CN105671168A - 一种快速鉴别菠菜性别的分子生物学方法 - Google Patents

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李书粉
秦瑞云
张卫丽
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits

Abstract

本发明公开了一种快速鉴别菠菜性别的分子生物学方法，属于分子生物学技术领域。本发明的技术方案要点为：（1）提取待测菠菜单株的基因组DNA；（2）以待测菠菜单株的基因组DNA为模板，利用特异性引物对进行PCR扩增反应，该特异性引物对序列为，上游引物：5’-AAGGTAAAGCCTGAGTGGAGAA-3’，下游引物：5’-AAGCAGTTAGAGGTCGGGTTTA-3’；（3）琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，若扩出了1168bp目的条带，则为雄性，若无扩增条带，则为雌性。本发明经过不同品种进行验证，可以稳定、准确的鉴定菠菜早期性别，克服了现有技术中分子标记鉴定性别不稳定的问题，是一种技术突破，体现了该研究方法具有较好的先进性、创新性和实用性。

Description

一种快速鉴别菠菜性别的分子生物学方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种快速鉴别菠菜性别的分子生物学方法。
背景技术
菠菜（SpinaciaoleraceaL.）属于藜科（Chenopodiaceae）菠菜属（Spinacia），是一种典型的XY型性别决定植物，染色体组成为2n=12，处于性染色体演化过程中的第二阶段，具有绝对雄株、营养雄株、绝对雌株、雌雄同株多种不同的性别表现类型。菠菜长期以来被作为研究性别决定和分化的模式材料。细胞学研究表明菠菜的1号染色体（最长的染色体）短臂上具有性别决定位点，Lan等利用45SrDNA序列对菠菜染色体进行了染色体定位分析，45SrDNA位点多数在雌株染色体上是6个，而在雄株中为5个，因而表明菠菜为XY性别决定机制类型。Y染色体紧密连锁分子标记的克隆不但可以用于菠菜幼苗早期性别鉴定，还可以用于标记选择辅助育种，同时也将为性别基因X/Y的定位克隆奠定基础。Akamatsu等（1998）开发出与菠菜X/Y基因连锁的分子标记T11A、V20A，可用于鉴别菠菜雌、雄植株。利用101个AFLP标记和9个SSR标记，菠菜回交群体的遗传图谱被成功构建，遗传图谱被分割为7个遗传连锁群，总的遗传距离为585cM，距离SO4微卫星标记1.9cM的区域与菠菜的性别决定相关；借助分离群体分组分析法（bulkedsegregantanalysis，BSA），10个与X/Y位点紧密连锁的AFLP分子标记被鉴定，其中4个分子标记与Y基因共分离，并且这些AFLP分子标记和2个已知的雄性特异DNA片段将覆盖Y位点的区域定位在13.4cM的区域，这些分子标记为克隆性别决定基因奠定了基础。通过群体分离分析法绘制菠菜雄性性别控制区域的遗传连锁图谱，证明控制雌雄同株的基因（M）和控制雄性性别的基因（Y）连锁，同位于Y染色体上，它们之间为非等位基因，遗传距离约为12cM。可是经过验证，目前所获得的Y染色体连锁的分子标记中只有T11A非常稳定，其他分子标记均不太稳定。基于此，本专利开发了特异引物对用于菠菜幼苗早期的鉴定。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供了一种稳定性好且方便快捷地快速鉴别菠菜性别的分子生物学方法。
本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种快速鉴别菠菜性别的分子生物学方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）提取待测菠菜单株的基因组DNA；
（2）以待测菠菜单株的基因组DNA为模板，利用特异性引物对进行PCR扩增反应，该特异性引物对序列为，上游引物：5’-AAGGTAAAGCCTGAGTGGAGAA-3’，下游引物：5’-AAGCAGTTAGAGGTCGGGTTTA-3’；
（3）琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，若扩出了1168bp目的条带，则为雄性，若无扩增条带，则为雌性。
进一步优选，步骤（2）的具体过程为：以待测菠菜单株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为20μL，其组成为：10×PCRBuffer2μL、2.5mMdNTPMixture1μL、10μM上游引物0.5μL、10μM下游引物0.5μL、5U/μLTaq酶0.2μL、100-200ng模板DNA1μL和无菌水14.8μL；PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸1.5min，共35个循环，最后72℃延伸10min。
本发明经过不同品种进行验证，可以稳定、准确的鉴定菠菜早期性别，克服了现有技术中分子标记鉴定性别不稳定的问题，是一种技术突破，体现了该研究方法具有较好的先进性、创新性和实用性。
附图说明
图1是菠菜雌雄基因组的PCR验证电泳图；
图2是菠菜单株性别鉴定电泳图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例
1、菠菜雌雄基因组的PCR验证
1.1雌雄菠菜基因组DNA的提取
取新鲜的6株雌和雄性日本大叶菠菜叶片4g左右用清水将其冲洗干净，用吸水纸将其表面的水分充分吸收干净放入提前预冷的研钵中，加入液氮，将其慢慢捣碎，研磨，再次加入液氮，进行研磨，将组织加入到提前在液氮中预冷的50mL的离心管中，加入大约40mL提前加入千分之二巯基乙醇并且已经预热至65℃的CTAB。
将离心管置于65℃水浴锅中2h以上，使组织充分裂解。
取出离心管，置于提前预冷至4℃的离心机中以12000r/min的离心速率离心10min。
转移上清至新的离心管中，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）进行抽提，使其充分混匀。
4℃离心机中以12000r/min的离心速率离心10min。
转移上清至新的离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1)进行抽提，使其充分混匀。
4℃离心机中以12000r/min的离心速率离心10min。
转移上清至新的离心管中，加入2/3体积的异丙醇。
颠倒混匀置于-20℃过夜。
4℃离心机中以15000r/min的离心速率离心15min。
弃上清，用体积分数为70%的乙醇进行洗涤，4℃离心机中以15000r/min的离心速率离心15min。
再次弃上清，用体积分数为70%的乙醇进行洗涤，于冰上放置20min，充分洗涤杂质，再于4℃离心机中以15000r/min的离心速率离心15min。
弃上清，于通风厨中吹10min，使乙醇充分挥发。
将得到的基因组溶于2mL的水中，置于-20℃过夜。
加入10μL的RNA酶，37℃温浴30min。
转移上述溶液至10mL的离心管中，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）进行抽提，使其充分混匀。
4℃离心机中以12000r/min的离心速率离心10min。
转移上清至新的离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1）进行抽提，使其充分混匀。
4℃离心机中以12000r/min的离心速率离心10min。
转移上清至新的离心管中，加入1/3体积的3M的NaAc溶液以及2.5倍体积的无水乙醇，置于-20℃过夜。
4℃离心机中以12000r/min的离心速率离心10min。
弃上清，用体积分数为70%的乙醇进行洗涤，4℃离心机中以15000r/min的离心速率离心15min。
再次弃上清，用体积分数为70%的乙醇进行洗涤，于冰上放置20min，充分洗涤杂质，再于4℃离心机中以15000r/min的离心速率离心15min。
弃上清，于通风厨中吹15min，使乙醇充分挥发。
加入1mL的水使其充分溶解并转移至1.5mL的离心管中，于-20℃放置备用。
1.2PCR扩增及验证
利用特异引物对序列（上游引物：5’-AAGGTAAAGCCTGAGTGGAGAA-3’，下游引物：5’-AAGCAGTTAGAGGTCGGGTTTA-3’），以菠菜单株雌雄基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为20μL，其组成为：10×PCRBuffer2μL、2.5mMdNTPMixture1μL、10μM上游引物0.5μL、10μM下游引物0.5μL、5U/μLTaq酶0.2μL、100-200ng模板DNA1μL和无菌水14.8μL。在PCR仪上按照下面的循环参数进行PCR扩增：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，共35个循环，最后72℃延伸10min，扩增产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色，在凝胶成像系统下观察并拍照记录，Trans2Kmarker（全式金）作为分子量标记，结果表明雄性基因组均出现大小为1168bp目的条带，而雌性基因组未有。
2、菠菜单株性别鉴定
随机选取农家菠菜16个单株，分别提取其基因组DNA，DNA提取及PCR扩增方法如上所述，检测结果表明其中8个单株出现了1168bp目的条带，表明在检测的16个样品中，有8个雄性单株和8个雌性单株。
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。
SEQUENCELISTING
<110>河南师范大学
<120>一种快速鉴别菠菜性别的分子生物学方法
<130>2016
<160>2
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
AAGGTAAAGCCTGAGTGGAGAA22
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
AAGCAGTTAGAGGTCGGGTTTA22

Claims (2)

1.一种快速鉴别菠菜性别的分子生物学方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）提取待测菠菜单株的基因组DNA；
（2）以待测菠菜单株的基因组DNA为模板，利用特异性引物对进行PCR扩增反应，该特异性引物对序列为，上游引物：5’-AAGGTAAAGCCTGAGTGGAGAA-3’，下游引物：5’-AAGCAGTTAGAGGTCGGGTTTA-3’；
（3）琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，若扩出了1168bp目的条带，则为雄性，若无扩增条带，则为雌性。
2.根据权利要求1所述的快速鉴别菠菜性别的分子生物学方法，其特征在于步骤（2）的具体过程为：以待测菠菜单株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为20μL，其组成为：10×PCRBuffer2μL、2.5mMdNTPMixture1μL、10μM上游引物0.5μL、10μM下游引物0.5μL、5U/μLTaq酶0.2μL、100-200ng模板DNA1μL和无菌水14.8μL；PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸1.5min，共35个循环，最后72℃延伸10min。
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