KR101875115B1

KR101875115B1 - 해조류 유래 아가로스를 이용한 하이드로겔 폼의 제조방법 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101875115B1
Application number: KR1020170082979A
Authority: KR
Inventors: 신현재; 김용운; 이관훈
Original assignee: 농업회사법인 주식회사 오션푸드코리아; 조선대학교산학협력단
Priority date: 2017-06-30
Filing date: 2017-06-30
Publication date: 2018-07-10

Abstract

본 발명은 해조류 유래 아가로스를 이용한 하이드로겔 폼의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 하이드로겔 폼의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 (1) 해조류를 알칼리 침지시켜 추출물을 수득하는 단계; (2) 상기 추출물을 이용하여 겔을 형성하는 단계; (3) 겔을 동결건조시키고, 이후 마이크로웨이브를 처리하여 상기 해조류로부터 한천을 수득하는 단계; 및 (4) 상기 수득한 한천을 DMSO(dimethyl sulfoxide) 용액에 첨가하고 80~100 ℃의 온도에서 20~24시간 동안 반응시켜 아가로스를 추출하는 단계를 포함하는 해조류로부터 고순도의 아가로스를 제조하는 방법, 해조류 유래 아가로스를 이용한 하이드로겔 폼의 제조방법, 하이드로겔 폼을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물 및 상처 치유용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

해조류 유래 아가로스를 이용한 하이드로겔 폼의 제조방법 및 이의 용도{Manufacturing method for hydrogel foam using agarose form seaweed}

본 발명은 해조류 유래 아가로스를 이용한 하이드로겔 폼의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 하이드로겔 폼의 용도에 관한 것이다.

해조류는 미래식량자원으로 각광 받고 있는 바이오매스(biomass)이다. 전 세계 해조류 생산량은 23,776,449 톤이며 이중 국내 생산량은 1,022,326 톤으로 전 세계의 생산량 중 4.3%를 차지하고 있다. 한천의 원료가 되는 홍조류의 생산량은 3,600톤에 이르지만 한천의 주원료인 우뭇가사리는 일본으로 대부분이 수출되는 실정으로, 홍조류 생산량 중 400톤은 해외로 수출되고 다시 정제 및 고부가가치의 제품의 형태로 역수입 되고 있다.

한천(agar)은 보통 우뭇가사리과의 해초를 사용하여 열수추출액의 응고물인 우무를 얼려 말린 해조가공품으로서 넓게는 식품, 의약제품, 실험재료, 화장품 등 다양한 산업분야에서 사용되는 고부가가치 재료이고, 홍조류에 함유되어 있는 점액질의 복합다당류로, 아가로스(agarose)와 아가로펙틴(agaropectin)이 각 70%와 30%로 구성되어 있다.

특히 아가로스(agarose)는 한천을 함유하고 있는 해조류로부터 분리 및 정제된 갈락탄 친수성콜로이드로서 친수성의 성질을 가지며 이온 존재에 의한 전하를 띠지 않고, 투명하고 겔 형성능이 우수하여 전기영동, 고정화 효소운반체, 어피니티 크로마토그래피 운반체 등 다양한 용도로 사용되고 있다.

따라서 이렇게 다양한 산업 용도를 가지는 아가로스를 한천 또는 해조류로부터 대량 생산하려는 기술들이 개발되고 있으며, 한천으로부터 아가로스를 제조하는 대표적인 방법으로는 한천을 아세틸화시킨 후, 클로로폼에서 분획화하는 방법이 있고, 한천용액에 세틸피리디늄클로라이드를 첨가하여 아가로펙틴을 침전시키고 원리분리하여 아가로스를 분리하는 방법이 있으며, 또 다른 방법으로는 황산화된 다당류인 카라키난을 첨가하여 침전물의 크기를 증가시켜 여과하는 방법, 아가로펙틴을 수산화알루미늄에 흡착시키는 방법이 있다. 그러나 이러한 방법으로는 아가로스를 고순도로 대량 생산하기에는 역부족이기에 보다 효율적인 아가로스 생산방법의 개발이 필요한 실정이다.

한편, 하이드로겔(hydrogel)은 콘텍트 렌즈, 의료용 전극, 세포 배양 등에서 많이 사용되며 특수한 용도로 성형 재료나 토양 수분 저장용, 화상 상처용 드레싱 용도 등 다양하게 쓰인다. 이는 하이드로겔이 공유 결합, 수소결합, 반데르 발스 결합 또는 물리적 결합 등과 같은 응집력에 의해 가교된 친수성 고분자이며, 수용액상에서 다량의 물을 내부에 함유하여 팽윤할 수 있는 3차원 고분자 네트워크 구조를 갖는 물질이기 때문이다. 또한 하이드로겔은 표면 고분자 사슬이 높은 유동성을 가지며 낮은 표면장력을 나타내어 하이드로겔 내외부로부터 물질 전달을 용이하게 할 수 있는 특성이 있고, 친수성의 확산 표면과 연하고 고무적인 성질은 다량의 수분을 함유할 수 있으며 높은 생체 적합성을 갖는 특징이 있다.

따라서 하이드로겔을 각종 산업용 제품으로 개발하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다.

이에 본 발명자들은 종래 제품에 비해 더욱 품질이 우수한 해조류 유래 아가로스를 이용한 하이드로겔 폼의 제조방법을 확립하였고, 제조된 하이드로겔 폼을 기능성 화장료 조성물, 의약 조성물 및 식품용 조성물에 활용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국 특허출원 제10-2014-0089858호

따라서 본 발명의 목적은 해조류로부터 고순도의 아가로스를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 해조류 유래 아가로스를 이용한 하이드로겔 폼의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 해조류 유래 아가로스를 이용한 하이드로겔 폼을 유효성분으로 포함하는, 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 해조류 유래 아가로스를 이용한 하이드로겔 폼을 유효성분으로 포함하는, 상처 치유용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은, (1) 해조류를 알칼리 침지시켜 추출물을 수득하는 단계; (2) 상기 추출물을 이용하여 겔을 형성하는 단계; (3) 겔을 동결건조시키고, 이후 마이크로웨이브를 처리하여 상기 해조류로부터 한천을 수득하는 단계; 및 (4) 상기 수득한 한천을 DMSO(dimethyl sulfoxide) 용액에 첨가하고 80~100 ℃의 온도에서 20~24시간 동안 반응시켜 아가로스를 추출하는 단계를 포함하는, 해조류로부터 고순도의 아가로스를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 해조류는 홍조류로서 우뭇가사리, 꼬시래기, 진두발 또는 갈래곰보일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (1) 단계의 알칼리 침지는 수산화나트륨 용액, 수산화칼슘 용액, 수산화칼륨 용액, 탄산나트륨 용액 또는 탄산수소나트륨 용액을 이용하여 침지시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (1) 단계의 추출물 수득은 알칼리 용액으로 침지된 상태에서 110~125℃의 온도에서 1시간~2시간 동안 추출하여 수득하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (4) 단계에서 한천은 0.5~5%의 농도로 DMSO(dimethyl sulfoxide) 용액에 첨가하는 것일 수 있다.

또한 본 발명은, (1) 해조류를 알칼리 침지시켜 추출물을 수득하는 단계; (2) 상기 추출물을 이용하여 겔을 형성하는 단계; (3) 겔을 동결건조시키고, 이후 마이크로웨이브를 처리하여 상기 해조류로부터 한천을 수득하는 단계; (4) 상기 수득한 한천을 DMSO(dimethyl sulfoxide) 용액에 첨가하고 80~100 ℃의 온도에서 20~24시간 동안 반응시켜 아가로스를 추출하는 단계; 및 (5) 상기 추출한 아가로스를 110~125 ℃의 온도에서 10~30분 동안 오토클레이브하여 아가로스 졸을 제조하는 단계; 및 (6) 아가로스 졸을 몰드에 붓고 동결건조하는 단계를 포함하는, 해조류 유래 아가로스를 이용한 하이드로겔 폼의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 해조류 유래 아가로스를 이용한 하이드로겔 폼을 유효성분으로 포함하는, 화장료 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른해조류 유래 아가로스를 이용한 하이드로겔 폼을 유효성분으로 포함하는, 상처 치유용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 해조류로부터 고순도의 아가로스를 제조하는 방법, 해조류 유래 아가로스를 이용한 하이드로겔 폼의 제조방법 및 하이드로겔 폼을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물과 상처 치유용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 아가로스 제조방법은 저비용으로 고순도의 아가로스를 제조할 수 있어 종래 해외수입에 의존하였던 아가로스를 국내기술로 제조할 수 있도록 하였고, 이를 이용한 하이드로겔 폼은 수분흡수성이 높고 인체 온도범위에서도 수분 지속력이 우수할 뿐만 아니라 열적 안정성이 있고 세포에 독성을 유발시키지 않아 인체 안정한 특징이 있어, 상처드레싱, 콘텍트렌즈, 약제, 화장품, 보형물, 폐수처리제 등을 포함하는 의약, 미용, 환경 산업 분야 등에서 널리 활용될 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에서 우뭇가사리와 꼬시래기로부터 한천을 추출하는 과정을 나타낸 사진이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에서 제조한 우뭇가사리와 꼬시래기 유래 한천 및 아가로스에 대한 열적특성을 DSC 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 3은 우뭇가사리 유래 한천, 꼬시래기 유래 한천 및 상업용 한천에 대한 FT-IR 분석 결과를 나타낸 것으로, 3a는 650-4000cm^-1 에서의 결과이고, 3b는 650-1500cm^-1 에서의 결과를 나타낸 것으로, 각 도면에서 (a)는 우뭇가사리 유래 한천이고, (b)는 꼬시래기 유래 한천이며, (c)는 상업용 아가(브레드가든)이다.
도 4는 아가로스에 대한 FT-IR 분석 결과를 나타낸 것으로, 4a는 650-4000cm^-1 에서의 결과이고, 4b는 650-1500cm^-1 에서의 결과이며, 각 도면에서 (a) DMSO 아가로스, (b) 키토산을 처리하여 수득한 아가로스, (c)는 지올라이트를 처리하여 수득한 아가로스, (d)는 본 발명에 따른 꼬시래기 한천 유래 DMSO로 추출된 아가로스, (e)는 본 발명에 따른 우뭇가사리 한천 유래 DMSO로 추출된 아가로스를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 한천 및 아가로스의 세포 독성 여부를 분석한 결과를 나타낸 것으로, Agarose, 3% breadgarden, G.A.N: Gelidiumamansii normal(산처리 하지 않은 우뭇가사리), G.A.A: Gelidiumamansii acid (산처리 한 우뭇가사리)를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 해조류 유래 아가로스를 함유한 하이드로겔 폼의 특성을 분석한 것으로, 6a는 하이드로겔 폼의 농도 및 온도에 따른 팽윤비 결과를 나타낸 것이고, 6b는 하이드로겔 폼의 농도 및 pH에 따른 팽윤비 결과를 나타낸 것이며, 6c는 아가로스 농도와 시간에 따른 팽윤비 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 농도별 아가로스 폼에 대한 형태를 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에서 제조한 하이드로겔 폼의 사진을 나타낸 것으로, 아가로스 농도별 제조된 하이드로겔 폼이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에서 꼬시래로부터 추출한 한천에 대한 ¹³C NMR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에서 우뭇가사리로부터 추출한 한천에 대한 ¹³C NMR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일실시예에서 꼬시래로부터 추출한 아가로스에 대한 ¹³C NMR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일실시예에서 우뭇가사리로부터 추출한 아가로스에 대한 ¹³C NMR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 (a) 꼬시래기로부터 제조한 아가로스의 ¹H NMR 결과를 나타낸 것이고, (b) 우뭇가사리로부터 제조한 아가로스의 ¹H NMR 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 해조류로부터 고순도의 아가로스를 제조하는 방법 및 해조류 유래 아가로스를 이용한 하이드로겔 폼의 제조방법을 제공함에 특징이 있다.

현재 국내에서는 아가(즉, 한천)의 생산은 비교적 높은 편이나, 아가로스(agarose)에 대한 생산은 낮은 편이며, 정제 및 제조가 복잡하고 비용이 많이 드는 문제점이 있어, 대부분이 해외에서 수입해서 사용하는 실정이다.

이에 본 발명자들은 국내에서 아가로스를 저비용으로 다량 생산할 수 있는 기술을 연구하던 중, 해조류로부터 고순도의 아가로스를 생산 및 제조하는 방법을 개발하였다.

본 발명에 따른 해조류로부터 고순도의 아가로스를 제조하는 방법은, (1) 해조류를 알칼리 침지시켜 추출물을 수득하는 단계;(2) 상기 추출물을 이용하여 겔을 형성하는 단계; (3) 겔을 동결건조시키고, 이후 마이크로웨이브를 처리하여 상기 해조류로부터 한천을 수득하는 단계; 및 (4) 상기 수득한 한천을 DMSO(dimethyl sulfoxide) 용액에 첨가하고 80~100 ℃의 온도에서 20~24시간 동안 반응시켜 아가로스를 추출하는 단계를 포함한다.

본 발명자들은 아가로스의 제조를 위한 소스(socrce)로서 해조류를 선택하였는데, 해조류는 미래식량자원으로 각광 받고 있는 바이오매스이며, 특히 우리나라는 3면이 바다로 둘러싸여 있어 편리하고 풍부하게 확보할 수 있는 장점이 있다.

본 발명에서 사용할 수 있는 상기 해조류는 홍조류일 수 있고, 홍조류로는 이에 제한되지는 않으나, 우뭇가사리, 꼬시래기, 진두발 또는 갈래곰보를 사용할 수 있다.

상기 해조류로부터 고순도의 아가로스를 제조하는 방법을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

먼저, 해조류를 알칼리 용액에 침지시켜 해조류 추출물을 수득한다.

해조류는 건조된 것을 사용하며, 황산기를 함유하고 있어 단순하게 물로 처리하게 되면 겔화가 일어나지 않는다. 따라서 해조류를 먼저 알칼리 용액에 침지시켜 한천의 겔 특성을 강화시킨다.

상기 알칼리 용액으로 사용할 수 있는 것으로는, 수산화나트륨 용액, 수산화칼슘 용액, 수산화칼륨 용액, 탄산나트륨 용액 또는 탄산수소나트륨 용액일 수 있고, 알칼리 용액의 농도는 1~5%(w/v)가 바람직하다.

또한, 알칼리 용액에 침치시켜 추출물을 수득하는 과정은, 알칼리 용액으로 침지된 상태에서 110~125℃의 온도에서 1시간~2시간 동안 추출한다. 이때 상기 추출 시간은 1시간 미만일 경우 충분한 추출이 일어나지 않는 문제점이 있고, 2시간을 초과하면 추출물 내에서의 예상치 못한 반응으로 인해 겔화가 발생하지 않는 문제점이 있다. 따라서 상기 범위의 온도와 시간에서 추출을 수행하는 것이 바람직하다.

추출과정이 완료되면, 상기 추출물을 이용하여 겔을 형성한다.

겔을 형성하는 과정은, 상기 추출단계에서 수득한 추출물을 여과하여 여과액을 수득하고, 여기에 산을 첨가하여 중화처리 한 다음, 중화된 여과액을 상온에서 응고시켜 겔을 형성한다.

이후, 겔을 동결건조시키고 마이크로웨이브를 처리하여 아가(즉, 한천)를 수득한다.

상기 동결건조는 30℃ ~ -20℃에서 10~12시간 동결할 수 있으며, 마이크로웨이브를 30 내지 60분 동안 가하여 해동시킨다. 이때 해동과정을 통해 겔에 함유된 수분이 제거되며, 마이크로웨이브 처리를 통해 제조 시간을 단축시킬 수 있다.

마이크로웨이브 처리로 탈수된 겔은 이후, DMSO(dimethyl sulfoxide) 용액에 첨가하고 80~100 ℃의 온도에서 20~24시간 동안 반응시켜 아가로스를 추출한다.

이때 상기 탈수된 겔은 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 대해 0.5~5중량%의 양으로 첨가하여 상기 겔로부터 아가로스를 추출한다.

그런 뒤, 상기 추출물을 12000rpm ~ 15000rpm으로 10~20분 동안 원심분리하고, 상층액을 취하고 여기에 아세톤을 첨가하여 침전시켰다. 침전물을 회전증발농축기로 교반한 후 동결건조기로 건조시키는 과정을 통해, 해조류로부터 고순도의 아가로스를 수득하였다.

본 발명에 따른 방법으로 수득한 아가로스는 90% 이상의 고순도를 갖는다는 것을 확인할 수 있었고, 생산 수율 역시 40% 이상의 높은 수율로 수득됨을 알 수 있었다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 아가로스를 이용하여 하이드로겔 폼을 제조하는 방법을 확립한 점에 특징이 있다.

일반적으로 하이드로겔은 최소 전체 중량의 20% 이상의 수분을 흡수할 수 있는 특성이 있고, 하이드로겔은 공중합체 또는 단일중합체로 형성되는데 외부 인력에 의한 유동성이 거의 없고, 공유결합, 반데르발스 결합 및 물리적인 응집 등의 요인에 의해 구조적으로 안정한 삼차원 구조를 형성한다.

또한, 액상에서 팽윤된 후, 열역학적으로 안정된 상태로 존재하며 액체와 고체의 중간 형태의 물리화학적 특성을 가지며, 기능성 화장품(특히 마스크), 하이드로겔 렌즈, 운드 드레싱 등 다양한 용도에 활용되고 있다.

따라서 본 발명자들은 본 발명의 방법으로 제조된 아가로스로부터 산업적 용도가 다양한 하이드로겔 폼의 제조방법을 확립하였는데, 본 발명에서 제공하는 해조류 유래 아가로스를 이용한 하이드로겔 폼의 제조방법은, (1) 해조류를 알칼리 침지시켜 추출물을 수득하는 단계; (2) 상기 추출물을 이용하여 겔을 형성하는 단계; (3) 겔을 동결건조시키고, 이후 마이크로웨이브를 처리하여 상기 해조류로부터 한천을 수득하는 단계; (4) 상기 수득한 한천을 DMSO(dimethyl sulfoxide) 용액에 첨가하고 80~100 ℃의 온도에서 20~24시간 동안 반응시켜 아가로스를 추출하는 단계; 및 (5) 상기 추출한 아가로스를 110~125 ℃의 온도에서 10~30분 동안 오토클레이브하여 아가로스 졸을 제조하는 단계; 및 (6) 아가로스 졸을 몰드에 붓고 동결건조하는 단계를 포함한다.

이때 상기 제조 단계에서, 목적하는 용도에 맞게 기능 및 효능을 증진시킬 수 있는 유효성분을 추가로 포함할 수 있으며, 예컨대, 알지네이트 또는 한천을 추가로 사용할 수 있고, 아가로스 졸을 몰드에 첨가할 때, 추가 성분을 함께 몰드에 붓는다.

이러한 방법으로 제조된 본 발명의 하이드로겔 폼에 대해 본 발명자들을 이를 화장품, 의약품 등의 다양한 산업 용도로 활용할 수 있는지를 확인하기 위해 상기 하이드로겔 폼의 특성을 분석하였다.

그 결과, 본 발명의 하이드로겔 폼은 수분흡수성이 우수한 것으로 나타났고, 형태의 안정성이 높은 것으로 나타났으며, 특히 인체의 온도범위에서도 팽윤비가 감소하지 않아 수분지속력도 매우 우수한 것으로 나타났다(실시예 3 참조).

또한, 본 발명의 다른 일실시예에서는 하이드로겔 폼의 제조에 사용되는 유효성분인 본 발명의 방법으로 제조된 아가로스에 대한 특성도 분석하였는데, 본 발명의 방법으로 제조된 아가로스의 경우 95%의 아가로스 점유율을 나타내어 매우 고순도임을 확인할 수 있었고, 높은 수분함량과 열적 안정성이 우수한 것을 알 수 있었다.

뿐만 아니라, DMSO 처리에 의한 본 발명의 아가로스 제조방법은 아가로스의 작용기의 변화를 유발시키지 않아 고유의 성질을 변화시키지 않으며, 세포에 독성을 유발시키지 않는다는 것을 알 수 있었다.

따라서 본 발명에 따른 아가로스 및 하이드로겔 폼은 인체 안정하며 우수한 수분흡수력을 가지고 있어, 화장품, 의약품 등 다양한 산업분야에 적용할 수 있음을 알 수 있었다.

그러므로 본 발명은 상기 해조류 유래 아가로스를 이용한 하이드로겔 폼을 유효성분으로 포함하는, 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

특히 하이드로겔은 인체의 세포기질과 유사한 구조를 나타내어 불활성이면서 탄성이 우수하고 산소 및 영양분의 투과율이 뛰어나 우수한 생체 적합성을 나타내므로, 의약 및 미용 산업에서 더욱 관심을 모으고 있으며, 미용 분야의 경우 하이드로겔의 탄성, 피부 밀착성 및 부드러운 촉감을 이용하여 사용 성분의 종류 및 함량 조절을 통한 피부 보습 및 영양 공급 또는 각질 제거 효과를 강화시킬 수 있는 기능성 화장료 조성물에 활용될 수 있다.

상기 본 발명에 따른 화장료 조성물에는 유효성분인 하이드로겔 폼을 조성물 총 중량 대비 0.1~20중량%로 첨가될 수 있다. 이때 0.1 중량% 미만인 경우에는 피부 친화성이 떨어져 피부 개선 효과가 미약할 수 있고, 20 중량% 초과인 경우에는 피부에 자극이 되거나 제형 안정성이 떨어져 변취 및 변색의 문제를 일으킬 수 있다.

또한, 상기 조성물에는 피부와의 친화성을 향상시켜주면서 피부에 효과적으로 작용할 수 있는 기능성 성분의 피부 흡수율을 높일 수 미백성분, 주름기능성 성분, 항산화 성분, 보습성분, 항균성분 등을 추가로 포함할 수 있다.

예를 들면 레티놀, 레티닐팔미테이트, 레티닐 아세테이트, 레티노인산, 코엔자임 큐텐, 엘라스틴, 콜라겐, 히알루론산, 세라마이드, 콜라겐, 카페인, 키토산, 아스코르빈산, 아스코르빌글루코사이드, 알파비사볼롤, 토코페롤, 토코페롤아세테이트, 알부틴, 니아신아마이드, 아데노신, 레티놀아세테이트, 비타민 A, D 및 E, 그리고 그 외 천연추출물, 천연발효물질 등을 단독으로 또는 둘 이상의 혼합물로 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 천연추출물은, 예를 들면 알로에, 녹차, 인삼, 인삼, 목초액, 솔잎, 은행잎, 프로폴리스, 뽕잎, 누에, 참마, 달팽이 점액, 카카두플럼, 카무카무, 야사이야자, 스쿠알란, 캐비어, 브로콜리, 블루베리, 위치하젤, 아세로라, 클로렐라, 망고스틴, 구아바, 산수유, 당근, 카페인, 하마멜리스, 스피룰리나, 연어알, 감태, 자이언트켈프, 곤포, 마치현, 뽕 나무 뿌리, 라즈베리, 산딸기, 에델바이스, 카모마일, 라벤더, 페퍼민트, 유칼립투스, 레몬밤, 오레가노, 티트리, 황금, 어성초, 산자나무, 유자를 포함하는 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 해조류 유래 아가로스를 이용한 하이드로겔 폼을 유효성분으로 포함하는, 상처 치유용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

특히 본 발명에 다른 상기 조성물은 하이드로겔 폼 이외에도 상처치유를 돕는 bFGF, EGF, 및 GMCSF로 이루어진 군에서 선택된 성장인자 또는 물질-P (Substance-P)를 더 포함할 수 있고, 상기 성장인자 또는 물질-P는 상피세포의 이동과 섬유아세포의 증식을 촉진하는 역할을 한다.

또한, 본 발명의 조성물에는 상처치유를 돕는 콜라겐(Collagen), 히알루론산(Hyaluronic acid), 글루코스아미노글리칸(Glycosaminoglycanes), 파이브로넥틴(Fibronectin) 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 세포 간물질(ECM)을 더 포함할 수 있고, 상기 세포 간물질은 본 발명의 조성물에서 세포의 부착 능을 증가시켜 상처치유를 촉진시키는 역할을 한다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 하이드로겔은 상처치유를 돕는 카르복시메틸 셀룰로우즈(Carboxymethyl cellulose), 알긴산(Alginate), 키토산(Chitosan), 폴리 카프로락톤(Poly(e-caprolactone)), 폴리 락틱엑시드(Poly(lactic acid)), 폴리 글리콜릭 엑시드(Poly(glycolic acid)), 히드록시아파타이트(Hydroxyapatite), 트리칼슘 포스페이트(Tricalcium phosphate) 또는 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 생체재료(Biomaterials)를 더 포함할 수 있고, 상기 생체재료는 본 발명의 조성물에서 하이드로 겔의 물성 향상 및 생체적합성을 증진시키는 역할을 한다.

또한, 본 발명의 조성물은 하이드로겔 폼의 형태로 제제화되어 상처 부위에 직접 도포하거나 주사기 등에 의해 투여될 수 있다. 상기 조성물은 세포 치료에 일반적으로 사용되는 약제학적 담체와 함께 투여될 수 있으며, 이런 담체로 생리학적 식염수를 예로 들 수 있다.

본 발명의 조성물은 상처 치유 등을 위해 치료학적으로 유효한 양으로 투여한다. 용어 "치료학적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 하기에 충분한 양을 의미하며, 유효량은 질병의 중증도, 연령, 성별, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 예컨대, 성인기준으로 1회 1mg 내지 1000mg의 본 발명의 조성물을 투여할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

해조류 유래 아가로스를 이용한 하이드로겔 폼의 제조방법

① 우뭇가사리로부터 한천의 제조

우뭇가사리 120g에 4L의 증류수를 첨가하여 12시간 동안 침지시키고 1N H₂SO₄를 이용하여 pH 2~4로 맞춘 후 121℃에서 90분 동안 추출하였다. 추출된 용액을 여과하여 여액을 실온에서 우무(Agar-Agar)로 제조하고 12시간 동안 20℃에서 동결시켰다. 이때 상기 우무의 제조는 상기 수득한 여액을 5N의 황산용액을 가하여 중화처리한 후 상온(25℃)에서 방치하여 응고시킴을 통해 겔을 형성하도록 하였고, 동결된 겔을 마이크로웨이브를 이용하여 30분간 해동 후, 수분을 제거하고 드라이오븐에서 60℃에서 24시간 건조시킨 후, 분쇄하여 분말 형태의 우뭇가사리 유래 한천을 수득하였다.

② 꼬시래기로부터 한천의 제조

꼬시래기 한천은 1:30 중량비율, 즉 60g의 꼬시래기에 1.8L의 3% NaOH를 첨가하여 12시간 동안 침지하고 121℃에서 90분 동안 추출을 진행하였다. 추출된 용액을 여과하여 여액을 10N H₂SO₄를 이용하여 중화시키고 실온에서 우무(Agar-Agar, 겔)로 제조한 다음, 12시간 동안 20℃에서 동결시켰다.

동결된 겔을 마이크로웨이브를 이용하여 30분간 해동 후, 수분을 제거하고 드라이오븐에서 60℃에서 24시간 건조 및 분쇄하여 분말 형태의 꼬시래기 유래 한천을 수득하였다.

상기 방법으로 수득한 우뭇가사리 유래 한천 및 꼬시래기 유래 한천의 사진을 도 1에 나타내었다.

③ 아가로스의 제조

상기에서 수득한 우뭇가사리 유래 한천 및 꼬시래기 유래 한천을 DMSO를 이용하여 아가로스를 제조하였는데, 즉, 상기 수득한 각각의 한천을 분쇄기를 통하여 입자크기를 100 mesh가 되도록 다시 분쇄한 후, 0.01 M의 Na₂EDTA용액 첨가하여 24시간 교반시키고 증류수로 3회 세척하고 아세톤을 첨가하여 탈수한 후, 40℃에서 건조시켜 정제를 하였다. 이후, DMSO에 분쇄된 한천 분말을 0.5~5%의 농도별로 첨가하여 혼합한 후, 80~100℃ 사이의 온도를 유지하면서 24시간 동안 반응시켰다. 이후 원심분리기를 이용하여 15000 rpm에서 20분간 원심분리하였고, 상층액을 여과한 후, 아세톤을 이용하여 침전시켰다. 이후 침전물을 동결건조기를 이용하여 24시간 건조시킨다. 이후, 0.01 M의 Na₂EDTA용액 첨가하여 24시간 교반시키고 증류수로 3회 세척하고 아세톤을 첨가하여 탈수한 후, 40℃에서 건조시켜 우뭇가사리 한천 및 꼬시래기 한천 유래의 아가로스를 각각 수득하였다.

④ 하이드로겔 폼의 제조

상기 ③ 과정에서 수득한 우뭇가사리 및 꼬시래기 유래 각각의 아가로스를 이용하여 하이드로겔 폼을 제조하였는데, 꼬시래기 한천에서 제조한 아가로스를 이용하여 아가로스를 각 농도별(1%, 2%, 3%, 4% 및 5%)로 첨가하고 121℃에서 20분 동안 오토클레이빙(autoclaving) 하여 아가로스 졸을 제조하였고, 이후 아가로즈 졸을 몰드(가로*세로*높이<3.5cm*3.5cm*0.5cm>)에 겔로 제조하여 상온에서 굳힘 다음 20 ℃에서 24시간 동안 동결시켰다. 동결된 아가로스르 동결건조기를 이용하여 100 ℃에서 36시간 동안 건조하여 우뭇가사리 아가로스를 이용한 하이드로겔 폼 및 꼬시래기 아가로스를 이용한 하이드로겔 폼을 각각 제조하였다. 상기 방법으로 제조된 본 발명의 하이드로겔 폼의 사진은 도 8에 나타내었고, 도 8에서 wet은 아가로스폼을 물에 침지시켜서 팽윤된 상태의 사진을 나타낸 것이다.

<실시예 2>

본 발명에서 제조한 해조류 유래 한천 및 아가로스의 특성분석

① 일반성분 분석

본 발명자들은 상기 실시예에서 우뭇가사리 및 꼬시래기로부터 제조한 한천 및 아가로스 각각에 대한 일반성분 분석을 수행하였다. 또한 대조군으로 상업한천인 브레드가든 제품 및 Agarose EEO(AppliChem, CAS-No: 9012-36-6) 제품을 사용하였다. 성분 분석은 수분, 단백질, 지방, 탄수화물 및 회분(ash)의 분석을 수행하였고, 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다.

분석결과, DMSO를 이용하여 추출한 아가로스의 경우, 수분 함량이 높은 것으로 나타났는데, 이는 열풍건조 방법이 아닌 동결건조를 수행하여 아가로스를 제조한 것이기 때문인 것으로 판단되며, 이외 다른 일반성분들은 Agaros EEO와 유사한 경향을 보이는 것으로 나타났다.

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 아가로스의 경우, 종래 사용되는 아가로스 제품과 성분의 종류 및 함량에서 큰 차이를 보이지 않아 특별히 문제될 만한 사항이 없는 것을 알 수 있었고 오히려 수분 함량이 높아 하이드로겔 적용에 더욱 우수할 수 있음을 알 수 있었다.

② 아가로스와 아가로펙틴의 구성비 분석

본 발명의 방법으로 추출한 한천(agar)과 아가로스(agarose)에 대해 아가로스와 아가로펙틴 구성비에 따른 정제도를 Tagawa et al. (1969)의 방법에 의하여 분석하였다. 구체적으로 1g의 시료를 50배의 DMSO(dimethyl sulfoxide)와 함께 70℃에서 1시간 용해시킨 다음, 원심분리하여 용해부와 불용부로 분리하였다. 용해부를 아세톤에 서서히 가하여 생성되는 침전물을 경사법(decantation)에 의해 분리하였고 불용부의 용액을 제거하고 동결건조를 통해 아가로스와 아가로펙틴을 얻어 중량비로 분석을 실시하였다.

분석 결과, 상기 표 2에 나타낸 바와 같이 본 발명의 DMSO 방법으로 우뭇가사리 한천과 꼬시래기 한천으로부터 수득한 아가로스는 95%의 아가로스 점유율을 나타내어 매우 고순도의 아가로스 정제가 가능하다는 것을 알 수 있었다.

③ 열적특성 분석

본 발명에서 제조한 우뭇가사리 및 꼬시래기 유래의 한천과 아가로스에 대한 열적특성을 분석하였다. 열적특성 분석은 DSC(differential scanning calorimetry)방법을 이용하였고, 이를 위해 한천(agar) 및 아가로스를 1.5%의 농도로 겔로 만든 후, 20~140℃의 온도범위에서 승온 속도 10℃/min으로 분석하였다.

분석결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 우뭇가사리 및 꼬시래기 유래의 한천이 다른 군에 비해 열안정성이 높은 것으로 나타났다. 따라서 본 발명의 아가 및 아가로스는 종래 제품에 비해 열에 대한 안정성이 더욱 우수할 수 있음을 알 수 있었다.

④ FT-IR 분석

나아가 본 발명자들은 본 발명의 방법, 즉 DMSO를 이용하여 아가로스를 제조할 경우, 작용기에 따른 변화 여부를 확인하기 위해 FT-IR 분석을 수행하였다.

분석은 푸리에변환 적외분광 분석(Fourier transform infrared spectroscopy)으로 Kbr-pellet 기법을 통해 스펙트라를 측정하였고, 해조류의 아가로콜로이드(agarocolloid) Mollet et al. (1998)의 하기 표와 분석기준을 토대로 분석을 실시하였다. 측정범위는 650-4000, 650-1500 cm^-1에 대한 측정을 하였다.

측정에 사용된 한천샘플은 상업한천(브레드가든), 꼬시래기에서 추출한 한천, 우뭇가사리에서 추출한 한천을 사용하였고, 아가로스 샘플로는 agarose EEO(AppliChem, CAS-No: 9012-36-6), 상업한천(브레드가든)에서 DMSO를 이용하여 추출한 아가로스, 상업한천(브레드가든)에서 키토산을 이용하여 추출한 아가로스, 상업한천(브레드가든)에서 지올라이트(zeolite)를 이용하여 추출한 아가로스, 꼬시래기 한천에서 DMSO를 이용하여 추출한 아가로스, 우뭇가사리 한천에서 DSMO를 이용하여 추출한 아가로스를 사용하였다.

분석 결과, 꼬시래기와 우뭇가사리에서 추출한 한천의 경우, 상업한천과 주요 밴드인 740, 770, 890, 930 및 1070 부근에 대한 피크가 유사한 것으로 나타났고, 또한 상업한천(브레드가든)에서 DMSO를 이용하여 추출한 아가로스, 상업한천(브레드가든)에서 키토산을 이용하여 추출한 아가로스, 상업한천(브레드가든)에서 지올라이트(zeolite)를 이용하여 추출한 아가로스, 꼬시래기 한천에서 DMSO를 이용하여 추출한 아가로스, 우뭇가사리 한천에서 DSMO를 이용하여 추출한 아가로스의 피크는 1070에서 갈락탄 골격을 확인할 수 있었고, 930cm^-1에서 3, 6-anhydro-L-glactose, 890cm^-1에서 아가 특이적 밴드를 확인할 수 있었다. 아가로스의 경우에도 agarose EEO의 시약과 매우 유사한 피크들을 나타내고 있음을 확인함으로써, 본 발명에 따른 DMSO를 이용한 아가로스 제조방법은 작용기의 변화를 초래하지 않아 아가 및 아가로스가 갖는 고유의 성질을 변화시키지 않음을 알 수 있었다(도 3 및 도 4 참조).

⑤ 세포독성분석

본 발명에서 수득한 한천 및 아가로스가 세포에 독성을 유발시키는지의 여부를 확인하기 위해 세포독성 실험을 수행하였다. 실험은 B16F10 멜라노마 세포를 이용하여 24 시간동안 시료를 처리 후 세포 생존율을 측정하였다.

분석 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 수득한 한천 및 아가로스 모두 세포 독성을 유발시키지 않는 것으로 나타났고, morphology상에서 세포의 모양도 변화를 유발시키지 않음을 알 수 있었다. 따라서 본 발명에서 수득한 한천 및 아가로스는 안정성이 있어 신체 및 체내 적용에 유해하지 않음을 알 수 있었다.

⑥ NMR 분석

또한 본 발명자들은 우뭇가사리와 꼬시래기로부터 분리한 한천 및 아가로스에 대해 각각 NMR 분석을 수행하였다. ¹³C 및 ¹H에 대한 NMR 분석은 JEOL JNM AL300 spectrometer를 사용하여 측정하였고, 각 한천 및 아가로스의 시료를 DMSO에 2-4%로 제조 후 25℃에서 측정하였다.

분석 결과, 꼬시래기에서 추출한 한천과 우뭇가사리에서 추출한 한천의 13C, 1H NMR 피크는 종래 보고 자료(Praiboon et al. (2006)의 논문, Kang et al. (2011))와 거의 비슷한 양상을 보이고 있었다. 2가지 아가로스간 탄소 위치별 ppm은 거의 일치하였고, 두 시료물질은 동일한 수준의 아가로스를 포함하고 있음을 알 수 있었다. 아가로스는 NMR상에서 12개의 agrobiose 탄소 시그널이 나타나야 하지만, 꼬시래기 한천에서 제조한 아가로스의 경우 10개의 탄소 시그널이 나타났다. 우뭇가사리 한천에서 제조한 아가로스는 12개의 탄소 시그널이 나타난 것을 확인할 수 있었다(도 9 내지 도 12 참조).

⑦ 아가로스의 물리적 특성분석

상기 본 발명에서 제조된 각각의 아가로스에 대한 물리적 특성을 분석하였다. 물리적 특성 분석의 항목으로는 겔강도, 황산기 농도, 겔화 온도 및 융해온도에 대한 분석을 수행하였고 그 결과를 하기 표 4에 기재하였다.

상기 표에서, G·C: G. verrucosa+Chitosan, G·D: G. verrucosa+DMSO, A·C: G. amansii+Chitosan, A·D: G. amansii+DMSO 처리로 제조된 아가로스를 나타낸 것이다(G. amansii은 우뭇가사리를 나타낸 것이고, G. verrucosa은 꼬시래기를 나타낸 것이다).

분석결과, 아가로스는 일반적인 겔강도가 700~1200 g/cm2, 겔화 온도(gelling point) 36±1.5%, 녹는점( melting temperation) 87±2.0 으로 아가로스 타입별로 분류된다. 이러한 종래 아가로스에 대한 물리적 특성과 비교해 볼 때, 본 발명의 방법으로 제조된 아가로스의 겔강도는 792.36~855.39로 우뭇가사리로부터 제조된 아가로스의 겔강도가 꼬시래기로부터 제조된 아가로스 보다 높은 것으로 나타났고, DMSO의 처리로 제조된 아가로스의 수율이 가장 높은 것으로 나타났으며, 수율은 40%로 높은 수율을 나타내었다.

<실시예 3>

본 발명에서 제조한 하이드로겔 폼의 수분흡수성 분석

실시예 1에서 제조한 본 발명의 하이드로겔 폼의 수분흡수성 정도를 분석하였다. 1.0~5.0%의 농도별 아가로스를 이용하여 제조한 하이드로겔 폼에 대해 30~50℃에서의 팽윤비(swelling ratio) 및 pH에 따른 팽윤비를 분석하였다.

분석 결과, 아가로스 농도별 팽윤비는 농도가 적을수록 팽윤비가 매우 크고 농도가 감소하면서 팽윤비 또한 감소하는 것으로 나타났으며, 온도에 따른 팽윤비의 변화는 큰 변화가 없는 것으로 나타났다(도 6a 참조).

또한, pH에 따른 팽윤비 분석은 pH가 중성일 때 가장 높은 팽윤비를 보였고, 산성조건이 염기조건보다 팽윤비가 더 낮은 것으로 나타났다(도 6b 참조).

또한, 1.0~5.0% 농도의 아가로스를 이용하여 제조한 하이드로겔 폼은 대부분이 증류수에 넣은 후 얼마 지나지 않아 거의 흡수가 일어났다. 1.0~2.0% 농도의 하이드로겔 폼은 물에 장시간 방치할 시에 제형이 무너지기 쉬었고, 3%의 농도부터 거의 일정한 팽윤비를 갖게 되는 것으로 나타났는데, 이는 한천의 겔화 메카니즘에서 삼차원 망상구조의 이중 나선이 중합체의 사슬의 연결지점을 형성하면서 겔화가 진행되는데 이러한 겔화가 진행되면서 기공(pore) 형성이 농도가 커질수록 기공의 크기가 작아지기 때문인 것으로 보인다. 0.5%의 하이드로겔 폼의 경우 팽윤을 시키면 폼의 제형이 무너지는 것을 확인하였는데 기공의 크기가 커서 겔을 지지하는 삼차원 망상구조가 무너지는 것으로 나타났다(도 6c 및 도 7 참조).

따라서 이러한 결과를 통해, 안정한 제형을 위해서는 아가로스를 3% 이상의 농도로 사용해야 함을 알 수 있었고, 그래야 안정된 팽윤비와 제형을 유지할 수 있음을 알 수 있었다. 온도에 따른 하이드로겔 폼의 팽윤비는 큰 차이는 없었지만 1, 2%의 농도는 40℃에서 4% 및 5%의 농도에서는 30℃에서 가장 높은 팽윤비를 보였다. 따라서 인체의 온도에서도 팽윤비가 감소하지 않음을 알 수 있었고 다양한 적용이 가능함을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

(1) 꼬시래기(Gracilaria verrucosa)에 알칼리 용액을 첨가하고 12시간 동안 침지하고 121℃의 온도에서 90분 동안 추출하여 꼬시래기 추출물을 수득하는 단계;
(2) 상기 추출물을 황산으로 중화시키고 상온에서 응고시켜 겔을 형성하는 단계;
(3) 겔을 동결건조시키고, 이후 30분 동안 마이크로웨이브를 처리한 다음, 60℃의 온도에서 24시간 건조 및 분쇄하여 분말형태의 꼬시래기 유래 한천을 수득하는 단계; 및
(4) 상기 수득한 한천을 DMSO(dimethyl sulfoxide) 용액에 첨가하고 80~100 ℃의 온도에서 20~24시간 동안 반응시켜 아가로스를 추출하는 단계를 포함하며, 이때 상기 한천은 DMSO 용액 부피를 기준으로 0.5~5%(w/v)로 첨가하는 것을 특징으로 하는,
꼬시래기(Gracilaria verrucosa)로부터 고순도의 아가로스를 제조하는 방법.
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제1항에 있어서,
상기 (1) 단계의 알칼리 용액은 수산화나트륨 용액, 수산화칼슘 용액, 수산화칼륨 용액, 탄산나트륨 용액 또는 탄산수소나트륨 용액인 것을 특징으로 하는, 꼬시래기(Gracilaria verrucosa)로부터 고순도의 아가로스를 제조하는 방법.
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(1) 꼬시래기(Gracilaria verrucosa)에 알칼리 용액을 첨가하고 12시간 동안 침지하고 121℃의 온도에서 90분 동안 추출하여 꼬시래기 추출물을 수득하는 단계;
(2) 상기 추출물을 황산으로 중화시키고 상온에서 응고시켜 겔을 형성하는 단계;
(3) 겔을 동결건조시키고, 이후 30분 동안 마이크로웨이브를 처리한 다음, 60℃의 온도에서 24시간 건조 및 분쇄하여 분말형태의 꼬시래기 유래 한천을 수득하는 단계;
(4) 상기 수득한 한천을 DMSO(dimethyl sulfoxide) 용액에 첨가하고 80~100℃의 온도에서 20~24시간 동안 반응시켜 아가로스를 추출하는 단계;
(5) 상기 추출한 아가로스를 121℃의 온도에서 20분 동안 오토클레이브하여 아가로스 졸을 제조하는 단계; 및
(6) 아가로스 졸을 몰드에 붓고 동결시킨 후, 100℃의 온도에서 36시간 건조하는 단계를 포함하며,
상기 (5) 단계에서 아가로스 졸 제조 시, 아가로스는 아가로스 졸 용액의 총 중량 기준 3~5 중량%로 첨가하는 것을 특징으로 하는,
꼬시래기(Gracilaria verrucosa) 유래 아가로스를 함유한 수분이 없는 형태의 하이드로겔 폼의 제조방법.
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