CN102448925B - 包含咖啡酰莽草酸、原儿茶酸、水合酪氨酸、水杨酸及它们的衍生物的组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了包含咖啡酰莽草酸、原儿茶酸、水合酪氨酸和水杨酸的组合物，所述咖啡酰莽草酸及它们的衍生物从油棕的任一部分提取得到，所述油棕的任一部分包含但不限于棕榈油研磨的植物液和棕榈油研磨废液；以及在制备包含咖啡酰莽草酸、原儿茶酸、水合酪氨酸、水杨酸、所述咖啡酰莽草酸及它们的衍生物的组合物中使用的方法，所述方法包括预浓缩包含咖啡酰莽草酸、原儿茶酸、水合酪氨酸、水杨酸、咖啡酰莽草酸及它们的衍生物的提取物的步骤、和通过液相色谱从所述提取物中分离所述咖啡酰莽草酸、原儿茶酸、水合酪氨酸、水杨酸、咖啡酰莽草酸及它们的衍生物的步骤；其中，所述咖啡酰莽草酸、原儿茶酸、水合酪氨酸、水杨酸、咖啡酰莽草酸及它们的衍生物的洗脱活性根据固定相和流动相的组成而改变。在本发明的实施例中，采用C18柱和包含0.1％TFA(水中)和乙腈的梯度流动相，包含咖啡酰莽草酸的组分的洗脱发生在40和48分钟之间。

Description

包含咖啡酰莽草酸、原儿茶酸、水合酪氨酸、水杨酸及它们的衍生物的组合物及其制备方法

技术领域

本发明通常涉及包含至少5种主要化合物的组合物以及从油棕制备相同组合物的方法，所述主要化合物包含咖啡酰莽草酸的同分异构体、对羟基苯甲酸、原儿茶酸和水合酪氨酸，所述油棕包含但不限于棕榈油研磨的植物液。这包含咖啡酰莽草酸从液态植物液的分离和纯化。

背景技术

某些植物中天然存在的莽草酸及它的衍生物在植物和微生物中发挥生化中间体的重要作用。已知的是，在许多其他前体中，它是合成芳香族氨基酸、酚类物质和生物碱类的重要前体。与莽草酸在制药行业的利用有关的最相关进展之一是特敏福的生产，其为近年来用于对抗禽流感的一类药物。

随着世界人口的增长、以及因此的各种工业和制药使用的需求的增长，例如，如果流感爆发、则制造特敏福或其他抗病毒药物的莽草酸的使用的增长，对莽草酸的需求有望显著增长。目前，中国大茴香的果实可以满足莽草酸的世界需求。但通常发现它的浓度基本较低。大茴香的低可利用率阻碍了特敏福的生产，并使莽草酸的其他来源的需求变紧张。因此，需要开发莽草酸的其他来源，从而满足全球需求。包含棕榈油研磨的植物液的油棕提供了莽草酸的来源。

已知的是，油棕是马来西亚和东南亚几个国家最重要的经济作物。已经确定的是，从油棕提取的酚类化合物体现出各种健康益处。因此，正努力进一步开发油棕的这些化合物和其他提取物，所述这些化合物和其他提取物包含近来用于开发功能食品、医疗、营养食品和药物制剂的研磨过程的植物液和棕榈油研磨废液(mill effluent)(POME)。

本发明集中于实现来自棕榈油研磨的植物液和棕榈油研磨废液(POME)作为莽草酸来源的价值和潜力，以及进一步实现将来自油棕的提取物、棕榈油研磨的植物液和POME用作功能食品、医疗、营养食品和药物制剂的可能性。

发明内容

在一个实施例中，本发明涉及至少5种主要酚类化合物的组合物，所述主要化合物包含但不限于来自油棕的任一部分、棕榈油研磨的植物液和棕榈油研磨废液的咖啡酰莽草酸的同分异构体、羟基苯甲酸、原儿茶酸和水合酪氨酸。

在另一实施例中，本发明涉及包含咖啡酰莽草酸及它们的衍生物的组合物的分离和纯化方法。所述方法包括预浓缩包含所述咖啡酰莽草酸及它们的衍生物的提取物的步骤、以及然后通过制备液相色谱从所述提取物中分离所述咖啡酰莽草酸及它们的衍生物的步骤。根据流动相和固定相的条件，包含所述咖啡酰莽草酸的组分的洗脱时间可改变。

附图说明

将通过本发明的非限制性实施例并结合附图描述本发明，附图中：

图1是基于本发明实施例的包含获得的峰6、7和8的色谱图；

图2(a)至图2(c)分别是基于本发明实施例获得的峰6、7和8的分析色谱图；

图3是峰6、7和8的基质辅助激光解吸电离(MALDI)图谱；

图4是峰6、7和8的紫外(UV)光谱图；

图5是咖啡酰莽草酸或莽草酸的3.4-对羟基肉桂酸酯的示意图；

图6是碳和氢的化学位移(chemical shift)的示意图；

图7是选择的异核多键相关谱(HMBC)相关分析的示意图；

图8是标记化合物的示意图；以及

图9是组合物的HPLC曲线(profile)(指纹)。

具体实施方式

与以上发明内容的描述一致，说明书和实施例的和溶剂使用油棕的以及来自棕榈油研磨过程的植物液的提取物、以治疗和/或预防疾病的形式涉及用于各种健康相关目的的组合物、其使用和方法。

这一发明中有用的棕榈植物液的生物活性提取物是从棕榈油研磨过程的植物液中获得的那些提取物，根据(基于但不限于)申请号为No.20030031740的美国专利申请中公开的方法所涉及的步骤获得所述提取物。

虽然提取物可包括包含有酚类化合物、果酸、果糖和甘油、淀粉、纤维和半纤维的各种化合物，但是为了标准化，根据酚类物质的含量(即没食子酸等价物)测量所使用的提取物的浓度。

本发明的实施例部分以组合物为基础，所述组合物包括从油棕的任一部分(包含棕榈油过程的植物液和棕榈油研磨废液)获得的咖啡酰莽草酸和其他主要的酚类化合物。依照方法的数个步骤制备本发明的组合物，所述方法是本发明的另一方面。预期的是，该制备安全，而且所述组合物适合于但不限于在每日消费中使用，所述每日消费包含食品强化剂、营养食品、健康促进目的、治疗应用、免疫刺激、免疫系统强化、神经保护、抗癌、抗炎、抗氧化以及作为抗衰老剂。进一步应该注意的是，基于本发明的优选实施例获得的咖啡酰莽草酸以及它们的衍生物疑似体现出血管保护、抗糖尿病作用以及降低血压。

对本领域技术人员而言明显的是，为了本发明，从油棕的任一部分、棕榈油研磨的植物液和棕榈油研磨废液获得的粗提物可包含除了主要的标记化合物咖啡酰莽草酸以外的各种其他酚类化合物，这些化合物可包含羟基苯甲酸、水合酪氨酸、没食子酸、原儿茶酸、2.3-二羟基苯甲酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、黄酮、微量营养素和其他天然植物成分(包含纤维素和半纤维素、淀粉、糖、脂肪、氨基酸和蛋白质)。

事实上发现咖啡酰莽草酸及它们的衍生物浓度低。本发明的方法目的在于为本发明的组合物的制备以基本纯化的形式提供咖啡酰莽草酸及它们的衍生物。

当依照本发明的方法经受分离和纯化时，发现从油棕(包含棕榈油研磨的植物液和棕榈油研磨废液)获得的提取物包含以下化合物的至少一种：水合酪氨酸、对羟基苯甲酸、5-O-咖啡酰莽草酸、4-O-咖啡酰莽草酸以及3-O-咖啡酰莽草酸。

因此，本发明扩展到纯化的咖啡酰莽草酸的制备方法，其中所述方法的主要步骤是对从油棕的任一部分、棕榈油研磨的植物液以及棕榈油研磨废液获取的粗提物的预处理，以及咖啡酰莽草酸从所述粗提物的分离。这一实施例包含分离的或基本纯化的咖啡酰莽草酸。应该注意的是，“分离的”或“纯化的”咖啡酰莽草酸或其生物活性部分大致上摆脱了其他的细胞物质或其他成分、或者大致上摆脱了化学前体或其他化学品。

以下的实施例仅用于解释制备咖啡酰莽草酸和相关化合物的不同方法，并不对其进行限制。

组合物的制备方法的第一步是粗提物的预处理、从而获得预浓缩或部分纯化的提取物。在通过高效液相色谱的制备之前，这可能结合低严格条件(stringent condition)下的使提取物经历快速色谱或类似测量、或者替代性地使所述提取物经乙醇沉淀。第一方法涉及的主要步骤是装填沃特世的固相萃取柱(“sep-pak”型柱)、去除杂质、采用甲醇或乙醇洗脱所述提取物以及在旋转蒸发仪中的浓缩所述提取物。第二方法包括向三倍体积(three volumes)的冷乙醇中添加一定量的提取物、所述混合物在-20℃的优选温度储存过夜、以1500Xg离心至少15分钟、采用适量蒸馏水溶解从先前的步骤获得的沉淀以及通过旋转蒸发仪在50℃浓缩，从而获得优选的3ml的最终体积。应该提及的是，可采用本领域已知的(然而是实现相似目标的)标准程序的选择性步骤替代两种方法的这些步骤。

组合物(包括咖啡酰莽草酸及它们的衍生物)的制备方法的下一重要步骤涉及咖啡酰莽草酸从部分纯化的提取物的分离和纯化。基于制备5μm颗粒大小的液相色谱柱(阿尔泰克，econosil C18)的低严格条件或参数，这可采用传统的高效液相色谱(HPLC)，结合优选的25cm的柱长×10mm的内径、每分钟3ml的流速得以实施。优选的流动相梯度包括两种溶剂，包含0.1％的三氟乙酸(TFA)与一定量水的至少一种溶剂，添加有包含0-1％的TFA/乙腈(ACN)(TFA/乙腈体积比为10/90)的另一溶剂。该混合物经HPLC分离，并且观察到在40分钟、44分钟和48分钟有表示咖啡酰莽草酸洗脱的三个主峰。依照本发明收集的洗脱的咖啡酰莽草酸可具有90％至95％范围内的或更高的纯度。将理解的是，柱的选择和HPLC的参数可改变，然而获得如所描述的洗脱时间相似的结果。可适当收集并以粉末或液体形式提供洗脱组分，以便在进一步的分析中使用。

基于依照本发明的方法获得的峰，可基于本领域已知的传统或标准程序来实施确定咖啡酰莽草酸结构的其他化学分析，例如基于众所周知的核磁共振(NMR)分析。

可实施本发明的方法以从任一植物或任一类型的来源分离和纯化咖啡酰莽草酸及它们的衍生物，所述任一植物或任一类型的来源包含但不限于枣椰子(里内加尔枣椰子(Phenix reclinata)的果实)、橄榄(洋橄榄)、燕麦、大麦、红花、水果、蔬菜、果汁、椰子(可可椰子)、玉米(玉蜀黍)、种子、废料和从植物获取的组织。

在以下的非限制性示例中进一步描述本发明。

实施例1

分离和预处理

基于过滤流程从油棕、棕榈油研磨的植物液和棕榈油研磨废液制备提取物。

预浓缩处理

采用使用了沃特世的固相萃取柱(“sep-pak”小柱)用于溶剂交换的样品制备仪(Sample Prep)预浓缩样品。选择的、用于浓缩样品的色谱是制备高效液相色谱(HPLC)。

基于以下步骤实施溶剂交换：

a)调节——涉及采用甲醇以及随后采用水冲洗未使用的分离包(separationpack)(C18)。

b)进样——涉及向分离包中进样2ml量的样品，然后采用合适的注射器挤出。

c)水洗——涉及进样1ml水通过包，从而从样品去除任一形式的杂质。

d)洗脱——涉及进样2ml甲醇通过分离包，从而洗脱在之前的水洗阶段过程中未消除的剩余样品。

在下一步骤，使用氮气将洗脱样品浓缩三(3)倍。然后将清澈的样品注入半制备柱。

半制备高效液相色谱(HPLC)

优选柱是长度为25cm及内径为10mm、并在3ml/min的流速使用的C18柱。在这一研究中，进样柱为1ml，并在280nm读数。流动相梯度显示在下面的表1中：

时间(分钟)	溶剂A(0.1％TFA)	溶剂B(甲醇)
			0	90	10
1	90	10
			55	60	40
60	0	40
			65	0	100
70	90	10

峰分离

从进样的浓缩样品获得的色谱图如图1中所示。看出的是在40分钟、44分钟和48分钟洗脱样品，从而导致峰6、7和8。然后冻干每一洗脱组分，其中分别从峰6、7和8获得1.8mg、1.6mg和1.1mg干样品。

在下一步骤，通过分析型HPLC进一步分析峰的纯度，在所述分析性HPLC上观察到峰的纯度优于95％。图2(a)至(c)分别提供给了峰6、7和8的分析色谱图。

实施例2

峰的化学结构

使用MALDI质谱分析可获取获得的三个峰的分子量。1μl量的样品直接存放在待测定(M-H)的样品支架上。从这一分析获得的结果在图3中显示。

获取峰6、7和8的紫外光谱，如图4中所适当显示的，发现所有这些化合物的紫外光谱相似。

核磁分析

使用NMR分析分析基于这些峰的化合物的化学结构。获得的结果表明峰6、7和8的每个分子具有16个碳，所述16个碳具有两个羰基(酯或羧基)和10个sp²碳，其中具有一个芳环、另外两个双键、三个氧化的次甲基碳和亚甲基碳。进一步观察到，分子中的脂肪族质子处于两个自旋系统中。碳以及相关质子的化学位移因此表明了咖啡酰莽草酸(同样称为莽草酸的3，4-羟基肉桂酸酯)的结构，这可在图5中得以看出。

记录的是，如它的质谱中在(M-H)＝335的主峰所确认的，该化合物具有336的分子量。异核多键相关谱(HMBC)提供大量的两个和三个C-H相关分析，从而确定如图6和图7中显示的结构。

峰6的确定结构是分子量为336的5-O-咖啡酰莽草酸(C₁₆H₁₆O₈)。可在枣椰子果实中发现鉴定的化合物以及咖啡酰莽草酸的两个位置异构物(3-O-咖啡酰莽草酸和4-O-咖啡酰莽草酸)。本领域技术人员能够确定这些化合物可由同源的5-O-咖啡奎宁酸脱水形成。

实施例3

曲线-反相HPLC

如图8中所示，样品包含以下化合物的至少一种：水合酪氨酸、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、5-O-咖啡酰莽草酸、4-O-咖啡酰莽草酸和3-O-咖啡酰莽草酸。

为了进一步实施化合物的HPLC分析，样品制备如下：

a)制备10mg α-氰基-4-羟基肉桂酸，99％添加至1ml乙醇中；

b)将内标液(20μl)添加至980μl样品中；以及

c)将300μl这一混合物用于HPLC分析。

基于以上条件进行反相HPLC，其中结合0-8ml/min的流速与280nm的光电二极管检测使用液相保护柱(澳大利亚，SGE公司，Exsil ODS柱)(5μm，250×4.6)。进样体积为20μl。这一分析的流动相在以下的表2中显示：

时间(分钟)	溶剂A(0.1％HOAC)	溶剂B(10％水/ACN V/V)
			0	100	0
10	95	5
			45	70	30
50	0	100
			55	0	100
60	100	0

图9显示样品的色谱图，其中可以看出有5个主峰，所述主峰表明了水合酪氨酸、原儿茶酸、对羟基苯甲酸和咖啡酰莽草酸的三个同分异构体的存在，小峰代表了几种其他酚类化合物(包含没食子酸、阿魏酸等)。

进一步观察到，小峰可能占样品的酚类物质的至少20％。因此，主峰大致上占定量的样品的酚类物质含量。用于这一研究的标准品是保留时间为39分钟的α-氰基羟基肉桂酸，标准品用于定量。

本领域技术人员将理解的是，除了所特定描述的那些，这里描述的发明易受各种变化和改变的影响。应该理解的是，本发明包含所有这样的变化和改变。本发明也单独地或共同地包含这一说明书中涉及的或表明的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任意两个或多个所述步骤或特征的任一或所有结合。

Claims (7)

1.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括咖啡酰莽草酸、原儿茶酸、水合酪氨酸和对羟基苯甲酸，所述咖啡酰莽草酸及它们的衍生物从棕榈油研磨的植物液和棕榈油研磨废液提取得到。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述咖啡酰莽草酸及它们的衍生物从所述棕榈油研磨的植物液提取得到。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述咖啡酰莽草酸是5-0-咖啡酰莽草酸、4-0-咖啡酰莽草酸和3-0-咖啡酰莽草酸。

4.一种在制备包含咖啡酰莽草酸及它们的衍生物的组合物中使用的方法，所述方法包括从棕榈油研磨的植物液以及棕榈油研磨废液提供提取物的步骤、预浓缩包含所述咖啡酰莽草酸及它们的衍生物的提取物的步骤、和通过液相色谱从所述提取物中分离所述咖啡酰莽草酸及它们的衍生物的步骤；其特征在于，所述咖啡酰莽草酸及它们的衍生物的洗脱活性导致所述液相色谱上的多个峰；其中，所述液相色谱采用的参数如下：

使用长度为25cm、内径为10mm的C18柱，流动相梯度显示如下表：

时间(分钟) 溶剂A(0.1％TFA) 溶剂B(甲醇) 0 90 10 1 90 10 55 60 40 60 0 40 65 0 100 70 90 10

在所述提取物的至少一个组分内，所述洗脱活性发生在40、44和48分钟，从而通过液相色谱产生至少三个峰；所述组合物包括咖啡酰莽草酸、原儿茶酸、水合酪氨酸和对羟基苯甲酸。

5.根据权利要求4所述的在制备包含咖啡酰莽草酸及它们的衍生物的组合物中使用的方法，其特征在于，所述预浓缩步骤还包括采用所述提取物装柱、去除杂质、采用甲醇或乙醇洗脱所述提取物、在旋转蒸发仪中浓缩、添加一定量的冷乙醇、在-20℃储存、离心所述混合物、采用适量水溶解离心获得的沉淀以及通过旋转蒸发仪在50℃浓缩所述混合物的步骤。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述冷乙醇的量是所述提取物的至少3倍体积。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，根据分离获得的所述咖啡酰莽草酸及它们的衍生物的纯度百分比优于95％。