JP4114887B1 - 小麦の品種識別法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 小麦DNA上の品種間で差のあるSSR領域を特異的に増幅できる10組の小麦品種識別用プライマー、それを含む小麦品種識別用キット並びにこれらプライマー対を用いて小麦から抽出したDNAを鋳型としたPCRを行い、得られた増幅DNAを解析することによる小麦の品種識別法を提供する。
【選択図】 なし
Description
このような、多様な用途に適した品種の選択、栽培品種のブランド化の進展から、原々種や原種生産での混種や、市場流通過程での原料品種取り違えの問題は、食品流通過程において大きな混乱と経済的損失を生じるものであり、国内における主要小麦品種の簡便で正確な識別法の確立が求められているところである。
それらの方法は、DNAマーカーと呼ばれる品種間でのDNA塩基配列の差異(多型)を検出する道具を用いて品種識別を行うものであり、栽培環境に影響されない遺伝子上の特徴を指標とすることから、正確な品種識別が可能となる。その手法としてはRAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)法、AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphisms)法、CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)法、SSR(Simple Sequence Repeat)法等が利用されている。
また、RAPD法はひとつのマーカーから得られる多型が少なく、黒澤らの方法では、国内における栽培品種のように遺伝的に非常に近縁な場合は多型が少ないことが予想され、識別対象品種の拡大が困難である。
一方、本発明において着目したSSR領域は、ゲノム中に散在する単純な塩基配列の反復領域であり、反復回数に依存するこの領域の長さは極めて多型性に富んでいる。したがって、現在、国内で栽培されている小麦品種のように遺伝的に近縁な場合でも、品種間の多型を検出することができる。
(a)被検体である小麦試料からDNAを抽出する工程
(b)TaSE3(配列番号1及び2に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)、TaSE6(配列番号3及び4に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)、TaSE37(配列番号5及び6に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)、TaSE63(配列番号7及び8に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)、TaSE92(配列番号9及び10に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)、TaSE96(配列番号11及び12に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)、TaSE117(配列番号13及び14に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)、TaSE123(配列番号15及び16に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)、TaSE149(配列番号17及び18に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)及びTaSE151(配列番号19及び20に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)からなる群より選ばれた1組のプライマー対を用いて、上記(a)で抽出したDNAを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行い、DNAを増幅する工程
(c)上記(b)で得られた増幅DNAの長さを解析することにより、品種間の多型を検出する工程
請求項2に記載の本発明は、工程(b)に記載の10組のプライマー対を用いて(b)工程及び(c)工程を繰り返し、各プライマー対による増幅DNAの断片長のデータを組み合わせることにより小麦試料の品種を識別する、請求項1に記載の小麦の品種識別法である。
請求項3に記載の本発明は、TaSE3(配列番号1及び2に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)、TaSE6(配列番号3及び4に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)、TaSE37(配列番号5及び6に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)、TaSE63(配列番号7及び8に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)、TaSE92(配列番号9及び10に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)、TaSE96(配列番号11及び12に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)、TaSE117(配列番号13及び14に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)、TaSE123(配列番号15及び16に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)、TaSE149(配列番号17及び18に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)及びTaSE151(配列番号19及び20に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)からなる群より選ばれた少なくとも1組のプライマー対である。
請求項4に記載の本発明は、請求項3に記載のプライマー対を含む小麦の品種識別用キットである。
本発明に係る小麦の品種識別法は、
(a)被検体である小麦試料からDNAを抽出する工程、
(b)小麦DNA上の品種間で異なるSSR領域を特異的に増幅するように設計された本発明の小麦品種識別用プライマー対のうち1組を用いて、上記(a)で抽出したDNAを鋳型としたPCRを行い、DNAを増幅する工程、および
(c)上記(b)で得られた増幅DNAの長さを解析することにより、品種間の多型を検出する工程、
を含むことを特徴とするものである。
例えば、小麦種子1粒を破砕したものに1.5×CTABを400μl加えてよく懸濁し、55℃で15分間加温した後、遠心分離し、上層のみを採取する。これに等量のクロロホルム/イソアミルアルコール(24:1)を加えて室温で10分間振とうさせる。これを遠心分離した後、上層のみを採取し、1.5倍量の沈殿用バッファーを加えてDNAを析出させる。これを遠心して上澄みを捨て、1M NaCl溶液300μlを加えて55℃で10分間静置後、等量のイソプロパノールを加えて再びDNAを析出させる。遠心して上澄みを捨て、70%エタノール300μl程度を加えて洗浄し、再度、同作業を繰り返す。得られた沈殿を乾燥させた後、TEを50μl 加え、1晩4℃に静置して溶解させることによってDNA溶液を得ることが出来る。
本発明においてプライマー対とは、PCRにおいて使用されるフォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせを指す。以下、「プライマー対」のことを単に「プライマー」と呼ぶこともある。
なお、本発明のプライマーとしては、下記の塩基配列の一部であって15塩基以上の連続した塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いることも可能である。
(1)TaSE3
TaSE3は、配列表の配列番号1に記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号2に記載の塩基配列からなるリバースプライマーと、を組み合わせてなるオリゴヌクレオチドプライマー対である。
TaSE6は、配列表の配列番号3に記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号4に記載の塩基配列からなるリバースプライマーと、を組み合わせてなるオリゴヌクレオチドプライマー対である。
TaSE37は、配列表の配列番号5に記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号6に記載の塩基配列からなるリバースプライマーと、を組み合わせてなるオリゴヌクレオチドプライマー対である。
TaSE63は、配列表の配列番号7に記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号8に記載の塩基配列からなるリバースプライマーと、を組み合わせてなるオリゴヌクレオチドプライマー対である。
TaSE92は、配列表の配列番号9に記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号10に記載の塩基配列からなるリバースプライマーと、を組み合わせてなるオリゴヌクレオチドプライマー対である。
TaSE96は、配列表の配列番号11に記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号12に記載の塩基配列からなるリバースプライマーと、を組み合わせてなるオリゴヌクレオチドプライマー対である。
TaSE117は、配列表の配列番号13に記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号14に記載の塩基配列からなるリバースプライマーと、を組み合わせてなるオリゴヌクレオチドプライマー対である。
TaSE123は、配列表の配列番号15に記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号16に記載の塩基配列からなるリバースプライマーと、を組み合わせてなるオリゴヌクレオチドプライマー対である。
TaSE149は、配列表の配列番号17に記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号18に記載の塩基配列からなるリバースプライマーと、を組み合わせてなるオリゴヌクレオチドプライマー対である。
TaSE151は、配列表の配列番号19に記載の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号20に記載の塩基配列からなるリバースプライマーと、を組み合わせてなるオリゴヌクレオチドプライマー対である。
本発明の小麦の品種識別用キットは、上記品種識別プライマーの他に、DNAポリメラーゼ等のPCR用試薬なども含んでいてよい。
例えば、小麦試料のDNAに、上記10組の品種識別プライマーのうちの1組、Taqポリメラーゼ等の耐熱性DNAポリメラーゼ、反応用緩衝液およびdNTPsを加えた状態で、常法に従い約90〜100℃下での変性、約30〜75℃下、好ましくは約50〜70℃下、より好ましくは約50〜60℃下でのアニーリング及び約70〜75℃下での伸長、の3過程を1サイクルとする反応を30〜40サイクル行ってDNAを増幅することができる。
(b)工程におけるPCRによって、品種識別プライマーのフォワードプライマーとリバースプライマーとに挟まれたSSR領域のDNA断片が大量に増幅される。上記10組の品種識別プライマーは、品種間で反復回数の差が出るSSR領域を挟むように設計されているため、場合によっては品種ごとに断片長(分子量)の異なる増幅DNAが得られる。したがって本発明では、(b)工程で得られた増幅DNAの長さを決定することにより、品種間の多型(SSR領域における反復回数の差)を検出することができるのである。
各プライマー対を用いて得られた増幅DNAの長さに基づいて識別されたグループをそれぞれ記号(A〜J)で示し、10組のプライマー対に由来する10個の記号組合せによって品種識別を行うことで、国内品種と国外品種の識別が可能である。また、国内で流通量が多い「ホクシン」や「農林61号」、地域特産のブランド品種「さぬきの夢2000」など、主要な国内品種についても個別に識別することができる(表8参照)。
このように、本発明に用いる品種識別プライマーは、上記10組の品種識別プライマーの中から、目的に応じて必要なものを適宜選択して用いればよい。
データベースNCBIに登録されている小麦のUniGene35,263個(2005年9月時点)から、SSRマーカー開発支援プログラムread2Markerを利用してプライマー設計を行った。なお、上記プログラムread2Markerとは、塩基配列データからSSRを検索し、当領域をはさむようにプライマー設計を行うプログラムであり、その詳細に関しては、H. Fukuoka et al., Bio Techniques 39:472-476 (2005)に記載されている。
read2Markerで設計したプライマー対のうち、フォワードプライマーとリバースプライマーに挟まれたSSR領域に含まれる反復回数の多い方から上位186組のプライマー対を選択し、TaSE1〜186と命名した。これらのプライマー対について、少なくとも小麦14品種(ホクシン、農林61号、チクゴイズミ、ネバリゴシ、さぬきの夢2000、タマイズミ、ふくさやか、シロガネコムギ、シラサギコムギ、春よ恋、ハルユタカ、Eradu、Calingiri、Zak)におけるPCR増幅の可否と多型の有無を確認した。
種子1粒を軽くハンマー粉砕後、2.0ml滅菌凍結保存チューブにφ5.5mmビーズ2個とともに入れ、ビーズ式細胞破砕装置(TOMY製Micro Smash)で3000rpmにて150秒間処理した。1.5×CTABを400μl加えてよく懸濁し、55℃のヒートブロック等で15分間加温した後、遠心し、上層のみを新しい1.5mlチューブに移した。等量のクロロホルム/イソアミルアルコール(24:1)を加え、室温で10分間振とうさせた。遠心後、上層のみを新しい1.5mlチューブに移し、上層の1.5倍量の沈殿用バッファーを加えてDNAを析出させた。遠心して上澄みを捨て、1M NaCl溶液300μlを加えて55℃で10分間静置後、等量のイソプロパノールを加えて再びDNAを析出させた。遠心して上澄みを捨て、70%エタノール300μl程度を加えて洗浄し、再度、同作業を繰り返した。得られた沈殿をスピードバックで3分間ほど乾燥させた後、TEを50μl 加え、1晩4℃に静置して溶かしたものをDNA溶液とした。
分光光度計でDNA溶液の濃度を算出し、10ng/μl に調整して次のPCR反応に用いた。
PCR反応液組成は上記と同様に調整し、グラジエントPCR反応はタカラバイオ製PCR Thermal Cycler Dice Gradientを使用して、94℃で9分反応後、94℃で30秒、50〜70℃で30秒、72℃で30秒の反応を35サイクル行い、最後に72℃で7分反応させた(表4参照)。
以上、186組すべてのプライマー対についてPCR増幅の可否、多型の有無を判定した。その結果、もっとも品種識別に適すると考えられた10組のプライマー対を選定した(表5参照)。なお、表5に記載の反復領域とは、プライマー対に挟まれて増幅されるSSR領域の塩基配列を示す。
国内で市場流通していると考えられる主要な小麦品種58品種(国内41品種、輸入17品種)を選定し、供試した(表6参照)。
表6の小麦58品種から実施例1と同様にしてDNAを抽出し、上記の蛍光プライマー対を用いて実施例1の表1及び表2と同様のPCR反応を行った。ただし、TaSE151を用いたPCR反応におけるアニーリング温度は50℃に設定した。
すなわち、PCR反応液1μlにつきホルムアミド6.93μl、サイズスタンダードマーカー(ABI製 GENESCAN-500LIZ)0.07μlを混合し、ローディングサンプルとした。これをキャピラリー型電気泳動装置(ABI製 3130xl Genetic Analyzer)で分離した後、遺伝子解析ソフトウェア(ABI製 GeneMapper)を用いて増幅長を算出した。
各品種につき、少なくとも3粒からそれぞれDNAを抽出し、データを取得した。
代表データとして、ホロシリコムギ、ニシホナミ、タクネコムギ及びさぬきの夢2000の4品種についてTaSE6を用いて得られた増幅DNAの電気泳動図を図1に示す。図1中、薄い色はサイズスタンダードマーカーを、濃い色は増幅DNAを示す。
TaSE3を用いた増幅DNAの長さの違いによって、小麦58品種は11グループ(A〜J)に識別された。同様に、TaSE6では5、TaSE37では4、TaSE63では4、TaSE92では2、TaSE96では4、TaSE117では2、TaSE123では7、TaSE149では5、TaSE151では3のグループに識別することができた。
また、各プライマーを用いて得られた増幅長をそれぞれ記号(A〜J)で示し、各品種における10個の記号組合せによって品種識別を行った結果、58品種を47グループに識別できた(表8参照)。なお、表8中の「−」は増幅DNAが得られなかったことを示す。
また、特に、国内で流通量が多い「ホクシン」、「農林61号」、地域特産のブランド品種「さぬきの夢2000」など主要な品種は、個別に識別が可能であった。
Claims (4)
- 以下の(a)〜(c)の工程を含む小麦の品種識別法。
(a)被検体である小麦試料からDNAを抽出する工程
(b)TaSE3(配列番号1及び2に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)、TaSE6(配列番号3及び4に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)、TaSE37(配列番号5及び6に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)、TaSE63(配列番号7及び8に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)、TaSE92(配列番号9及び10に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)、TaSE96(配列番号11及び12に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)、TaSE117(配列番号13及び14に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)、TaSE123(配列番号15及び16に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)、TaSE149(配列番号17及び18に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)及びTaSE151(配列番号19及び20に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)からなる群より選ばれた1組のプライマー対を用いて、上記(a)で抽出したDNAを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行い、DNAを増幅する工程
(c)上記(b)で得られた増幅DNAの長さを解析することにより、品種間の多型を検出する工程 - 工程(b)に記載の10組のプライマー対を用いて(b)工程及び(c)工程を繰り返し、各プライマー対による増幅DNAの断片長のデータを組み合わせることにより小麦試料の品種を識別する、請求項1に記載の小麦の品種識別法。
- TaSE3(配列番号1及び2に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)、TaSE6(配列番号3及び4に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)、TaSE37(配列番号5及び6に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)、TaSE63(配列番号7及び8に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)、TaSE92(配列番号9及び10に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)、TaSE96(配列番号11及び12に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)、TaSE117(配列番号13及び14に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)、TaSE123(配列番号15及び16に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)、TaSE149(配列番号17及び18に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)及びTaSE151(配列番号19及び20に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー対)からなる群より選ばれた少なくとも1組のプライマー対。
- 請求項3に記載のプライマー対を含む小麦の品種識別用キット。
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