CN106868195A - 鉴定Pirangoclytus triangularis的特异性引物和方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鉴定Pirangoclytus triangularis的特异性引物和方法及应用，涉及物种鉴定的技术领域，本发明提供的用于鉴定Pirangoclytus triangularis的特异性引物，特异性强；本发明提供的Pirangoclytus triangularis的鉴定方法，通过测定和分析Pirangoclytus triangularis及其他虎天牛属相关物种的线粒体COI基因序列片段，构建生物分子系统树，推演物种间的亲缘关系，进而获得其科学的分类鉴定依据，省时省力，准确性高，重复率高，且经济快速。
Description
技术领域
本发明涉及物种鉴定技术领域，尤其是涉及一种鉴定Pirangoclytustriangularis的特异性引物和方法及应用。
背景技术
Pirangoclytus triangularis，属鞘翅目(Coleoptera)，天牛科(Cerambycidae)，虎天牛属(Xylotrechus)。Pirangoclytus triangularis是在1841年被Castelnau和Gory首次命名为Clytus triangularis，同时，Pirangoclytus triangularis也曾在1862年被Chevrolat命名为Mecometopus amabilis，也曾在1860年被Thomson并命名为Mecometopusrhinotragoides，还在1862年被Chevrolat命名为Mecometopus maronensis或Mecometopusfunereus。
目前，Pirangoclytus triangularis的物种鉴定主要依靠形态学特征，虎天牛属天牛外观较为相似，加之采用形态特征鉴定对鉴定者的专业知识和天牛样本完整性均要求较高，鉴定过程经常受主观因素的干扰，不仅耗时耗力，而且准确度和重复性都不高。
生物分子树也称系统进化树(phylogenetic tree)，它是用类似树状分支的图来表示各种(类)生物之间的亲缘关系，通过对生物序列的研究来推测物种的进化历史。主要是通过DNA序列、蛋白质序列、蛋白质结构等来构建系统发育树，或者通过蛋白质结构比较包括刚体结构叠合和多结构特征比较等方法建立结构进化树，所得结果科学可靠。
其中，线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COI)基因由于具有较高的进化速率，已成为区分物种和研究物种进化关系的一种理想基因。目前，昆虫遗传研究过程中，扩增昆虫线粒体COI基因一般是采用已报道的通用引物，但由于其通用性较强，特异性较弱，在实际研究过程中，扩增昆虫COI基因的同时，也往往能扩增出昆虫体表及体内杂菌的COI基因片段。这将导致某些昆虫，如对虎天牛属昆虫，尤其是Pirangoclytus triangularis的研究的作用不理想。
目前国内外尚未有专门针对Pirangoclytus triangularis线粒体COI基因的特异性引物的相关报道，也未见应用生物分子系统树对Pirangoclytus triangularis进行鉴定的相关报道。
因此，开发一种省时省力，准确性高，重复率高，且经济快速的Pirangoclytustriangularis的鉴定方法尤为重要。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种用于鉴定Pirangoclytus triangularis的特异性引物，以克服现有技术中存在的通用引物特异性不高的技术问题。
本发明的第二个目的在于提供一种用于鉴定Pirangoclytus triangularis的特异性引物在Pirangoclytus triangularis线粒体COI基因序列扩增中的应用。
本发明的第三个目的在于提供一种Pirangoclytus triangularis的鉴定方法，省时省力，准确性高，重复率高，且经济快速。
本发明的第四个目的在于提供一种Pirangoclytus triangularis的鉴定方法在鉴定Pirangoclytus triangularis物种中的应用。
本发明提供的一种鉴定Pirangoclytus triangularis的特异性引物，所述特异性引物的上下游核苷酸序列分别为：
COI－F：5＇－ATCTTGTATTTGGTGCCTGAG－3＇(SEQ ID NO.1)；
COI－R：5＇－AGTCGGAGTACCGTCGTG－3＇(SEQ ID NO.2)。
另外，本发明还提供了上述特异性引物在Pirangoclytus triangularis线粒体COI基因序列扩增中的应用。
另外，本发明还提供了一种Pirangoclytus triangularis的鉴定方法，以Pirangoclytus triangularis样本为基础构建标准流生物分子系统树，以待测样本为基础构建检测流生物分子系统树，分析和比较所述标准流生物分子系统树与所述检测流生物分子系统树，鉴定所述待测样本是否为Pirangoclytus triangularis。
进一步地，所述构建标准流生物分子系统树和构建检测流生物分子系统树的方法为NJ法。
进一步地，所述NJ法构建标准流生物分子系统树的方法为：以Pirangoclytustriangularis总DNA为模板，利用权利要求1所述的特异性引物进行PCR，并对PCR产物进行测序，获得Pirangoclytus triangularis的线粒体COI核苷酸序列片段，基于所述Pirangoclytus triangularis的线粒体COI基因核苷酸序列片段和相关近缘物种的线粒体COI基因核苷酸序列片段，利用计算机软件，构建标准流生物系统树。
进一步地，所述NJ法构建检测流生物分子系统树的方法为：以待测样本总DNA为模板，利用权利要求1所述的特异性引物进行PCR，并对PCR产物进行测序，获得待测样本的线粒体COI核苷酸序列片段，基于所述待测样本的线粒体COI基因核苷酸序列片段和相关近缘物种的线粒体COI基因核苷酸序列片段，利用计算机软件，构建检测流生物系统树。
进一步地，所述分析和比较所述标准流生物分子系统树与所述检测流生物分子系统树为：若所述待测样本与所述Pirangoclytus triangularis形成一个单系群，则判断为Pirangoclytus triangularis；若所述待测样本与所述相关近缘物种形成一个单系群，则判断为相关近缘物种。
进一步地，所述Pirangoclytus triangularis的线粒体COI核苷酸序列片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步地，所述相关近缘物种为Pirangoclytus amaryllis，Pirangoclytuschaparensis，Pirangoclytus flavius，Pirangoclytus fraternus，Pirangoclytusgranulipennis，Pirangoclytus insignis，Pirangoclytus jauffreti，Pirangoclytuslaetus，Pirangoclytus latecinctus，Pirangoclytus mendosus，Pirangoclytusmniszechii，Pirangoclytus nubicollis，Pirangoclytus placens，Pirangoclytuspurus，Pirangoclytus rubefactus，Pirangoclytus sulphurosus，Pirangoclytustriangularis和Pirangoclytus ycoca。
另外，本发明还提供了上述的Pirangoclytus triangularis的鉴定方法在鉴定Pirangoclytus triangularis物种中的应用。
本发明提供的用于鉴定Pirangoclytus triangularis的特异性引物，特异性强，只有相应种才能扩增出相应大小的片段，且可应用于Pirangoclytus triangularis线粒体COI基因序列扩增；本发明提供的Pirangoclytus triangularis的鉴定方法，通过测定和分析Pirangoclytus triangularis及其他虎天牛属相关物种的线粒体COI基因序列片段，构建生物分子系统树，推演物种间的亲缘关系，进而获得其科学的分类鉴定依据，此方法省时省力，准确性高，重复率高，且经济快速，无需专业鉴定人士，一般的技术人员均可进行操作。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果图；
图2为本发明实施例1提供的Pirangoclytus triangularis样本与相关近缘物种的COI基因序列片段进行对比的结果图；
图3为本发明实施例1提供的MEGA软件构建NJ法标准流生物系统树的示意图；
图4为本发明实施例1提供的标准流生物系统树的结果图；
图5为本发明实施例2提供的检测流生物系统树A的结果图；
图6为本发明实施例3提供的检测流生物系统树B的结果图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种用于鉴定Pirangoclytus triangularis的特异性引物，特异性引物的上下游核苷酸序列分别为：
COI－F：5＇－ATCTTGTATTTGGTGCCTGAG－3＇(SEQ ID NO.1)；
COI－R：5＇－AGTCGGAGTACCGTCGTG－3＇(SEQ ID NO.2)。
以数据库中已经测得的Pirangoclytus triangularis的线粒体基因序列中COI基因的核苷酸序列为基础，通过比对找出COI基因中相对保守且碱基变异度最小的序列片段，设计出Pirangoclytus triangularis的特异性引物。
本发明还提供了上述用于鉴定Pirangoclytus triangularis的特异性引物在Pirangoclytus triangularis线粒体COI基因序列扩增中的应用。
另外，本发明还提供了一种Pirangoclytus triangularis的鉴定方法，以Pirangoclytus triangularis样本为基础构建标准流生物分子系统树，以待测样本为基础构建检测流生物分子系统树，分析和比较标准流生物分子系统树与检测流生物分子系统树，鉴定待测样本是否为Pirangoclytus triangularis。
在本发明中，构建标准流生物分子系统树和构建检测流生物分子系统树的方法为NJ法。
NJ法(neighbor－joiningmethod，邻接法)通过确定距离最近或相邻的成对分类单位来使系统树的总距离达到最小。相邻是指两个分类单位在某一无根分叉树中仅通过一个节点(Node)相连。通过循序地将相邻点合并成新的点，就可以建立一个相应的拓扑树。它的特点是构建的树相对准确，假设少，计算速度快，只得一棵树。
在本发明中，NJ法构建标准流生物分子系统树的方法为：以Pirangoclytustriangularis总DNA为模板，利用上述的特异性引物进行PCR，并对PCR产物进行测序，获得Pirangoclytus triangularis的线粒体COI核苷酸序列片段，基于Pirangoclytustriangularis的线粒体COI基因核苷酸序列片段和相关近缘物种的线粒体COI基因核苷酸序列片段，利用计算机软件，构建标准流生物系统树。
在本发明中，NJ法构建检测流生物分子系统树的方法为：以待测样本总DNA为模板，利用权利要求1所述的特异性引物进行PCR，并对PCR产物进行测序，获得待测样本的线粒体COI核苷酸序列片段，基于待测样本的线粒体COI基因核苷酸序列片段和相关近缘物种的线粒体COI基因核苷酸序列片段，利用计算机软件，构建检测流生物系统树。
基于Pirangoclytus triangularis的线粒体COI基因核苷酸序列片段和相关近缘物种的线粒体COI基因核苷酸序列片段构建的标准流生物系统树，用于与基于待测样本的线粒体COI基因核苷酸序列片段和相关近缘物种的线粒体COI基因核苷酸序列片段构建的检测流生物分子系统树进行分析和比较，进而鉴定待测样本是否为Pirangoclytustriangularis：若所述待测样本与所述Pirangoclytus triangularis形成一个单系群，则判断为Pirangoclytus triangularis；若所述待测样本与所述相关近缘物种形成一个单系群，则判断为相关近缘物种。
其中，Pirangoclytus triangularis总DNA和待测样本总DNA为利用MicroElute Genomic DNA Kit试剂盒提取基因组DNA所得，所得到的DNA可作为模板进行PCR扩增反应。
应用上述特异性引物进行PCR扩增的反应体系为：
| 反应物 | 体积(μL) |
| 10×PCR Master Mix | 12.5 |
| COI－F(10nmol) | 1.0 |
| COI－R(10nmol) | 1.0 |
| 模板DNA | 2.0 |
| 8.5 | |
| Total | 25 |
PCR扩增的反应条件为：
将扩增后的PCR产物进行纯化后，交由上海生工完成测序反应。
在本发明中，获得Pirangoclytus triangularis的COI基因序列片段(436bp)，具体核苷酸序列如下(SEQ ID NO.3)：
CATAATAATCGGTGCCCCTGATATAGCATTCCCACGTATAAACAATATAAGATTCTGATTATTGCCTATATCAATTGCCCTTCTAATCTCAAGTTCAACTGCAGGTTCAGGAACAGGAACCGGATGAACTGTATACCCCCCACTATCTAGATTTAATGCACACCACGGACCGTCAGTAGATCTAACAATCTTTTCACTACATATTGCAGGAATTAGATCTATTATAGGTGCTATTAACTTCATCTCAACAATTATAAATATACGAACAAAAGAAATATCTATAGATAAAACACCCCTATTTTGTTGATCAGTACTGATCACCGCAATTTTATTACTTATTTCTTTACCAGTTTTAGCAGGAGCTATCACTATGTTAATTATGGACCGTAATTTTAATACAACATTTTTTGACCCTACAGGAGGAGGTGATCCAATC
在本发明中，相关近缘物种为Pirangoclytus amaryllis，Pirangoclytuschaparensis，Pirangoclytus flavius，Pirangoclytus fraternus，Pirangoclytusgranulipennis，Pirangoclytus insignis，Pirangoclytus jauffreti，Pirangoclytuslaetus，Pirangoclytus latecinctus，Pirangoclytus mendosus，Pirangoclytusmniszechii，Pirangoclytus nubicollis，Pirangoclytus placens，Pirangoclytuspurus，Pirangoclytus rubefactus，Pirangoclytus sulphurosus，Pirangoclytustriangularis和Pirangoclytus ycoca。
其中，相关近缘物种的线粒体COI基因核苷酸序列片段为利用生物数据库NCBI及科研文献获得。
其中，所用计算机软件为MEGA。
另外，本发明还提供了Pirangoclytus triangularis的鉴定方法的应用。
本发明提供的用于鉴定Pirangoclytus triangularis的特异性引物，特异性强，只有相应种才能扩增出相应大小的片段，且可应用于Pirangoclytus triangularis线粒体COI基因序列扩增；本发明提供的Pirangoclytus triangularis的鉴定方法，通过测定和分析Pirangoclytus triangularis及其他虎天牛属相关物种的线粒体COI基因序列片段，构建生物分子系统树，推演物种间的亲缘关系，进而获得其科学的分类鉴定依据，此方法省时省力，准确性高，重复率高，且经济快速，无需专业鉴定人士，一般的技术人员均可进行操作。
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
构建标准流生物分子系统树
本实施例中所用的Pirangoclytus triangularis样本来自于2016年10月从佛山市泰恒报关有限公司申报的苏里南进口的亚马逊沃埃苏原木(CIQ编号116000000929139，LRP编号33201606732，入境口岸是佛山南海港)中截获的昆虫标本。
(1)提取Pirangoclytus triangularis样本的总DNA
应用 MicroElute Genomic DNA Kit试剂盒，具体操作如下：
1.取10mg Pirangoclytus triangularis样本，剪碎或研磨后置于1.5mL离心管中，加入200μL Buffer TL；
2.加入20μL OB Protease溶液，震荡混匀，55℃振荡水浴至细胞完全裂解；
3.20000×g离心2min，取上清液；
4.加入220μL Buffer BL溶液，震荡混匀，70℃水浴10min；
5.加入220μL无水乙醇，涡旋震荡15s充分混匀，离心，避免离心管盖粘着液体；
6.将吸附柱放入收集管中，用移液枪将离心管的溶液和沉淀物全部加入吸附柱中，盖上盖子，8000×g离心1min，丢弃收集管以及里面的废液；
7.将吸附柱放入新的收集管中，加入500μL Buffer HB，8000×g离心1min，倒掉收集管中的废液，收集管回收重复使用；
8.将吸附柱重新放入收集管中，加入650μL DNA Wash Buffer，8000×g离心1min，丢弃收集管以及里面的废液；
9.将吸附柱放入新的收集管中，加入650μL DNA Wash Buffer，8000×g离心1min，倒掉收集管中的废液，收集管回收重复使用；
10.将吸附柱重新放入收集管中，20000×g离心3min，以干燥膜；
11.将吸附柱放入一个新的1.5mL离心管中，加入10－50μL预热70℃的ElutionBuffer，室温静置3min；
12.20000×g离心1min，洗脱吸附柱上的DNA；
提取的DNA可立即进行下一步实验，或－20℃保存。
(2)用本发明提供的特异性引物进行PCR扩增
PCR反应体系为：
| 反应物 | 体积(μL) |
| 10×PCR Master Mix | 12.5 |
| COI－F(10nmol) | 1.0 |
| COI－R(10nmol) | 1.0 |
| Pirangoclytus triangularis模板DNA | 2.0 |
| 8.5 | |
| Total | 25 |
PCR反应条件为：
(3)琼脂糖凝胶电泳
将PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果如图1所示，其中，泳道M为Maker，泳道1为PCR产物。
从图1中可以看出，琼脂糖凝胶进行电泳检测，泳道1条带单一，说明本发明提供的引物特异性良好。
(4)将扩增后的PCR产物进行纯化
1.准备1.5mL EP管，做以标记；
2.向管中加入5μl 50×的GC buffer；
3.将PCR产物全部吸出加入到相对应的EP管中，混匀后涡旋离心；
4.准备好离心柱；
5.将混匀的液体加入到离心柱中，离心13000×g，1min；
6.将柱子取出，倒掉管中液体，再套回柱子备用；
7.向每个管中加入500μl wash buffer，放入离心机，13000×g，1min；
8.再向每个管中加入500μl wash buffer，放入离心机，13000×g，1min；
9.将离心柱的盖子打开和套管一起放入离心机，16000×g，4min；
10.将离心柱的管芯取出，套入新的EP管中，向离心柱中加入30μl的Elutionbuffer，室温放置3min；
11.将离心柱盖好，连同EP管一同放入离心机，13000×g，1min；
12.取出套管，丢弃柱子，得到纯化后的PCR产物。
(5)将PCR产物进行测序
将步骤3中纯化后的PCR产物交由上海生工完成测序反应。
分析测序峰图，获得Pirangoclytus triangularis的COI基因序列片段(436bp)具体核苷酸如下(SEQ ID NO.3)：
CATAATAATCGGTGCCCCTGATATAGCATTCCCACGTATAAACAATATAAGATTCTGATTATTGCCTATATCAATTGCCCTTCTAATCTCAAGTTCAACTGCAGGTTCAGGAACAGGAACCGGATGAACTGTATACCCCCCACTATCTAGATTTAATGCACACCACGGACCGTCAGTAGATCTAACAATCTTTTCACTACATATTGCAGGAATTAGATCTATTATAGGTGCTATTAACTTCATCTCAACAATTATAAATATACGAACAAAAGAAATATCTATAGATAAAACACCCCTATTTTGTTGATCAGTACTGATCACCGCAATTTTATTACTTATTTCTTTACCAGTTTTAGCAGGAGCTATCACTATGTTAATTATGGACCGTAATTTTAATACAACATTTTTTGACCCTACAGGAGGAGGTGATCCAATC
(6)利用生物数据库NCBI及科研文献获得相关近缘物种的对应序列，利用生物软件clusterW将Pirangoclytus triangularis样本与相关近缘物种的COI基因序列片段进行对比，结果如图2所示。基于Pirangoclytus triangularis的线粒体COI基因核苷酸序列片段和相关近缘物种的线粒体COI基因核苷酸序列片段，利用MEGA软件构建NJ法标准流生物系统树，如图3所示，构建成的标准流生物系统树如图4所示，并根据标准流生物系统树确定Pirangoclytus triangularis的分类地位。
实施例2
构建检测流生物分子系统树A
本实施例中所用的待测样本A来自于2016年10月从佛山市泰恒报关有限公司申报的苏里南进口的亚马逊沃埃苏原木(CIQ编号116000000929139，LRP编号33201606732，入境口岸是佛山南海港)中截获的昆虫标本。
本实施例应用实施例1提供的提取样本总DNA的方法提取待测样本A的总DNA，并用实施例1提供的PCR扩增方法对本实施例提供的待测样本A的DNA进行扩增，将扩增产物纯化后，交由上海生工完成测序反应。
分析测序峰图，获得待测样本A的COI基因序列片段(436bp)具体核苷酸如下(SEQID NO.4)：
CCTAATAATCGGTGCCCCTGATATAGCATTCCCACGTATAAACAATATAAGATTCTGATTATTGCCTATATCAATTGCCCTTCTAATCTCAAGTTCAACTGCAGGTTCAGGAACAGGAACCGGATGAACTGTATACCCCCCACTATCTAGATTTAATGCACACCACGGACCGTCAGTAGATCTAACAATCTTTTCACTACATATTGCAGGAATTAGATCTATTATAGGTGCTATTAACTTCATCTCAACAATTATAAATATACGAACAAAAGAAATATCTATAGATCAAACACCCCTATTTTGTTGATCAGTACTGATCACCGCAATTTTATTACTTATTTCTTTACCAGTTTTAGCAGGAGCTATCACTATGTTAATTATGGACCGTAATTTTAATACAACATTTTTTGACCCTACAGGAGGAGGTGATCCAATC
利用生物数据库NCBI及科研文献获得相关近缘物种的对应序列，基于待测样本A的线粒体COI基因核苷酸序列片段和相关近缘物种的线粒体COI基因核苷酸序列片段，利用MEGA软件构建NJ法检测流生物系统树A。
分析和比较实施例1提供的标准流系统树与本实施例提供的检测流生物分子系统树A，鉴定待测样本是否为Pirangoclytus triangularis。
如图5所示，通过分析和比较得出，待测样本A与已知的Pirangoclytustriangularis形成一个单系群，则可判断，本实施例检测的待测样本A为Pirangoclytustriangularis。
实施例3
构建检测流生物分子系统树B
本实施例中所用的待测样本B来自于2016年10月从佛山市泰恒报关有限公司申报的苏里南进口的亚马逊沃埃苏原木(CIQ编号116000000929139，LRP编号33201606732，入境口岸是佛山南海港)中截获的昆虫标本。
本实施例应用实施例1提供的提取样本总DNA的方法提取待测样本B的总DNA，并用实施例1提供的PCR扩增方法对本实施例提供的待测样本B的DNA进行扩增，将扩增产物纯化后，交由上海生工完成测序反应。
分析测序峰图，获得待测样本B的COI基因序列片段(436bp)具体核苷酸如下(SEQID NO.5)：
TCTAATACTTGGAGCTCCAGATATAGCTTTTCCTCGAATAAATAATATAAGTTTCTGATTATTACCACCTTCTTTAACTTTATTATTAATAAGTAGTATAGTAGAAAACGGGGCTGGAACAGGTTGAACTGTTTACCCTCCTCTTTCAAGAAATATTGCCCATAGAGGAGCCTCAGTTGATTTAGCAATTTTTTCACTTCACTTATCAGGTATATCTTCAATTCTAGGAGCAGTAAATTTTATTACAACAGTAATTAATATACGATCTACAGGAATTACATATGACCGAATACCTTTATTTGTATGATCAGTAGCTATTACAGCTTTACTTCTTCTTCTTTCATTACCAGTATTAGCAGGAGCTATTACAATATTATTAACTGATCGAAATTTAAATACATCATTTTTTGACCCAGCAGGAGGAGGAGATCCAATT
利用生物数据库NCBI及科研文献获得相关近缘物种的对应序列，基于待测样本B的线粒体COI基因核苷酸序列片段和相关近缘物种的线粒体COI基因核苷酸序列片段，利用MEGA软件构建NJ法检测流生物系统树B。
分析和比较实施例1提供的标准流系统树与本实施例提供的检测流生物分子系统树B，鉴定待测样本是否为Pirangoclytus triangularis。
如图6所示，通过分析和比较得出，待测样本B与相关近缘物种形成单系群，则可判断，本实施例提供的待测样本B不是Pirangoclytus triangularis，而是其相关近缘物种。
由以上实施例可以看出，本发明提供的用于鉴定Pirangoclytus triangularis的特异性引物特异性强，本发明提供的Pirangoclytus triangularis的鉴定方法，省时省力，且结果科学准确。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 李凯兵
<120> 鉴定Pirangoclytus triangularis的特异性引物和方法及应用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atcttgtatt tggtgcctga g 21
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agtcggagta ccgtcgtg 18
<210> 3
<211> 436
<212> DNA
<213> Pirangoclytus triangularis
<400> 3
cataataatc ggtgcccctg atatagcatt cccacgtata aacaatataa gattctgatt 60
attgcctata tcaattgccc ttctaatctc aagttcaact gcaggttcag gaacaggaac 120
cggatgaact gtataccccc cactatctag atttaatgca caccacggac cgtcagtaga 180
tctaacaatc ttttcactac atattgcagg aattagatct attataggtg ctattaactt 240
catctcaaca attataaata tacgaacaaa agaaatatct atagataaaa cacccctatt 300
ttgttgatca gtactgatca ccgcaatttt attacttatt tctttaccag ttttagcagg 360
agctatcact atgttaatta tggaccgtaa ttttaataca acattttttg accctacagg 420
aggaggtgat ccaatc 436
<210> 4
<211> 436
<212> DNA
<213> Pirangoclytus triangularis
<400> 4
cctaataatc ggtgcccctg atatagcatt cccacgtata aacaatataa gattctgatt 60
attgcctata tcaattgccc ttctaatctc aagttcaact gcaggttcag gaacaggaac 120
cggatgaact gtataccccc cactatctag atttaatgca caccacggac cgtcagtaga 180
tctaacaatc ttttcactac atattgcagg aattagatct attataggtg ctattaactt 240
catctcaaca attataaata tacgaacaaa agaaatatct atagatcaaa cacccctatt 300
ttgttgatca gtactgatca ccgcaatttt attacttatt tctttaccag ttttagcagg 360
agctatcact atgttaatta tggaccgtaa ttttaataca acattttttg accctacagg 420
aggaggtgat ccaatc 436
<210> 5
<211> 436
<212> DNA
<213> 未知
<400> 5
tctaatactt ggagctccag atatagcttt tcctcgaata aataatataa gtttctgatt 60
attaccacct tctttaactt tattattaat aagtagtata gtagaaaacg gggctggaac 120
aggttgaact gtttaccctc ctctttcaag aaatattgcc catagaggag cctcagttga 180
tttagcaatt ttttcacttc acttatcagg tatatcttca attctaggag cagtaaattt 240
tattacaaca gtaattaata tacgatctac aggaattaca tatgaccgaa tacctttatt 300
tgtatgatca gtagctatta cagctttact tcttcttctt tcattaccag tattagcagg 360
agctattaca atattattaa ctgatcgaaa tttaaataca tcattttttg acccagcagg 420
aggaggagat ccaatt 436
Claims (10)
1.一种鉴定Pirangoclytus triangularis的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物的上下游核苷酸序列分别为：
COI－F：5＇－ATCTTGTATTTGGTGCCTGAG－3＇(SEQ ID NO.1)；
COI－R：5＇－AGTCGGAGTACCGTCGTG－3＇(SEQ ID NO.2)。
2.权利要求1所述的特异性引物在Pirangoclytus triangularis线粒体COI基因序列扩增中的应用。
3.一种Pirangoclytus triangularis的鉴定方法，其特征在于，以Pirangoclytustriangularis样本为基础构建标准流生物分子系统树，以待测样本为基础构建检测流生物分子系统树，分析和比较所述标准流生物分子系统树与所述检测流生物分子系统树，鉴定所述待测样本是否为Pirangoclytus triangularis。
4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述构建标准流生物分子系统树和构建检测流生物分子系统树的方法为NJ法。
5.根据权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于，所述NJ法构建标准流生物分子系统树的方法为：以Pirangoclytus triangularis总DNA为模板，利用权利要求1所述的特异性引物进行PCR，并对PCR产物进行测序，获得Pirangoclytus triangularis的线粒体COI核苷酸序列片段，基于所述Pirangoclytustriangularis的线粒体COI基因核苷酸序列片段和相关近缘物种的线粒体COI基因核苷酸序列片段，利用计算机软件，构建标准流生物系统树。
6.根据权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于，所述NJ法构建检测流生物分子系统树的方法为：以待测样本总DNA为模板，利用权利要求1所述的特异性引物进行PCR，并对PCR产物进行测序，获得待测样本的线粒体COI核苷酸序列片段，基于所述待测样本的线粒体COI基因核苷酸序列片段和相关近缘物种的线粒体COI基因核苷酸序列片段，利用计算机软件，构建检测流生物系统树。
7.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述分析和比较所述标准流生物分子系统树与所述检测流生物分子系统树为：若所述待测样本与所述Pirangoclytustriangularis形成一个单系群，则判断为Pirangoclytus triangularis；若所述待测样本与所述相关近缘物种形成一个单系群，则判断为相关近缘物种。
8.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，所述Pirangoclytus triangularis的线粒体COI核苷酸序列片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
9.根据权利要求5或6所述的鉴定方法，其特征在于，所述相关近缘物种为Pirangoclytus amaryllis，Pirangoclytus chaparensis，Pirangoclytus flavius，Pirangoclytus fraternus，Pirangoclytus granulipennis，Pirangoclytus insignis，Pirangoclytus jauffreti，Pirangoclytus laetus，Pirangoclytus latecinctus，Pirangoclytus mendosus，Pirangoclytus mniszechii，Pirangoclytus nubicollis，Pirangoclytus placens，Pirangoclytus purus，Pirangoclytus rubefactus，Pirangoclytus sulphurosus，Pirangoclytus triangularis 和Pirangoclytus ycoca。
10.权利要求3所述的Pirangoclytus triangularis的鉴定方法在鉴定Pirangoclytustriangularis物种中的应用。
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