CN105441532A

CN105441532A - 一种天牛科幼虫不同家系的分子标记方法

Info

Publication number: CN105441532A
Application number: CN201410506471.XA
Authority: CN
Inventors: 顾忠盈; 吕飞
Original assignee: Complex Art Service Centre Of Granary Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau Of People's Republic Of China (prc)
Current assignee: Complex Art Service Centre Of Granary Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau Of People's Republic Of China (prc)
Priority date: 2014-09-28
Filing date: 2014-09-28
Publication date: 2016-03-30

Abstract

本发明公开了一种天牛科幼虫不同家系的分子标记方法，采用以下步骤实现：选用两对特异性引物进行PCR反应，从待测不同家系的天牛个体及亲本，采用DNA提取法提取基因组DNA；用基因组DNA为模板，所选的两对引物分别进行两轮PCR扩增；PCR产物用1.5%琼脂糖电泳检测，溴化乙锭染色后紫外线下观察并拍照电泳结果；用邻接法构建系统发育树。本发明对33种天牛COI基因的遗传距离表明：不同属间遗传距离明显大于同属间遗传距离，COI基因完全符合DNA条形码有效性的检验标准，该片段可以较好的区分天牛的不同属的不同种类，可用于天牛科的快速鉴定。

Description

一种天牛科幼虫不同家系的分子标记方法

技术领域

本发明属于分子标记技术护领域，尤其涉及一种天牛科幼虫不同家系的分子标记方法。

背景技术

天牛幼虫的分类研究主要集中在个体形态学领域，但由于幼虫分离鉴定资料极其缺乏，许多种类的幼虫形态迄今尚未描述；不同地理分布的同种天牛幼虫，形态有一定差异；亲缘关系较近的种类，形态非常相似，鉴定时容易混淆。因此，随着分子生物学的发展，核酸序列分析（DNAsequenceanalysis)被越来越多地用于天牛幼虫的分子鉴定，在出入境检验检疫工作中具有重要意义。

线粒体DNA(mtDNA)分子量较小，遵循母系遗传，进化速率快，是分子分类学重要的标记之一。其细胞色素氧化酶I、II(COI、COII)在近缘种及种下阶元的分类鉴定以及不同地理种群的遗传变异中应用较广。

随着分子生物学技术的飞速发展，分子标记技术被广泛应用于昆虫种群间的亲缘关系分析。COI基因在昆虫近缘种及种下阶元的分类系统研究中应用较广。安榆林等（2004）用mtDNA序列分析了光肩星天牛mtDNA的特点，得出mtDNA可用于天牛不同地理种群及近缘种的的鉴定和系统遗传分析。张凯（2013）将Z.incultumPascoe的mtDNACOI序列与来自幽天牛亚科、天牛亚科、沟腔天牛亚科的不同种天牛的mtDNACOI序列构建NJ系统树，发现在进化关系上与天牛亚科最近。

DNA条形码技术通常是利用线粒体COI5’端序列将物种鉴定到种水平的一种鉴定方法(Hebert等，2003)。Hebert等(2003)对包括脊椎动物和无脊椎动物动物界的COI基因序列比较分析得出：除腔肠动物外，98%同属物种的COI种间遗传距离差异平均为11.3%，不同属物种的COI遗传距离差异更大。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种天牛科幼虫不同家系的分子标记方法。本发明通过对口岸经常截获的天牛科COI基因进行扩增，同网上登录序列进行比较，分析其基因组成及变异，并构建系统发育树，研究其分类地位。以期在实际工作中辅助天牛科幼虫分类鉴定，为形态学分类做补充，为进一步的研究奠定基础。

技术方案：为了解决上述目的，本发明所采用的技术方案为：一种天牛科幼虫不同家系的分子标记方法，采用以下步骤实现：

1）选用两对特异性引物进行PCR反应，所述两对特异性引物为

上游引物J173：5’-TAACAGCACATGCTTTTGTA-3’

下游引物J1331：5’-GGATAGTCTGAGTATCGTCG-3’；

上游引物J1718：5’-GGAGGATTTGGAAATTGATTAGTTCC-3’

下游引物N2191：5’-CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3’；

2）从待测不同家系的天牛个体及亲本，采用DNA提取法提取基因组DNA；

3）用步骤2）的基因组DNA为模板，步骤1)所选的两对引物分别进行两轮PCR扩增；

4）对步骤3）的PCR产物用1.5%琼脂糖电泳检测，溴化乙锭染色后紫外线下观察并拍照电泳结果，剩余部分送上海金斯瑞有限公司纯化并测序；

5）获得的DNA序列先提交到GenBank数据库中，然后利用BLAST工具进行相似性检索，并确定片段方向；用GenDoc软件进行序列同源性比较；用MEGA5.0软件，计算各物种间的遗传距离，转换和颠换值及其比值，保守位点及变异位点等数值，用邻接法构建系统发育树，根据个体间的遗传距离聚类结果，区分来自不同家系的个体。

在步骤3）中，在进行PCR扩增时，PCR反应体系采用50μl标准反应体系，其中含有10×PCRBuffer（Mg^2＋）5μl，2.5mmol/L的dNTPs4μl，TaqDNA聚合酶0.4μl，cDNA模板2μl，上下游引物各1μl，后加ddH₂O补足50μl。

在步骤3）中，第一轮PCR反应的条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次，循环结束后再72℃延伸10min。

在步骤3）中，第二轮PCR反应的条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，47℃退火30s，72℃延伸45s，循环35次，循环结束后再72℃延伸10min。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：本发明对33种天牛COI基因的遗传距离表明：该片段COI基因在断眼天牛属3种天牛种间的遗传距离介于0.052~0.087间；其余天牛种间的遗传距离介于0.075~0.292间，不同属间遗传距离明显大于同属间遗传距离，COI基因完全符合DNA条形码有效性的检验标准，该片段可以较好的区分天牛的不同属的不同种类，可用于天牛科的快速鉴定。

附图说明

图1PCR方法特异性实验的电泳图；俄罗斯天牛幼虫扩增出了一条481bp的片段，参见泳道1和泳道2，其他天牛均未扩增出片段，参见泳道；

图2a和图2b天牛COI基因的遗传距离；

图3天牛COI序列构建NJ系统进化树。

具体实施方式

下面结合实验例详细阐述本发明。

实施例1：

1、试验材料：

所用天牛标本均为江苏出入境检验检疫局各口岸昆虫实验室多年截获的标本。5种标本来源和采集时间见表1。此外，选取Genbank登录的28种天牛COI基因序列进行比对，见表2。

表1实验标本名称和来源

表2Genbank下载序列信息

2、基因组总DNA的提取

采用GenMag动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒：将酒精浸泡过的虫体，选择适当大小的肌肉组织，无菌水清洗2-3次，沥干水分后，将组织进行研磨，加入适量的裂解液和蛋白酶K，55℃温浴，使得组织完全裂解。再加入磁珠和缓冲液，使DNA吸附到磁珠上，使用WashBuffer进行除杂，除杂完毕后，加入少量的ElutionBuffer，将DNA溶解，得到基因组DNA溶液，-20℃保存。

3、COI基因扩增及测序

PCR扩增采用巢式PCR，所用引物分别为：

第一轮：J173：5’-TAACAGCACATGCTTTTGTA-3’

J1331：5’-GGATAGTCTGAGTATCGTCG-3’

第二轮：J1718：5’-GGAGGATTTGGAAATTGATTAGTTCC-3’

N2191：5’-CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3’，均由上海金斯瑞有限公司合成。

PCR反应体系采用50μl标准反应体系，其中含有10×PCRBuffer（Mg^2＋）5μl，dNTPs（2.5mmol/L）4μl，TaqDNA聚合酶0.4μl，cDNA模板2μl，上下游引物各1μl，后加ddH₂O补足50μl。

PCR反应条件分别为：

第一轮：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次，循环结束后再72℃延伸10min。

第二轮：94℃预变性3min；94℃变性30s，47℃退火30s，72℃延伸45s，循环35次，循环结束后再72℃延伸10min。

所得PCR产物，部分经1.5%琼脂糖电泳检测，溴化乙锭染色后紫外线下观察并拍照，剩余部分送上海金斯瑞有限公司纯化并测序。参见图1。

4、序列处理及分析

获得的DNA序列先提交到GenBank数据库中，然后利用“BLAST”工具(NCBI站点)进行相似性检索，并确定片段方向；用GenDoc软件进行序列同源性比较；用MEGA5.0软件，计算各物种间的遗传距离，转换和颠换值及其比值（R值），保守位点（conservedsitesC）及变异位点（variablesitesV）等数值，用邻接法(Neighbor-Joining，NJ)构建系统发育树。

5、mtDNACOI基因的组成及分子进化特征

将自测的5个天牛的COI序列进行校对，并同网上下载序列进行对齐、剪切后得到481bp的序列。在NCBI(NationalCenterofBiotechnolgoyInfarmtion)数据库进行序列相似性搜索，经BLAST检索后证明所得序列均为COI基因序列。

应用Mega5.0软件对天牛COI基因序列进行分析，发现在481个位点中保守位点90个，变异位点391个，信息位点375个，自裔位点16个。所有位点中，A、T、C、G的平均含量分别为：29.6%、35.8%、18.5%、16.1%。A+T含量较高，为65.4%，明显高于G+C含量，表现明显的A+T碱基偏嗜，且A与T含量相当，符合昆虫线粒体基因碱基组成的基本特征。

6、碱基替换分析

应用Mega5.0软件对天牛COI基因序列的替换数进行估计，从统计结果可以看出：33种天牛COI基因481个核苷酸序列中，所有转换（si）与颠换（sv）的比值为0.84，密码子第一位点的转换与颠换的比值分别是0.83，密码子第二位点的转换与颠换的比值分别是0.72，可以看出转换没有颠换频繁。密码子第3位点最为保守，转换和颠换率均较低。（表3所示）

表3天牛COI基因碱基替换统计表

7、遗传距离分析

基于Kimure2-parameter模型分析33种天牛COI的遗传距离，采用Bootstrap（1000次）进行检验，如图3所示。断眼天牛属3种天牛种间的遗传距离介于0.052~0.087间；其余天牛种间的遗传距离介于0.075~0.292间，说明33种天牛COI间的分化，个别种间的差异相对较大，可通过分子手段进行区分、鉴定。

8、分子进化树的构建

基于COI基因序列数据，用Mega5.0软件选择Kimura2-parameter遗传距离模型，同时采用Bootstrap重复抽样1000次循环，计算系统树中节点的自举置信水平，构建邻接法（NJ）分子系统树。结果如图4，从图4可以看出，COI序列构建的系统进化树，可以将大部分天牛种群进行区分，Tetropium属、Monochamus属种群聚集为一支，总体上系统发育树支持了形态学上鉴定的属和大部分种的地位，另一方面也说明构建基因条码的可行性。

SEQUENCELISTING

<110>申请人名称

<120>一种天牛科幼虫不同家系的分子标记方法

<130>20140806

<160>4

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>上游引物J173

<400>1

taacagcacatgcttttgta

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>下游引物J1331

<400>2

ggatagtctgagtatcgtcg

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>上游引物J1718

<400>3

ggaggatttggaaattgattagttcc

<210>4

<211>26

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>下游引物N2191

<400>4

cccggtaaaattaaaatataaacttc

Claims

1.一种天牛科幼虫不同家系的分子标记方法，其特征在于，采用以下步骤实现：

1）选用两对特异性引物进行PCR反应，所述两对特异性引物为

上游引物J173：5’-TAACAGCACATGCTTTTGTA-3’

下游引物J1331：5’-GGATAGTCTGAGTATCGTCG-3’；

上游引物J1718：5’-GGAGGATTTGGAAATTGATTAGTTCC-3’

下游引物N2191：5’-CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3’；

2.根据权利要求1所述的一种天牛科幼虫不同家系的分子标记方法，其特征在于，在步骤3）中，在进行PCR扩增时，PCR反应体系采用50μl标准反应体系，其中含有10×PCRBuffer（Mg^2＋）5μl，2.5mmol/L的dNTPs4μl，TaqDNA聚合酶0.4μl，cDNA模板2μl，上下游引物各1μl，后加ddH₂O补足50μl。

3.根据权利要求1所述的一种天牛科幼虫不同家系的分子标记方法，其特征在于，在步骤3）中，第一轮PCR反应的条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次，循环结束后再72℃延伸10min。

4.根据权利要求1所述的一种天牛科幼虫不同家系的分子标记方法，其特征在于，在步骤3）中，第二轮PCR反应的条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，47℃退火30s，72℃延伸45s，循环35次，循环结束后再72℃延伸10min。