CN106636452A - 进境植物检疫性有害生物八点楔天牛的快速鉴定方法 - Google Patents

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徐卫
甘琴华
敖苏
尹新明
袁永革
蔡波
潘英文
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

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Abstract

本发明公开了一种进境植物检疫性有害生物八点楔天牛Saperda octopunctata Scopoli，1772的快速鉴定方法，包括以下步骤：A、提取八点楔天牛及楔天牛属近似种的DNA；B、对八点楔天牛及楔天牛属近似种DNA进行PCR扩增；C、PCR产物保存一段时间后测序；D、序列比对，确定楔天牛种类，本发明有效解决了非成虫虫态或虫体不完整时的检测鉴定问题，能快速识别和鉴定出八点楔天牛及其楔天牛属部分近似种，防止有害生物传入中国，以免对中国的农林生产和生态环境造成破坏，并能显著提高八点楔天牛的疫情截获率；采用的PCR扩增方法操作简单，有效避免蛋白氨基酸丢失，且稳定性好，表达量高。

Description

进境植物检疫性有害生物八点楔天牛的快速鉴定方法
技术领域
本发明涉及楔天牛鉴定技术领域，具体为进境植物检疫性有害生物八点楔天牛的快速鉴定方法。
背景技术
八点楔天牛Saperda octopunctata Scopoli，1772属昆虫纲、鞘翅目、天牛科、沟胫天牛亚科、楔天牛属。楔天牛属非中国种(Saperda spp.)为我国进境植物检疫性有害生物，八点楔天牛Saperda octopuntata Scopoli是我国未有分布的楔天牛属的非中国种。寄主：阔叶树，主要为害椴木(Tilia)，也对杨树(Populus)和榆树(Ulmus)造成为害。地理分布：奥地利、斯洛文尼亚、俄罗斯、瑞士、克罗地亚、波黑、捷克、斯洛伐克、马达维、法国、乌克兰、阿尔巴尼亚、波兰、罗马尼亚、南斯拉夫、意大利、匈牙利、德国、希腊、比利时、西班牙。生物学习性：八点楔天牛是蛀干害虫，主要在幼虫期为害树木。为害状主要为侵入孔、蛀屑、虫粪、羽化孔、幼虫的排粪孔、膨大的虫瘤、刻槽或空洞眼等。成虫出孔后补充营养，取食叶片和嫩梢造成掉叶断梢，影响树木景观和生长，并在枝条嫩梢和树干上咬食形成产卵刻槽。幼虫先在树皮下取食，后钻入木质部，在树干内部形成纵横交错的虫道。成虫和幼虫为害造成的刻槽、排粪孔、羽化孔在树干表面形成虫瘤或空洞眼，受害树干极易风折，引起幼树死亡，老树折断或断枝。
传统检疫鉴定方法为根据昆虫的外部形态特征鉴定和判别是否为禁止入境的检疫性有害生物；现有技术主要注重的是八点楔天牛的外部形态特征鉴别，当虫态不是适合形态鉴定的成虫或虫体不完整时，就无法鉴定准确到种。针对现有技术的缺点，本发明的分子生物学方法有效解决了非成虫虫态或虫体不完整时的检测鉴定问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种进境植物检疫性有害生物八点楔天牛的快速鉴定方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：进境植物检疫性有害生物八点楔天牛的快速鉴定方法，包括以下步骤：
A、提取八点楔天牛及楔天牛属DNA；
B、对八点楔天牛及楔天牛属DNA进行PCR扩增；
C、PCR产物保存一段时间后测序；
D、序列比对，确定楔天牛种类。
优选的，所述步骤B中PCR扩增方法包括以下步骤：
A、将对象PCR加入模版DNA2ul以及秋水仙素溶液中，并将混合物摇匀；
B、将秋水仙素溶液升温至85℃-95℃，使混合物变性，反应时间为50s-80s；之后对其进行链霉亲和素修饰；
C、对步骤B修饰后的混合液快速冷却至50℃-60℃进行退火处理；退火时间为30s-60s；
D、对步骤C退火后的混合液再次升温至80℃-90℃，时间为30s-60s，进行二次变性；
E、最后在磁富集单重PCR的基础之上，对以上三个个位点进行磁富集多重PCR扩增。
优选的，所述步骤C中保存液包括乙酸钠、乙二胺四乙酸二钠和糖原；所述保存液中乙酸钠的浓度为1mol/L-2mol/L，乙二胺四乙酸二钠的浓度为0.02mol/L-0.06mol/L，糖原的浓度为2g/L-6g/L。
优选的，所述步骤C中保存时间为30min-90min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明有效解决了非成虫虫态或虫体不完整时的检测鉴定问题，能快速识别和鉴定出八点楔天牛及其楔天牛属部分近似种，防止有害生物传入中国，以免对中国的农林生产和生态环境造成破坏，并能显著提高八点楔天牛的疫情截获率；本发明采用的PCR扩增方法操作简单，有效避免蛋白氨基酸丢失，且稳定性好，表达量高；另外本发明中采用的保存液能够提高PCR测序中间产物在保存后的测序成功率，进一步提高了鉴定效率。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
进境植物检疫性有害生物八点楔天牛的快速鉴定方法，包括以下步骤：
A、提取八点楔天牛及楔天牛属DNA；
B、对八点楔天牛及楔天牛属DNA进行PCR扩增；
C、PCR产物保存一段时间后测序；
D、序列比对，确定楔天牛种类。
本实施例中，步骤B中PCR扩增方法包括以下步骤：
A、将对象PCR加入模版DNA2ul以及秋水仙素溶液中，并将混合物摇匀；
B、将秋水仙素溶液升温至85℃，使混合物变性，反应时间为50s；之后对其进行链霉亲和素修饰；
C、对步骤B修饰后的混合液快速冷却至50℃进行退火处理；退火时间为30s；
D、对步骤C退火后的混合液再次升温至80℃，时间为30s，进行二次变性；
E、最后在磁富集单重PCR的基础之上，对以上三个个位点进行磁富集多重PCR扩增。
本实施例中，步骤C中保存液包括乙酸钠、乙二胺四乙酸二钠和糖原；所述保存液中乙酸钠的浓度为1mol/L，乙二胺四乙酸二钠的浓度为0.02mol/L，糖原的浓度为2g/L；保存时间为30min。
实施例二：
进境植物检疫性有害生物八点楔天牛的快速鉴定方法，包括以下步骤：
A、提取八点楔天牛及楔天牛属DNA；
B、对八点楔天牛及楔天牛属DNA进行PCR扩增；
C、PCR产物保存一段时间后测序；
D、序列比对，确定楔天牛种类。
本实施例中，步骤B中PCR扩增方法包括以下步骤：
A、将对象PCR加入模版DNA2ul以及秋水仙素溶液中，并将混合物摇匀；
B、将秋水仙素溶液升温至95℃，使混合物变性，反应时间为80s；之后对其进行链霉亲和素修饰；
C、对步骤B修饰后的混合液快速冷却至60℃进行退火处理；退火时间为60s；
D、对步骤C退火后的混合液再次升温至90℃，时间为60s，进行二次变性；
E、最后在磁富集单重PCR的基础之上，对以上三个个位点进行磁富集多重PCR扩增。
本实施例中，步骤C中保存液包括乙酸钠、乙二胺四乙酸二钠和糖原；所述保存液中乙酸钠的浓度为2mol/L，乙二胺四乙酸二钠的浓度为0.06mol/L，糖原的浓度为6g/L；保存时间为90min。
实施例三：
进境植物检疫性有害生物八点楔天牛的快速鉴定方法，包括以下步骤：
A、提取八点楔天牛及楔天牛属DNA；
B、对八点楔天牛及楔天牛属DNA进行PCR扩增；
C、PCR产物保存一段时间后测序；
D、序列比对，确定楔天牛种类。
本实施例中，步骤B中PCR扩增方法包括以下步骤：
A、将对象PCR加入模版DNA2ul以及秋水仙素溶液中，并将混合物摇匀；
B、将秋水仙素溶液升温至88℃，使混合物变性，反应时间为60s；之后对其进行链霉亲和素修饰；
C、对步骤B修饰后的混合液快速冷却至52℃进行退火处理；退火时间为35s；
D、对步骤C退火后的混合液再次升温至82℃，时间为35s，进行二次变性；
E、最后在磁富集单重PCR的基础之上，对以上三个个位点进行磁富集多重PCR扩增。
本实施例中，步骤C中保存液包括乙酸钠、乙二胺四乙酸二钠和糖原；所述保存液中乙酸钠的浓度为1.2mol/L，乙二胺四乙酸二钠的浓度为0.03mol/L，糖原的浓度为3g/L；保存时间为40min。
实施例四：
进境植物检疫性有害生物八点楔天牛的快速鉴定方法，包括以下步骤：
A、提取八点楔天牛及楔天牛属DNA；
B、对八点楔天牛及楔天牛属DNA进行PCR扩增；
C、PCR产物保存一段时间后测序；
D、序列比对，确定楔天牛种类。
本实施例中，步骤B中PCR扩增方法包括以下步骤：
A、将对象PCR加入模版DNA2ul以及秋水仙素溶液中，并将混合物摇匀；
B、将秋水仙素溶液升温至92℃，使混合物变性，反应时间为70s；之后对其进行链霉亲和素修饰；
C、对步骤B修饰后的混合液快速冷却至58℃进行退火处理；退火时间为50s；
D、对步骤C退火后的混合液再次升温至88℃，时间为50s，进行二次变性；
E、最后在磁富集单重PCR的基础之上，对以上三个个位点进行磁富集多重PCR扩增。
本实施例中，步骤C中保存液包括乙酸钠、乙二胺四乙酸二钠和糖原；所述保存液中乙酸钠的浓度为1.8mol/L，乙二胺四乙酸二钠的浓度为0.05mol/L，糖原的浓度为5g/L；保存时间为80min。
实施例五：
进境植物检疫性有害生物八点楔天牛的快速鉴定方法，包括以下步骤：
A、提取八点楔天牛及楔天牛属DNA；
B、对八点楔天牛及楔天牛属DNA进行PCR扩增；
C、PCR产物保存一段时间后测序；
D、序列比对，确定楔天牛种类。
本实施例中，步骤B中PCR扩增方法包括以下步骤：
A、将对象PCR加入模版DNA2ul以及秋水仙素溶液中，并将混合物摇匀；
B、将秋水仙素溶液升温至90℃，使混合物变性，反应时间为65s；之后对其进行链霉亲和素修饰；
C、对步骤B修饰后的混合液快速冷却至55℃进行退火处理；退火时间为45s；
D、对步骤C退火后的混合液再次升温至85℃，时间为45s，进行二次变性；
E、最后在磁富集单重PCR的基础之上，对以上三个个位点进行磁富集多重PCR扩增。
本实施例中，步骤C中保存液包括乙酸钠、乙二胺四乙酸二钠和糖原；所述保存液中乙酸钠的浓度为1.5mol/L，乙二胺四乙酸二钠的浓度为0.04mol/L，糖原的浓度为4g/L；保存时间为60min。
本发明有效解决了非成虫虫态或虫体不完整时的检测鉴定问题，能快速识别和鉴定出八点楔天牛及其楔天牛属部分近似种，防止有害生物传入中国，以免对中国的农林生产和生态环境造成破坏，并能显著提高八点楔天牛的疫情截获率；本发明采用的PCR扩增方法操作简单，有效避免蛋白氨基酸丢失，且稳定性好，表达量高；另外本发明中采用的保存液能够提高PCR测序中间产物在保存后的测序成功率，进一步提高了鉴定效率。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (4)

1.进境植物检疫性有害生物八点楔天牛的快速鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：
A、提取八点楔天牛及楔天牛属DNA；
B、对八点楔天牛及楔天牛属DNA进行PCR扩增；
C、PCR产物保存一段时间后测序；
D、序列比对，确定楔天牛种类。
2.根据权利要求1所述的进境植物检疫性有害生物八点楔天牛的快速鉴定方法，其特征在于：所述步骤B中PCR扩增方法包括以下步骤：
A、将对象PCR加入模版DNA2ul以及秋水仙素溶液中，并将混合物摇匀；
B、将秋水仙素溶液升温至85℃-95℃，使混合物变性，反应时间为50s-80s；之后对其进行链霉亲和素修饰；
C、对步骤B修饰后的混合液快速冷却至50℃-60℃进行退火处理；退火时间为30s-60s；
D、对步骤C退火后的混合液再次升温至80℃-90℃，时间为30s-60s，进行二次变性；
E、最后在磁富集单重PCR的基础之上，对以上三个个位点进行磁富集多重PCR扩增。
3.根据权利要求1所述的进境植物检疫性有害生物八点楔天牛的快速鉴定方法，其特征在于：所述步骤C中保存液包括乙酸钠、乙二胺四乙酸二钠和糖原；所述保存液中乙酸钠的浓度为1mol/L-2mol/L，乙二胺四乙酸二钠的浓度为0.02mol/L-0.06mol/L，糖原的浓度为2g/L-6g/L。
4.根据权利要求1所述的进境植物检疫性有害生物八点楔天牛的快速鉴定方法，其特征在于：所述步骤C中保存时间为30min-90min。
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