302nm检测拍照。

表3 PCR反应体系

实施例2引物对用于云杉花墨天牛的检测

1.云杉花墨天牛SS-CO I引物的种特异性检验

利用CO I通用引物进行PCR扩增，天牛均扩增约708bp的产物(见图1)，而利用本发明设计的云杉花墨天牛特异性SS-CO I引物MsF/MsR进行PCR，仅有云杉花墨天牛成功扩增，产物为394bp，对其它6种墨天牛属内天牛均不具有扩增能力(见图2)，表明该对引物为云杉花墨天牛的特异性引物。

利用云杉花墨天牛特异性SS-CO I引物MsF/MsR对不同地理区系(丹东宽甸、抚顺苍什村、抚顺清原县苍石林场、白山市抚松县露水河镇、吉林帽儿山)的云杉花墨天牛成虫进行PCR扩增，根据电泳结果显示，这5个地方的云杉花墨天牛所提取的DNA均能稳定的扩增出特异性片段(见图3)。

以云杉花墨天牛成虫、蛹、幼虫、卵的DNA为模板，利用特异性SS-CO I引物MsF/MsR进行PCR，根据电泳结果显示成虫、蛹、幼虫、卵所提取的DNA均能稳定扩增出特异性片段(见图4)。

2.云杉花墨天牛SS-CO I引物的灵敏度检验

利用不同浓度梯度的云杉花墨天牛DNA标准品进行特异性引物灵敏度检验(见图5)，PCR检验的最小检测浓度为20pg/μl的基因组DNA。

以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京林业大学

北京昌回林海生态科技有限公司

<120> 云杉花墨天牛特异性引物及快速分子检测方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctttaattgg agatgaccaa atttat 26

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtttatacca ctaggtcgta tattaataac g 31

Claims (5)

1.一种用于检测云杉花墨天牛引物对，其上游引物核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其下游引物核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

2.一种用于检测云杉花墨天牛的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的引物对。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包含PCR缓冲液、dNTP、MgCl₂、TaqDNA聚合酶和ddH₂O。

4.一种利用权利要求1所述的引物对检测云杉花墨天牛的方法，其特征在于，提取待测物的基因组DNA作为模板，以权利要求1所述的引物对作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行检测，若出现394bp的DNA条带，则检测为云杉花墨天牛。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行30个循环；最后72℃延伸2分钟，置于4℃下保存。

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