CN115490663A - 一种从山茶油副产物油枯饼中提取山奈酚的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从山茶油副产物油枯饼中提取高纯度山奈酚的方法，包括：山茶籽油枯饼先经正己烷除脂，再以甲醇为提取试剂进行提取，过滤除去残渣，得到提取液，提取液减压蒸馏除去溶剂，得到粗提物；粗提物进行正向硅胶柱层析，依次采用石油醚:丙酮＝20:1、1:1V/V为洗脱剂进行洗脱，合并石油醚:丙酮＝1:1V/V的馏分，减压蒸馏除去溶剂，得到粗馏分；以反向硅胶为填料，对粗馏分进行反相硅胶柱层析，以甲醇‑水为洗脱剂进行梯度洗脱，按照洗脱梯度收集馏分，合并20％甲醇‑水、40％甲醇‑水、60％甲醇‑水洗脱馏分，减压蒸馏除去溶剂，得到山奈酚。本发明方法能够得到高纯度的山奈酚，产品纯度可达97.4％。
Description
技术领域
本发明属于提取分离领域，具体涉及一种从山茶油副产物油枯饼中提取高纯度山奈酚的方法
背景技术
山奈酚(Kaempherol)是一种有机物，属于黄酮类化合物，化学式为C15H10O6，单体纯品为黄色结晶状粉末，微溶于水，溶于热乙醇、乙醚和DMSO等有机溶剂，别名：山奈酚-3、山奈黄酮醇，山奈素同样属于黄酮类活性物质，其结构与山奈酚相似，但不可将二者归为同一种物质。
山奈酚具有很好的生物活性：
防癌抗癌，长期膳食会降低患癌的风险。高摄入山奈酚会降低晚期大肠腺瘤的复发，并且还会明显降低患胰腺癌的风险。
抗感染抗炎，山奈酚具有良好的抗菌活性，对耐甲氧青霉素的金黄色葡萄球菌(MRSA)也有作用，对霍乱弧菌和粪肠球菌也有很好的抗菌活性。在抗炎方面，山奈酚主要是通过抑制炎症因子的表达从而达到抗炎效果。
糖尿病防治，糖尿病是严重威胁人类健康的内分泌代谢性疾病，其发病率以前所未有的速度升高。研究表明，山奈酚具有与降糖药罗格列酮作为PPAR激动剂的功效，但其不良反应远比罗格列酮弱，有望成新一代的胰岛素增敏剂。
山奈酚主要来源于姜科植物山柰(kaempferol galanga L.)的根茎，经富集后，一般采用甲醇和乙腈的混合溶剂作为洗脱剂进行全梯度洗脱分离，但该方法过于复杂和繁琐且无法有效分离纯化。山奈酚还广泛存在于各种水果、蔬菜及饮料中，人们已经从茶叶、椰菜、巫榛子、蜂胶、柚子以及其他绿色植物提取到它的纯品。工业上通常以豆科植物槐的干燥成熟果实为原料，采用水蒸气蒸馏法并通过浓缩、富集、分离纯化后通过重结晶得到山奈酚产品。实验室中通常直接使用高效液相色谱进行分离提纯。这些操作复杂、耗时、原料及生产线成本也较高。
山茶油取自山茶科山茶属山茶科油茶树(Camellia oleifera Abel.)的种籽，生产山茶油产生的副产物山茶籽油枯饼，在市面上主要作为清洁剂或作洗发剂的原材料售卖，产生的经济价值也很低。
目前，还没有从山茶籽油枯饼中分离得到山奈酚纯品的相关研究。
发明内容
本发明的目的在于有效利用农业废弃物，以油茶树种子榨完油后所产生的山茶籽油枯饼为原料，提取高纯度天然活性物质山奈酚。榨取油脂后残余在山茶籽油枯饼的脂质会严重干扰其他活性物质的分离效果，并且油枯饼中还存在大量和山奈酚类似的各种黄酮苷、多酚、以及各种极性的皂苷和糖基类物质，尤其是油枯饼中含有与山奈酚结构接近的山奈素，上述化学成分会极大的影响山奈酚的分离纯化。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种从山茶油副产物油枯饼中提取高纯度山奈酚的方法，包括：
步骤(1)、山茶籽油枯饼先经正己烷除脂，再以甲醇为提取试剂进行提取，过滤除去残渣，得到提取液，提取液减压蒸馏除去溶剂，得到粗提物，粗提物为液体状浸膏；
步骤(2)、粗提物进行正向硅胶柱层析，依次采用石油醚:丙酮＝20:1、1:1V/V为洗脱剂进行洗脱，合并石油醚:丙酮＝1:1V/V的馏分，减压蒸馏除去溶剂，得到粗馏分；
步骤(3)、以反向硅胶为填料，对粗馏分进行反相硅胶柱层析，以甲醇-水为洗脱剂进行梯度洗脱，按照洗脱梯度收集馏分，合并20％甲醇-水、40％甲醇-水、60％甲醇-水洗脱馏分，减压蒸馏除去溶剂，得到山奈酚。
步骤(1)中，优选的，山茶籽油枯饼在正己烷中浸泡24h，山茶籽油枯饼与正己烷的用量比为1:2kg/L。
优选的，以甲醇为提取试剂，重复提取2～3次，每次提取时，山茶籽油枯饼与甲醇的用量比为1:2kg/L，提取时间为12h。
步骤(2)中，粗提物采用湿法上样，具体为：取正相硅胶与粗提物混合，直至看不见明显的液体状浸膏，待其完全干，得到上样硅胶；按照样品层和空白硅胶层的厚度比为1:2取空白硅胶，将空白硅胶与甲醇摇匀后倒入柱层析色谱柱中，随后加入上样硅胶。
每个洗脱梯度的洗脱剂与上样柱体积的体积比为5:1。
所述的正相硅胶的目数为80目。
步骤(3)中，粗馏分采用干法上样，具体为：粗馏分用甲醇溶解后与反相硅胶混合，得到上样硅胶，按照样品层和空白反向硅胶层的厚度比为1:4取空白反相硅胶加入色谱柱中，确保空白反相硅胶层上表面平整后加入上样硅胶。
所述的反向硅胶为C18键合硅胶。
所述的梯度洗脱为：依次采用纯水、20％甲醇-水、40％甲醇-水、60％甲醇-水、80甲醇％-水、纯甲醇进行梯度洗脱。仅有20％甲醇-水、40％甲醇-水、60％甲醇-水洗脱馏分中含有高纯度山奈酚，山奈素大量存在于80％甲醇-水洗脱馏分中。
考虑到高纯度山奈酚主要其中在40％甲醇-水洗脱馏分中，作为本发明的进一步优选技术方案，收集40％甲醇-水洗脱馏分，减压蒸馏除去溶剂，得到山奈酚。
本发明的有益效果：
本发明正己烷除去残留的油脂成分，使用正相硅胶柱层析色谱并使用不同配比的石油醚丙酮甲醇溶剂初步富集山奈酚，再使用反相硅胶柱层析，经纯水洗脱除去杂质后，能够在20％甲醇-水、40％甲醇-水、60％甲醇-水洗脱下得到高纯度的山奈酚，产品纯度可达97.4％，收率约为0.422‰，说明本发明方法适用于从山茶籽油枯饼提取山奈酚。
附图说明
图1为本发明的分离流程图。
图2为20％甲醇-水洗脱馏分的高效液相色谱图；
图3为40％甲醇-水洗脱馏分的高效液相色谱图；
图4为60％甲醇-水洗脱馏分的高效液相色谱图；
图5为80％甲醇-水洗脱馏分的高效液相色谱图；
图6为纯化得到的山奈酚的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1
如图1所示，以山茶籽油枯饼为原料，从该原料中提取分离出高纯度山奈酚，步骤如下：
步骤(1)、提取
取2.5kg山茶籽油枯饼，将山茶籽油枯饼倒入锥形瓶中，加入5L正己烷浸泡24h以除去残留的脂质成分，倒出正己烷；再加入5L分析纯甲醇，浸泡过夜，过滤，采用甲醇重复提取两次，合并甲醇提取液，通过蒸馏除去溶剂得到104g粗提物。
步骤(2)、分离纯化
粗提物湿法上样、进行正相硅胶柱层析，具体为：取适量正相硅胶与粗提物混合，直至看不见明显的液体状浸膏，待其完全干，得到上样硅胶；按照样品层和空白硅胶层的厚度比为1:2取空白硅胶(硅胶目数为80目)，将空白硅胶与过量的甲醇(分析纯)摇匀后倒入柱层析色谱柱中，随后加入上样硅胶；依次采用石油醚:丙酮＝20:1V/V的混合溶剂、石油醚:丙酮＝1:1V/V的混合溶剂、纯甲醇为洗脱剂进行洗脱，使用薄层色谱法进行检测(薄层色谱板上未出现明显的点方可开始下一洗脱梯度的洗脱)，各个洗脱剂的用量为5L，上样柱体积为1L；
采用薄层色谱法检测时，硅胶板(规格50mm×100mm，厚度0.2-0.25mm)，石油醚:丙酮＝20:1V/V的洗脱馏分采用石油醚:丙酮＝5:1V/V为展开剂，石油醚:丙酮＝1:1V/V的洗脱馏分采用石油醚:丙酮＝3:2V/V为展开剂；
石油醚:丙酮＝1:1V/V洗脱得到的馏分经过减压蒸发得到约8g固体，即为粗馏分；纯甲醇的洗脱馏分存在糖和大量黄酮苷。
粗馏分干法上样、进行反相硅胶柱层析：粗馏分用甲醇溶解后与C18键合硅胶(反相硅胶)混合，得到上样硅胶；使用干法上样，按照样品层和空白反向硅胶层的厚度比为1:4取空白反相硅胶，加入色谱柱中，敲击柱壁待其表面平整后加入上样硅胶，并塞入干净脱脂棉以防将硅胶冲起，依次以纯水、20％甲醇-水、40％甲醇-水、60％甲醇-水、80％甲醇-水、100％甲醇梯度洗脱，使用薄层色谱法(硅胶板规格50mm×100mm，厚度0.2-0.25mm)进行检测，直至薄层色谱板上未出现明显的点方可开始下一洗脱梯度的洗脱，按照洗脱梯度收集馏分，分别为：水洗脱馏分、20％甲醇-水洗脱馏分、40％甲醇-水洗脱馏分、60％甲醇-水洗脱馏分、80％甲醇-水洗脱馏分、100％甲醇洗脱馏分，采用高效液相色谱分析20％甲醇-水洗脱馏分、40％甲醇-水洗脱馏分、60％甲醇-水洗脱馏分、80％甲醇-水洗脱馏分，发现：虽然60％甲醇-水与80％甲醇-水的极性较为接近，但60％甲醇-水洗脱馏分(图4)中含有高纯度山奈酚(0.226g，纯度为93.4％)，而80％甲醇-水洗脱馏分(图5)却含有黄酮苷及山奈素，几乎不含山奈酚；使用20％甲醇-水(图2)洗脱虽然能够得到高纯度山奈酚(0.245g，纯度为97.6％)，但含量少于60％甲醇-水洗脱馏分，且高纯度山奈酚(0.615g，纯度为98.7％)主要其中在40％甲醇-水洗脱馏分中；而通常，需要采用高效液相色谱法才能达到将山奈酚和山奈素分离的技术效果。合并20％甲醇-水洗脱馏分、40％甲醇-水洗脱馏分、60％甲醇-水洗脱馏分，减压蒸馏得到黄色粉末状，山奈酚的收率约为0.422‰。
步骤(3)、纯度检验及结构鉴定
将黄色粉末用色谱甲醇溶解后转入EP管中，经过有机滤膜过滤后注入1.5ml液相瓶中。采用高效液相色谱法检验分离产物纯度。
步骤(2)中，采用安捷伦1290Infinity II，步骤(3)中，采用美睿仪器LC-100液相色谱仪；步骤(2)和步骤(3)中，高效液相色谱的条件相同，如下：
C8色谱柱(Agilent,Eclipse Plus C8,5μm，4.6×250mm)，流动相为水和乙腈，流速为4mL/min，柱温为室温，进样量为150μL，洗脱梯度如表1，高效液相色谱图见图6，产品纯度为97.4％。
表1.洗脱梯度
使用氘代甲醇溶解黄色粉末并通过核磁共振检测其氢谱、碳谱(碳谱归属见表2)。确定黄色粉末为山奈酚。
表2.山奈酚的碳谱归属
| 编号 | 实测数据 | 微谱标准数据<sup>13</sup>C-NMR |
| C-2 | 147.55 | 146.7 |
| C-3 | 136.71 | 135.8 |
| C-4 | 176.93 | 175.9 |
| C-5 | 157.76 | 156.5 |
| C-6 | 98.75 | 98.5 |
| C-7 | 165.1 | 163.9 |
| C-8 | 93.94 | 93.5 |
| C-9 | 162.04 | 161.1 |
| C-10 | 104.05 | 103.5 |
| C-1’ | 123.25 | 121.8 |
| C-2’6’ | 130.18 | 129.6 |
| C-3’5’ | 115.5 | 115.5 |
| C-4’ | 160.06 | 159.6 |
Claims (8)
1.一种从山茶油副产物油枯饼中提取高纯度山奈酚的方法，其特征在于包括：
步骤(1)、山茶籽油枯饼先经正己烷除脂，再以甲醇为提取试剂进行提取，过滤除去残渣，得到提取液，提取液减压蒸馏除去溶剂，得到粗提物；
步骤(2)、粗提物进行正向硅胶柱层析，依次采用石油醚:丙酮＝20:1、1:1V/V为洗脱剂进行洗脱，合并石油醚:丙酮＝1:1V/V的馏分，减压蒸馏除去溶剂，得到粗馏分；
步骤(3)、以反向硅胶为填料，对粗馏分进行反相硅胶柱层析，以甲醇-水为洗脱剂进行梯度洗脱，按照洗脱梯度收集馏分，合并20％甲醇-水、40％甲醇-水、60％甲醇-水洗脱馏分，减压蒸馏除去溶剂，得到山奈酚。
2.根据权利要求1所述的从山茶油副产物油枯饼中提取高纯度山奈酚的方法，其特征在于步骤(1)中，以甲醇为提取试剂，重复提取2～3次，每次提取时，山茶籽油枯饼与甲醇的用量比为1:2kg/L，提取时间为12h。
3.根据权利要求1所述的从山茶油副产物油枯饼中提取高纯度山奈酚的方法，其特征在于步骤(2)中，粗提物采用湿法上样，样品层和空白硅胶层的厚度比为1:2；正相硅胶的目数为80目。
4.根据权利要求1所述的从山茶油副产物油枯饼中提取高纯度山奈酚的方法，其特征在于步骤(2)中，每个洗脱梯度的洗脱剂与上样柱体积的体积比为5:1。
5.根据权利要求1所述的从山茶油副产物油枯饼中提取高纯度山奈酚的方法，其特征在于步骤(3)中，粗馏分采用干法上样，样品层和空白反向硅胶层的厚度比为1:4。
6.根据权利要求1所述的从山茶油副产物油枯饼中提取高纯度山奈酚的方法，其特征在于步骤(3)中，所述的反向硅胶为C18键合硅胶。
7.根据权利要求1所述的从山茶油副产物油枯饼中提取高纯度山奈酚的方法，其特征在于步骤(3)中，所述的梯度洗脱为：依次采用纯水、20％甲醇-水、40％甲醇-水、60％甲醇-水、80甲醇％-水、纯甲醇进行梯度洗脱。
8.根据权利要求1或7所述的从山茶油副产物油枯饼中提取高纯度山奈酚的方法，其特征在于步骤(3)中，收集40％甲醇-水洗脱馏分，减压蒸馏除去溶剂，得到山奈酚。
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