CN112500422B - 一种从盐附子中分离的新苯骈环庚三烯酮型生物碱及其神经保护用途 - Google Patents

一种从盐附子中分离的新苯骈环庚三烯酮型生物碱及其神经保护用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了如式Ⅰ所示的从盐附子中分离的苯骈环庚三烯酮型生物碱。本发明还公开了所述的苯骈环庚三烯酮型生物碱的制备方法，利用生物活性指导分离的方法确定神经保护活性部位，综合采用硅胶柱色谱、凝胶色谱和制备液相色谱从活性部位中分离得到新苯骈环庚三烯酮型生物碱。本发明还公开了该苯骈环庚三烯酮型生物碱在制备神经保护药物的用途，尤其是在制备保护缺血引起的神经细胞损伤药物的用途。
Figure DDA0002787054810000011

Description

一种从盐附子中分离的新苯骈环庚三烯酮型生物碱及其神经 保护用途
技术领域
本发明属于中药化学领域，具体涉及一种从盐附子中分离得到的新苯骈环庚三烯酮型生物碱及其制备方法，以及该化合物在制备神经保护药物的用途。
背景技术
盐附子(Aconiti lateralis Radix Praeparata)为毛茛科乌头属植物附子用盐水炮制而得到的炮制品。现代研究发现，乌头类生物碱是附子中主要毒性成分，如何在减毒增效方面对附子毒性进行控制，一直是科研人员研究的重点。迄今为止，本发明在国内外未见有相关文献或专利报道。
发明内容
发明人选取盐附子作为研究对象，采用生物活性指导分离的方法，经过前期研究，从盐附子中分离得到一种新苯骈环庚三烯酮型生物碱，同时，发明人发现该苯骈环庚三烯酮型生物碱对OGD/R损伤的PC12细胞物有一定的神经保护作用。
本发明主要在于提供一种从盐附子中分离得到的新苯骈环庚三烯酮型生物碱，以及该化合物的制备方法和在制备神经保护药物的用途。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种如式Ⅰ所示的从盐附子中分离得到的新苯骈环庚三烯酮型生物碱：
Figure BDA0002787054790000011
式Ⅰ所示的苯骈环庚三烯酮型生物碱的化学名称：5,6,9,13-四甲氧基-吲哚骈环庚三烯-吡咯并六环内脂-2,10-二酮。
分子式：C20H16N2O7。
本发明的另一个目的是提供如式Ⅰ所示的苯骈环庚三烯酮型生物碱的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)、将干燥的盐附子粉碎至50-80目；先用90-100％乙醇加热回流提取3-5次，回流提取4小时/次；再用60-80％乙醇加热回流提取3-5次，回流提取4小时/次；得总提取液；
步骤(2)、总提取液在50-60℃低温真空条件下浓缩至无醇味，得到总稠膏；
步骤(3)、将总稠膏混悬于水中，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，分别得到石油醚萃取部位、二氯甲烷萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位；
步骤(4)、二氯甲烷部位进行硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯洗脱系统进行梯度洗脱，得到4个馏分：馏分A、馏分B、馏分C、馏分D；
步骤(5)、馏分B进行硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯洗脱系统进行梯度洗脱得到亚馏分B-1、B-2、B-3；
步骤(6)、亚馏分B-2进行Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱剂为CH2Cl2和MeOH的体积比为1:1，得到次馏分B-2-1、B-2-2；
步骤(7)、次馏分B-2-2采用制备液相色谱分离纯化，得到式Ⅰ所述的化合物；其中，制备液相色谱采用YMC-Pack ODS-A柱：250×10mm,S-5μm,12nm，流动相：20％-30％甲醇，流速：2-5mL/min，波长：200-350nm。
步骤(2)中，总稠膏和水的体积比为1:0.8-1.5。
步骤(3)中，采用生物活性指导分离的方法，基于OGD/R模型，采用MTT法测定石油醚萃取部位、二氯甲烷萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位对PC12细胞OGD/R损伤细胞存活率，确定二氯甲烷萃取部位为神经保护活性馏分。
步骤(4)中，硅胶柱层析采用100-200目硅胶；石油醚-乙酸乙酯洗脱系统中石油醚和乙酸乙酯体积比为20:1→1:1。
对馏分A、馏分B、馏分C、馏分D进行神经保护活性部位筛选，确定馏分B为神经保护活性馏分。
步骤(5)中，硅胶柱层析采用200-300目硅胶；石油醚-乙酸乙酯洗脱系统中石油醚和乙酸乙酯体积比为15:1→5:1。
对亚馏分B-1、B-2、B-3进行神经保护活性部位筛选，确定亚馏分B-2为神经保护活性馏分。
步骤(6)中，对次馏分B-2-1、B-2-2进行神经保护活性部位筛选，确定次馏分B-2-2为神经保护活性馏分。
发明人基于OGD/R模型，采用MTT法测定式Ⅰ所示的苯骈环庚三烯酮型生物碱对PC12细胞OGD/R损伤细胞存活率的影响，表明对OGD/R损伤的PC12细胞物有一定的神经保护作用。因此，本发明的另一个目的是提供式Ⅰ所述的化合物在制备神经保护药物的用途。
优选的，式Ⅰ所述的苯骈环庚三烯酮型生物碱在制备保护缺血引起的神经细胞损伤药物的用途。
本发明的有益效果：
本发明在于选取盐附子为研究对象，依次采用90-100％乙醇和60-80％乙醇对盐附子进行加热回流提取。利用生物活性指导分离的方法确定神经保护活性部位，综合采用硅胶柱色谱、凝胶色谱和制备液相色谱从活性部位中分离得到新苯骈环庚三烯酮型生物碱。
该化合物结构新颖，制备方法简便高效、产率较高。同时，本发明基于OGD/R模型，采用MTT法测定该化合物对PC12细胞OGD/R损伤细胞存活率的影响，评价其神经保护活性，首次表明对OGD/R损伤的PC12细胞物有一定的神经保护作用，公开了新化合物Ⅰ在制备神经保护药物方面的用途。
附图说明
图1是本发明苯骈环庚三烯酮型生物碱的制备流程图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。
实施例1
化合物Ⅰ的制备方法(如图1)
步骤(1)、将干燥的盐附子(5.80千克)粉碎至60目，先用95％乙醇加热回流提取4次(4小时/次)得到提取液T1；再用70％乙醇加热回流提取4次(4小时/次)得到提取液T2；合并两次提取液，得到总提取液(T1+T2)；
步骤(2)、总提取液在低温(55℃)真空条件下浓缩至无醇味，得到总稠膏(87.20克)；
步骤(3)、将总稠膏均匀混悬于水中(总稠膏和水的体积比＝1:1.2，V/V)，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，分别得到石油醚萃取部位(22.47克)、二氯甲烷萃取部位(29.78克)、乙酸乙酯萃取部位(4.37克)、正丁醇萃取部位(16.25克)；
步骤(4)、采用生物活性指导分离的方法，基于OGD/R模型，采用MTT法测定不同萃取部位对PC12细胞OGD/R损伤细胞存活率的影响，确定二氯甲烷萃取部位为神经保护活性部位；
步骤(5)、二氯甲烷部位进行硅胶柱(100-200目)层析，用石油醚-乙酸乙酯洗脱系统(20:1→1:1，V/V)进行梯度洗脱，得到4个馏分，记为：馏分A(4.26克)、馏分B(5.50克)、馏分C(4.08克)、D馏分(3.65克)；对4个馏分进行神经保护活性部位筛选，确定馏分B为神经保护活性馏分；
步骤(6)、馏分B进行硅胶柱(200-300目)层析，用石油醚-乙酸乙酯洗脱系统(15:1→5:1)进行梯度洗脱，得到亚馏分B-1(1.25克)、B-2(2.06克)、B-3(1.13克)；对3个亚馏分进行神经保护活性部位筛选，确定亚馏分B-2为神经保护活性馏分；
步骤(7)、亚馏分B-2进行Sephadex LH-20凝胶柱层析，采用CH2Cl2:MeOH＝1:1(V/V)进行洗脱，得到次馏分B-2-1(0.60克)、B-2-2(1.02克)；对2个次馏分进行神经保护活性部位筛选，确定次馏分B-2-2为神经保护活性馏分；
步骤(8)、次馏分B-2-2采用制备液相色谱分离(色谱柱采用YMC-Pack ODS-A柱：250×10mm,S-5μm,12nm，流动相：25％甲醇，流速：3mL/min，波长：210nm)，得到化合物Ⅰ(7.29毫克)。
化合物Ⅰ为白色固体，HR-ESI-MS m/z 397.1033[M+H]+提示其分子式为C20H16N2O7(calcd.for C20H16N2O7，397.1036)。UV(MeOH)λmax：210、270、335nm；IRνmax：3318、1658、1610、1361cm-1；1H NMR(CDCl3，400MHz)和13C NMR(CDCl3，100MHz)数据见表1。根据化合物Ⅰ的波谱数据和HMBC和1H-1H COSY偶联相关信息，确定化合物结构如式Ⅰ所示，化学名称为：5,6,9,13-四甲氧基-吲哚骈环庚三烯-吡咯并六环内脂-2,10-二酮。
经SciFinder检索，鉴定化合物Ⅰ为一个新苯骈环庚三烯酮型生物碱。
表1.化合物Ⅰ的1H NMR、13C NMR和HMBC相关数据
Figure BDA0002787054790000041
Figure BDA0002787054790000051
Figure BDA0002787054790000052
实施例2
化合物Ⅰ神经保护活性筛选
(1)实验材料
磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)；胰蛋白酶(0.25％)；Earles缓冲液；DMEM培养基；灭活的新生牛血清；尼莫地平溶液(10mmol/L)。
(2)MTT法测定化合物Ⅰ对PC12细胞OGD/R损伤细胞存活率的影响[1]
采用含10％灭活的新生牛血清的DMEM培养基，37℃、5％CO2培养，待PC12细胞的融合度达到80％以上时，经传代操作并按照60000个/mL的密度铺满96孔板(100μL/孔)，分为空白组、模型组、阳性药组、化合物Ⅰ组，每组3个复孔；37℃、5％CO2培养24h后，化合物Ⅰ组分别加入化合物Ⅰ(终浓度1μmol/L)，阳性药组加入尼莫地平使其终浓度为5μmol/L，空白组与模型组换液处理，放置于细胞培养箱中37℃、5％CO2孵育，培养24h后，在模型组、阳性药组、化合物Ⅰ组加入无糖Earles缓冲液稀释的Na2SO4使Na2SO4终浓度为8mmol/L，缺氧缺糖损伤作用45min后，各组均加入含10％灭活的新生牛血清的DMEM完全培养基复氧复糖作用4h；在超净工作台中加入MTT(100μL/孔)，在细胞培养箱中孵育4h后，用多功能酶标仪在450nm下测定各组的OD值。
(3)实验结果
实验结果显示，化合物Ⅰ的PC12细胞存活率细胞存活率明显高于模型组，但稍低于阳性对照组(表2)。因此，化合物Ⅰ对OGD/R损伤的PC12细胞物有一定的神经保护作用。
表2.化合物Ⅰ对PC12细胞OGD/R损伤的神经保护作用
Figure BDA0002787054790000061
参考文献：
[1]刘淑娜.瑞香狼毒的化学成分和生物活性研究[D].北京:北京中医药大学,2018.

Claims (7)

1.如式Ⅰ所示的从盐附子中分离的苯骈环庚三烯酮型生物碱：
Figure FDA0002787054780000011
2.权利要求1所述的苯骈环庚三烯酮型生物碱的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤(1)、将干燥的盐附子粉碎至50-80目；先用90-100％乙醇加热回流提取3-5次，回流提取4小时/次；再用60-80％乙醇加热回流提取3-5次，回流提取4小时/次；得总提取液；
步骤(2)、总提取液在50-60℃低温真空条件下浓缩至无醇味，得到总稠膏；
步骤(3)、将总稠膏混悬于水中，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，分别得到石油醚萃取部位、二氯甲烷萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位；
步骤(4)、二氯甲烷部位进行硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯洗脱系统进行梯度洗脱，得到4个馏分：馏分A、馏分B、馏分C、馏分D；
步骤(5)、馏分B进行硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯洗脱系统进行梯度洗脱得到亚馏分B-1、B-2、B-3；
步骤(6)、亚馏分B-2进行Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱剂为CH2Cl2和MeOH的体积比为1:1，得到次馏分B-2-1、B-2-2；
步骤(7)、次馏分B-2-2采用制备液相色谱分离纯化，得到式Ⅰ所述的化合物；其中，制备液相色谱采用YMC-Pack ODS-A柱：250×10mm,S-5μm,12nm，流动相：20％-30％甲醇，流速：2-5mL/min，波长：200-350nm。
3.根据权利要求2所述的苯骈环庚三烯酮型生物碱的制备方法，其特征在于步骤(2)中，总稠膏和水的体积比为1:0.8-1.5。
4.根据权利要求2所述的苯骈环庚三烯酮型生物碱的制备方法，其特征在于步骤(4)中，硅胶柱层析采用100-200目硅胶；石油醚-乙酸乙酯洗脱系统中石油醚和乙酸乙酯体积比为20:1→1:1。
5.根据权利要求2所述的苯骈环庚三烯酮型生物碱的制备方法，其特征在于步骤(5)中，硅胶柱层析采用200-300目硅胶；石油醚-乙酸乙酯洗脱系统中石油醚和乙酸乙酯体积比为15:1→5:1。
6.权利要求1所述的苯骈环庚三烯酮型生物碱在制备神经保护药物的应用。
7.权利要求1所述的苯骈环庚三烯酮型生物碱在制备保护缺血引起的神经细胞损伤药物的用途。
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