KR20130086855A

KR20130086855A - 저융점 아가로스의 제조방법

Info

Publication number: KR20130086855A
Application number: KR1020120007894A
Authority: KR
Inventors: 이남호; 이정석; 강병식; 오태헌; 강태환
Original assignee: 강병식
Priority date: 2012-01-26
Filing date: 2012-01-26
Publication date: 2013-08-05

Abstract

본 발명은 제조과정이 간편하여 경제적이며, 매우 작은 핵산 분자를 높은 해상도로 분리할 수 있는 저융점 아가로스의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 탈색 건조한 한천에 산을 첨가하여 열수 추출하는 단계; 열수 추출한 수득물을 여과하고 알칼리를 첨가하여 중화시키는 단계; 중화된 수득물을 건조 및 분쇄하여 저분자화 한천을 제조하는 단계; 저분자화된 한천에 DMSO를 첨가하여 아가로스를 추출하는 단계; 및 아가로스 추출물을 원심분리하고 얻은 상등액에 아세톤을 첨가하여 침전물을 수득하고, 침전물은 EDTA로 세척하는 단계를 포함하는 저융점 아가로스의 제조방법 및 상기 방법으로 제조한 저융점 아가로스에 관한 것이다. 본 발명에 따른 저융점 아가로스 제조방법은 한천원조로부터 한천 추출시 pH를 낮추어 추출하고, DMSO 및 EDTA의 순차적인 처리를 통해 저융점 범위를 가지며 순도가 높은 전기영동급 저융점 아가로스를 제조할 수 있어, 종래 방법에 비해 제조공정이 간편하고 경제성이 높으며 품질도 우수한 새로운 저융점 아가로스 제조방법을 제공할 수 있는 효과가 있다.

Description

저융점 아가로스의 제조방법{Method for production of Low melting agarose}

본 발명은 매우 작은 분자량을 갖는 핵산을 분리하는데 사용되는 고순도의 저융점 아가로스를 매우 간편하게 제조하는 방법에 관한 것이다.

아가로스는 전기영동의 기술발달과 이에 따라 파생된 전기영동기법에 대응하는 다양한 제품군을 형성하고 있다. 핵산(DNARNA)의 분자량 크기에 따라 효율적인 전기영동을 수행하기 위해서 아가로스 자체의 분자량에 따라 최대최소의 겔 형성 농도범위를 가질 수 있으며, 그러한 겔 농도에 따라 능률적이고 세밀한 핵산 분리력을 가진 아가로스의 제품화가 가능하다.

또한, 이러한 아가로스 제조를 위해 일반적으로 한천이 많이 사용되고 있는데, 한천은 우뭇가사리와 같은 홍조류에서 추출한 고점도의 복합 다당류로서 식품원료, 미생물배지, 화장품, 분자생물학적 연구 등의 다양한 용도로 활용되고 있으며, 주요 구성성분은 아가로스(agarose)와 아가로펙틴(agaropectin)이며, 일반적으로 두 가지 성분의 비율은 7:3 정도로 함유되어 있다.

아가로스는 주로 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose)와 D-갈락토오스(D-galactose)가 연속적으로 결합하여 직선형의 고분자를 이루고 있으며, 아가로펙틴은 아가로스형 쇄상구조에 황산, 피루브산, 글루크론산염 등이 결합되어 있는 불균일한 다당체로서 황산에스테르 함량이 가장 많고, 겔화능이 없는 갈락탄(galactan)도 포함된다.

한편, 일반적인 아가로스는 여러 가지 제법을 통해서 순수 아가로스만 다량으로 분리하는데 초점을 맞춰 개발된 제품으로서 극히 짧은 단편의 핵산을 분리 및 확인하는데는 많은 어려움이 있으며, 또한 핵산 단편을 분리하더라도 각 단편간의 미세한 염기쌍(base pair) 차이는 일반적인 아가로스 겔 상에서는 명확하게 구별하기 어려운게 현실이다.

이에 최근에는 PCR 등의 기법이 생명공학자 뿐만 아니라 의학계 등에서도 널리 사용되면서 미세 핵산 단편을 이용한 연구가 매우 활발하다. 이러한 작은 단편을 분리하기 위해 연구자들은 그동안 일반적으로 사용되는 아가로스의 농도를 높이거나, 전기영동 시간을 짧게 하거나, 낮은 전압하에서 전기영동을 실시하거나, 전기영동용 버퍼(buffer)를 달리 사용하는 등의 방법을 많이 이용해 왔다. 그러나 이러한 방법을 사용하더라도 50 염기쌍 이하의 작은 단편을 분리하는데는 많은 어려움이 있어 왔다.

따라서 이러한 작은 단편의 분리를 위한 용도로 개발된 대표적인 제품으로 미국 FMC Bioproducts사의 Nusieve 3:1 아가로스가 있으나, 기존에 존재하는 일반 아가로스와 극소 단편 아가로스의 혼합 형태에 지나지 않기 때문에 진정 저분자 분리용에 특수하게 제작되었다고 보기는 어려울 뿐만 아니라, 제조과정도 복잡하여 제조 시간 및 비용도 많이 든다는 문제점이 있다.

따라서 종래 제조 단가보다 저비용으로 제조할 수 있으며, 제조공정도 간편하고 동시에 작은 DNA 단편을 높은 해상도로 분리 및 확인할 수 있는 새로운 아가로스 제조방법에 대한 개발이 시급한 실정이다.

따라서 본 발명의 목적은 제조과정이 간편하여 경제적으로 효과가 있고 매우 작은 핵산 분자를 높은 해상도로 분리할 수 있는 저융점 아가로스의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 방법에 의해 제조되고, 황산기 함량이 0.15 이하이며, EEO(-m_r) 값이 0.15 이하인 저융점 아가로스를 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은,

탈색 건조한 한천에 산을 첨가하여 열수 추출하는 단계;

열수 추출한 수득물을 여과하고 알칼리를 첨가하여 중화시키는 단계;

중화된 수득물을 건조 및 분쇄하여 저분자화 한천을 제조하는 단계;

저분자화된 한천에 DMSO를 첨가하여 아가로스를 추출하는 단계; 및

아가로스 추출물을 원심분리하고 얻은 상등액에 아세톤을 첨가하여 침전물을 수득하고, 침전물은 EDTA로 세척하는 단계를 포함하는, 저융점 아가로스의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 한천은 우뭇가사리, 돌가사리목, 분홍치목, 비단풀목 또는 지누아리목으로부터 유래한 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 산을 첨가하여 열수 추출하는 단계는 황산, 염산, 질산, 인산, 초산, 설포닌산, 카르복실산 또는 구연산을 첨가하여 pH가 1.5~4.5가 되도록 하고, 80~140℃의 온도에서 열수 추출하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, DMSO를 첨가하여 아가로스를 추출하는 단계는 50~100℃의 온도에서 3~10시간 동안 수행하고, 이때 한천과 DMSO의 혼합비는 1:3~1:200(부피비)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, EDTA로 세척하는 단계는 EDTA, NaEDTA 또는 Na₂EDTA를 0.02 ~ 0.1 M의 농도로 첨가하고, 20 ~ 80℃에서 10 ~ 48시간 수행하며, 이때 침천물 대 EDTA는 1:0.5~1:20(부피비)의 비로 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 방법에 의해 제조되고, 황산기 함량이 0.15 이하이며, EEO(-m_r) 값이 0.15 이하인 저융점 아가로스를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 저융점 아가로스는 1~50bp의 저분자 핵산 단편을 분리할 수 있다.

본 발명은 탈색 건조한 한천에 산을 첨가하여 열수 추출하는 단계; 열수 추출한 수득물을 여과하고 알칼리를 첨가하여 중화시키는 단계; 중화된 수득물을 건조 및 분쇄하여 저분자화 한천을 제조하는 단계; 저분자화된 한천에 DMSO를 첨가하여 아가로스를 추출하는 단계; 및 아가로스 추출물을 원심분리하고 얻은 상등액에 아세톤을 첨가하여 침전물을 수득하고, 침전물은 EDTA로 세척하는 단계를 포함하는 저융점 아가로스의 제조방법 및 상기 방법으로 제조한 저융점 아가로스에 관한 것이다. 본 발명에 따른 저융점 아가로스 제조방법은 한천원조로부터 한천 추출시 pH를 낮추어 추출하고, DMSO 및 EDTA의 순차적인 처리를 통해 저융점 범위를 가지며 순도가 높은 전기영동급 저융점 아가로스를 제조할 수 있어, 종래 방법에 비해 제조공정이 간편하고 경제성이 높으며 품질도 우수한 새로운 저융점 아가로스 제조방법을 제공할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 따른 저융점 아가로스의 제조과정을 모식도로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 방법으로 제조된 저융점 아가로스와 시판 아가로스를 대상으로 아가로스의 EEO(electroendomosis)를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 방법으로 제조된 저융점 아가로스와 시판 아가로스를 3%의 겔 농도로 제조한 후, 핵산의 전기영동 해상도를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 방법으로 제조된 저융점 아가로스를 5% 겔농도로 제조한 후, 저분자 핵산의 분리능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 제조과정이 간편하여 경제적이며, 매우 작은 핵산 분자를 높은 해상도로 분리할 수 있는 저융점 아가로스의 제조방법을 제공함에 특징이 있으며, 보다 구체적으로 본 발명은 탈색 건조한 한천에 산을 첨가하여 열수 추출하는 단계; 열수 추출한 수득물을 여과하고 알칼리를 첨가하여 중화시키는 단계; 중화된 수득물을 건조 및 분쇄하여 저분자화 한천을 제조하는 단계; 저분자화된 한천에 DMSO를 첨가하여 아가로스를 추출하는 단계; 및 아가로스 추출물을 원심분리하고 얻은 상등액에 아세톤을 첨가하여 침전물을 수득하고, 침전물은 EDTA로 세척하는 단계를 포함하는 저융점 아가로스의 제조방법을 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명에서 제공하는 저융점 아가로스 제조방법을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

먼저, 탈색 건조한 한천에 산을 첨가하여 열수 추출하는 단계를 수행한다.

본 발명에서 상기 한천은 시중에 판매되고 있는 한천이라면 모두 사용가능하며, 바람직하게는 한천원조인 홍조류, 즉 우뭇가사리, 돌가사리목, 분홍치목, 비단풀목 및 지누아리목에 속하는 해조중 중에서 선택된 1종으로부터 유래된 것을 사용할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 우뭇가사리 유래 한천을 사용하였다.

또한, 탈색과 건조는 담수를 이용하여 한천원조를 세척하고 일광을 사용하여 건조시킬 수 있으며, 이러한 과정은 한천원조에 남아있는 염분 및 이물질이 완전히 제거될 수 있도록 반복 수행할 수 있다.

또한, 상기 산을 첨가하여 열수 추출하는 과정은 본 발명의 저융점 아가로스 제조 과정에서 매우 중요한 단계로서 본 발명에서는 아가로스 제조를 위한 다른 공정에 앞서 먼저 한천원조로부터 한천을 추출하는 과정에서 일차적으로 산을 첨가하여 열수 추출하는 과정을 통해 pH를 낮추어 저융점 범위를 갖는 한천을 수득할 수 있다.

한천을 가수분해하기 위해 첨가할 수 있는 산으로는 이에 제한되지는 않으나, 황산, 염산, 질산, 인산, 초산, 설포닌산, 카르복실산 및 구연산을 사용할 수 있으며, 이러한 산을 첨가하여 산 분해 및 열수 추출은 pH 1.5~4.5 및 80~140℃의 온도조건에서 수행할 수 있다.

이러한 과정으로 수득한 한천 성분을 포함하는 열수 추출물은 이후 여과 및 알칼리 첨가에 의한 중화반응을 수행하며, 중화 반응 후 반응물은 건조시킨다.

이때 상기 열수 추출물의 여과는 당업계에서 사용되고 있는 여과막을 이용한 방법을 사용할 수 있고, 중화반응에 사용될 수 있는 알칼리 물질로는 산 용액을 중성으로 만들수 있는 알칼리 성질을 갖는 용액이라면 모두 사용할 수 있는데, 바람직하게는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘 또는 수산화바륨을 사용하여 pH가 7.0이 되도록 중화시킨다.

중화단계가 완료되면 반응물은 이후 건조과정을 수행할 수 있는데, 건조 방법으로는 이에 제한되지는 않으나, 동결결조, 분무건조, 감압건조 또는 자연증발건조 방법을 사용할 수 있다.

건조된 한천은 이후 분쇄과정을 통해 저분자화 한천을 제조할 수 있는데, 분쇄는 당업계에 사용되고 있는 분쇄방법, 예컨대 분쇄기를 이용한 방법을 사용할 수 있다.

저분자화된 한천은 이후 고순도의 아가로스 제조를 위해 DMSO를 첨가하여 아가로스를 추출하는 과정을 수행할 수 있다.

DMSO 용매는 아가로스를 선택적으로 용해시키는 성질을 가지고 있으며, 낮은 독성과 높은 한천 농도에서도 아가로팩틴을 분리시킬 수 있으며, 특히 본 발명에서는 고순도 아가로스의 제조를 위해 DMSO 첨가하여 아가로스를 추출하는 최적 조건으로 50~100℃의 온도에서 3~10시간 동안 추출하는 것이 가장 바람직하다는 것을 확인하였다.

이는 DMSO를 첨가하고 50℃ 미만의 온도에서 3시간 미만으로 추출을 수행하는 경우, 아가로스의 추출 수율이 낮다는 문제점이 있고, 반면 100℃를 초과하는 온도에서 10시간을 초과하여 추출을 수행하는 경우 아가로스의 품질이 저하되는 문제점이 있다. 따라서 상기 조건 하에서 DMSO에 의한 추출과정을 수행하는 것이 좋다.

또한, 이때 상기 한천에 첨가되는 DMSO의 첨가비, 즉 한천과 DMSO와의 혼합비는 1:3~1:200(부피비)일 수 있다.

DMSO를 첨가하여 아가로스를 추출하는 과정이 완료되면, 이후 상기 추출물은 원심분리하고 상등액을 수득한 후, 상기 상등액에 증류수 또는 유기용매를 사용하여 침전물을 수득한다.

이때 사용할 수 있는 상기 유기용매로는 이에 제한되지는 않으나, 아세톤, 알콜, 메탄올, 부탄올, 이소프로판 알콜을 사용할 수 있고, 바람직하게는 아세톤을 사용할 수 있다.

이후 수득한 침전물은 EDTA를 첨가하여 세척하는 과정을 통해 전기영동급 저융점 아가로스를 수득한다.

한편, EDTA(ethylene diamine tetra acetic acid)는 황산기의 제거 효과가 우수하고 수산화알류미늄 겔이 아가로팩틴을 흡착하는 원리를 사용하여 고순도의 아가로스를 제조하는데 기여할 수 있다.

그러나 이러한 EDTA를 장시간 처리하는 경우 한천의 가수분해로 고강도 및 고순도의 아가로스 제조가 어려운 문제점이 있어 EDTA의 처리 조건 또한 본 발명의 저융점 아가로스 제조 과정에서 중요한 단계라 할 수 있다.

따라서 본 발명에서 상기 EDTA 세척을 위해 사용할 수 있는 EDTA로는 EDTA, NaEDTA 또는 Na₂EDTA를 사용할 수 있고, 이때 이들의 사용농도는 0.02 ~ 0.1 M의 농도범위로 첨가할 수 있다.

또한, EDTA 세척 조건은 20 ~ 80℃의 온도에서 10 ~ 48시간 동안 수행하는 것이 바람직하며, 이때 침천물 대 EDTA는 1:0.5~1:20(부피비)의 비가 되도록 EDTA를 첨가하는 것이 바람직하다.

또한, EDTA 세척은 침천물에 EDTA를 첨가하고 교반 세척하는 과정으로 수행할 수 있으며, 세척 과정에 완료된 후에는 EDTA를 제거하기 위해 증류수를 이용하여 세척하고 건조하는 단계를 수행할 수 있다.

이상과 같이, 본 발명의 방법으로 제조된 저융점 아가로스는 전기영동을 위한 아가로스로 사용할 수 있으며, 기존에 판매되고 있는 아가로스에 비해 더욱 순도가 높고 제조과정도 간편하여 종래 방법에 비해 보다 경제적인 특징이 있다.

나아가 본 발명에 따라 제조된 상기 저융점 아가로스는 황산기 함량이 0.15 이하이며, EEO(-m_r) 값이 0.15 이하이고, 1~50bp의 저분자 핵산 단편도 높은 해상도로 분리시킬 수 있다.

이를 확인하기 위해 본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명에서 제조된 저융점 아가로스와 시판 아가로스를 대상으로 황산기 함량, 겔 융해점 및 겔강도의 이화학적 특성을 비교 분석하였는데, 그 결과, 본 발명에 따른 저융점 아가로스의 경우 시판 아가로스에 비해 황산기 함량이 더 낮은 것으로 나타났고, 반면 겔강도는 더 높은 것으로 나타났다(표 1 참조). 특히 황산기 함량은 0.05±0.02(%)인 것으로 나타났다.

또한, 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 본 발명에서 제조한 저융점 아가로스를 시판 아가로스와 EEO(electroendomosis) 값을 비교 분석하였는데, 그 결과 본 발명의 저융점 아가로스가 시판 아가로스와 거의 동일하게 나타났다(도 2 참조).

EEO는 일반적으로 전기영동에 있어서 중성 분자의 움직임 현상을 나타내는 값으로서 아가로스 겔 내에 존재하는 황산기, pyruvic acid 및 회분 함량에 영향을 받으며, 측정은 0.5M barbital buffer 상에 덱스트란과 알부민의 이동거리를 계산하여 나타내는데, 전기영동 상에서 중성 덱스트란은 음극으로 이동하며 그 이동 속도는 황산기 함량에 따라 차이가 있는 것으로 알려져 있다. 이와 반대로 알부민은 양극으로 이동하며, 덱스트란과 마찬가지로 아가로스 황산기 함량에 비례하여 이동 속도는 나타낸다. 즉, 아가로스의 황산기 함량이 많을수록 알부민과 덱스트란의 움직임은 비례하여 빠른 이동 속도를 나타내며, 덱스트란의 이동거리(x)와 덱스트란과 알부민의 거리(y) 비율(x/y)에서 EEO(-m_r)은 황산기 함량에 비례한다.

또한, 본 발명에서 제조된 저융점 아가로스는 1~50bp의 저분자 핵산 단편을 높은 해상도로 분리할 수 있는 특징이 있다.

핵산 분리를 위해 사용되고 있는 범용 아가로스의 경우, 약 120,000 이상의 평균분자량(Average molecular weight)를 가지며, 일반적인 핵산(500 bp ~ 23 kb) 분리에 사용되고 있을 뿐, 낮은 분자량을 갖는 핵산 분리에는 사용되지 못하고 있다.

반면 시중에 판매되고 있는 저융점 아가로스(Low melting agarose)는 고농도(4% 이상)로 겔을 성형하여 극히 낮은 분자량을 갖는 핵산을 분리하는데 이용되고 있는데, 겔의 융점으로 아가로스를 규격화하고 있는 것이 특징이다. 약 10 ~ 1,000 bp의 핵산의 분석용으로 개발되었으며, 통상 3 ~ 4%의 농도로 겔을 제작하여 사용하는데, 핵산의 크기에 따라서 2 ~ 6% 범위에서도 겔의 농도를 조절하여 사용하기도 한다. 그러나 종래 시판되고 있는 저융점 아가로스(Low melting agarose)의 경우 제조과정이 복잡하고 시간과 비용이 많이 들고 있고 비경제적인 문제점이 있다.

이러한 점을 고려할 때 본 발명에서 제공하는 저융점 아가로스의 새로운 제조방법은 그 과정이 간편하고 비용도 많이 들지 않으며, 아주 작은 분자량을 갖는 핵산을 고해상으로 분리할 수 있는 고순도 저융점 아가로스를 제공할 수 있다는 효과가 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

우뭇가사리를 이용한 저융점 아가로스의 제조

제주도 하도 어촌계에서 2010년 8월에 구입한 우뭇가사리를 담수를 이용하여 세척하고 일광건조 과정을 5회에 거쳐 수행하여 우뭇가사리를 탈색하였다. 이후 건조 보관된 60g의 우뭇가사리를 2L Duran병에 취하고 미리 준비된 담수(황산을 가하여 pH 2.3으로 조절함) 2 L로 120℃에서 1 시간 동안 가압 추출하였다. 그런 다음 나일론천을 사용하여 여과하고 수산화나트륨을 사용하여 중화시킨 다음, 이를 감압 상온조건으로 건조하여 저분자화 된 한천을 제조하였다. 이후, 저분자화된 한천 20 g에 DMSO를 100 mL 가하여 60 ℃에서 3시간 동안 아가로스를 추출하고 원심분리 한 다음, 상층액의 4배에 해당하는 아세톤에 침전하여 침전물을 얻고 0.02 M Na₂EDTA 150 mL로 상온에서 12시간 동안 교반 수세 후 증류수 세척과 건조과정으로 저융점 아가로스를 제조하였다.

실험예 1: 이화학적 특성

상기 실시예 1에서 제조한 본 발명의 저융점 아가로스를 대상으로 황산기 함량, 겔 융해점 및 겔 강도를 측정하였는데, 이때 대조군으로는 시판중인 저융점 아가로스(NuSive GTG)를 사용하였다.

먼저, 황산기 함량 분석을 위해, 3 mg 시료(본 발명에서 제조한 저융점 아가로스)를 1 N HCl로 105℃에서 5시간 동안 산 가수분해 시키고, 원심분리(10,000 × g, 5 min)하여 상층액 0.2 mL을 취하고 3.8 mL의 4% TCA 용액을 첨가한 후 미리 준비된 BaCl₂ - gelatin 시약 1 mL(증류수 400 mL에 gelatin 2 g을 넣고 65℃에서 용해 후 4℃에서 하룻밤 방치한 뒤 BaCl2 2 g을 녹인 후 2시간 방치하여 제조)를 첨가하여 20분간 방치한 다음 spectrophotometer(Libra S22, Biochrom Inc, England)를 이용하여 360 nm에서 흡광도를 측정하였고, 검량선은 K₂SO₄를 표준 황산염으로 하여 계산하였다.

또한, 겔 융해점은 4% 시료 용액을 외경 2 cm 스크류 시험관에 5 mL를 분주하여 20℃에 하룻밤 방치하고, 열 조절이 가능한 수욕조에 뒤집어서 고정 후 온도를 서서히 가열하여 시료 겔이 떨어지는 온도를 측정하였다.

겔 강도 측정은 4% 시료 용액을 외경 5 cm 원통형 틀에 30 mL를 분주하고 20℃ 실내에서 하룻밤 방치하여 레오메타(TA-XT 2, Stable Micro Systems, England)로 파단강도를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

	황산기 함량(%)^A	겔 융해점(℃)^B	겔강도(g/cm²)^C
실시예	0.05 ± 0.02	64 ± 0.8	622 ± 3
비교예 1	0.07 ± 0.01	63 ± 0.5	599 ± 9

분석 결과, 상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따라 제조한 저융점 아가로스의 이화학적 특성은 시판 아가로스와 매우 유사하게 나타났으며, 따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 시판 아가로스에 비해 훨씬 제조방법이 간편한 본 발명의 방법을 통해 저융점 아가로스를 용이하게 제조할 수 있음을 알 수 있었다.

실험예 2: EEO (- mr ) 특성

또한, 본 발명자들은 본 발명에서 제조한 저융점 아가로스의 EEO(-mr)값을 분석하기 위해, 0.05 M의 barbital buffer(pH 8.6)를 사용하여 1% (v/w) 아가로스 겔을 제조하고, buffer에 용해시킨 10 mg/mL의 덱스트란(dextran, Sigma, U.S.A.)과 2 mg/mL의 알부민(human albumin, Sigma, U.S.A.)을 아가로스 홀(hole)에 각각 3 μL 씩 주입한 다음, 50 V에서 1.5 시간 동안 전기영동을 수행하였다. 이후 이동된 덱스트란은 에탄올로 변성시켜 확인하고 인간 알부민은 아미도블랙(amido black(Sigma, U.S.A.))으로 염색시킨 다음, 이동된 거리를 측정하여 EEO(-mr)를 구하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 저융점 아가로스의 EEO(-mr)값은 시판 아가로스와 거의 동일한 것으로 나타났다.

실험예 3: 전기영동

나아가 본 발명자들은 실제 본 발명에서 제조한 저융점 아가로스 겔이 분자량이 매우 작은 시료도 잘 분리할 수 있는지 확인하기 위해 시판 아가로스를 대상으로 전기영동을 수행하였는데, 이를 위해 먼저 겔 농도를 3% 및 5%로 각각 제작하여(TAE buffer) 전기영동을 수행하였고, DNA ladder는 55 ~ 1,000 bp를 사용하였으며, 50V 전압으로 전개하였다.

그 결과, 도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 제조한 아가로스의 경우, 핵산 전개 속도와 해상도가 시판 아가로스와 동일 수준인 것으로 확인되었고, 약 20bp의 매우 작은 분자량도 매우 높은 해상도로 분리할 수 있음을 확인함에 따라 궁극적으로 본 발명자들은 종래 아가로스 제조방법 보다 시간과 비용을 감소시킬 수 있어 경제성이 우수한 신규한 저융점 아가로스 제조방법을 제공할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

탈색 건조한 한천에 산을 첨가하여 열수 추출하는 단계;
열수 추출한 수득물을 여과하고 알칼리를 첨가하여 중화시키는 단계;
중화된 수득물을 건조 및 분쇄하여 저분자화 한천을 제조하는 단계;
저분자화된 한천에 DMSO를 첨가하여 아가로스를 추출하는 단계; 및
아가로스 추출물을 원심분리하고 얻은 상등액에 아세톤을 첨가하여 침전물을 수득하고, 침전물은 EDTA로 세척하는 단계를 포함하는, 저융점 아가로스의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 한천은 우뭇가사리, 돌가사리목, 분홍치목, 비단풀목 또는 지누아리목으로부터 유래한 것을 특징으로 하는 저융점 아가로스의 제조방법.
제1항에 있어서,
산을 첨가하여 열수 추출하는 단계는 황산, 염산, 질산, 인산, 초산, 설포닌산, 카르복실산 또는 구연산을 첨가하여 pH가 1.5~4.5가 되도록 하고, 80~140℃의 온도에서 열수 추출하는 것을 특징으로 하는 저융점 아가로스의 제조방법.
제1항에 있어서,
DMSO를 첨가하여 아가로스를 추출하는 단계는 50~100℃의 온도에서 3~10시간 동안 수행하고, 이때 한천과 DMSO의 혼합비는 1:3~1:200(부피비)인 것을 특징으로 하는 저융점 아가로스의 제조방법.
제1항에 있어서,
EDTA로 세척하는 단계는 EDTA, NaEDTA 또는 Na₂EDTA를 0.02 ~ 0.1 M의 농도로 첨가하고, 20 ~ 80℃에서 10 ~ 48시간 수행하며, 이때 침천물 대 EDTA는 1:0.5~1:20(w/v)의 비로 사용하는 것을 특징으로 하는 저융점 아가로스의 제조방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법으로 제조되고, 황산기 함량이 0.15 이하이며, EEO(-m_r) 값이 0.15 이하인 저융점 아가로스.
제6항에 있어서,
상기 저융점 아가로스는 1~50bp의 저분자 핵산 단편을 분리할 수 있는 것을 특징으로 하는 저융점 아가로스.