KR100484926B1 - 짧은 단편 ｄｎａ 편자 분리용 아가로스 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 한천으로부터 짧은 단편 DNA 및 RNA 편자(fragments)를 명확하게 분리할 수 있는 분자량 5,000~20,000 정도의 아가로스를 제조할 수 있는 방법에 관한 것으로 짧은 단편 DNA 편자를 분리할 수 있는 뛰어난 효과를 제공한다.

Description

짧은 단편 ＤＮＡ 편자 분리용 아가로스 제조방법 {Method for production of agarose for separating small fragments of DNA}

본 발명은 한천으로부터 아가로스를 제조하는 방법에 관한 것으로 더욱 상세하게는 한천으로부터 짧은 단편 DNA 및 RNA 편자(fragments)를 명확하게 분리할 수 있는 아가로스의 제조방법에 관한 것이다.

일반적으로 한천은 우뭇가사리와 같은 홍조류에서 추출한 고점도의 복합 다당류로서 식품원료, 미생물배지, 화장품, 분자생물학적 연구 등의 다양한 용도로 활용되고 있으며, 주요 구성성분은 아가로스(agarose)와 아가로펙틴(agaropectin)이며, 일반적으로 두 가지 성분의 비율은 7:3 정도이다.

아가로스는 주로 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose)와 D-갈락토오스(D-galactose)가 연속적으로 결합하여 직선형의 고분자를 이루고 있으며, 아가로펙틴은 아가로스형 쇄상구조에 황산, 피루브산, 글루크론산염 등이 결합되어 있는 불균일한 다당체로서 황산에스테르 함량이 가장 많고, 겔화능이 없는 갈락탄(galactan)도 포함된다.

일반적인 아가로스는 여러 가지 제법을 통해서 순수 아가로스만 다량으로 분리하는데 초점을 맞춰 개발된 제품으로서 극히 짧은 단편의 핵산을 분리 및 확인하는데는 많은 어려움이 있다. 또한 핵산 단편을 분리하더라도 각 단편간의 미세한 염기쌍(base pair) 차이는 일반적인 아가로스 겔 상에서는 명확하게 구별하기 어려운게 현실이다.

최근에 PCR 등의 기법이 생명공학자 뿐만 아니라 의학계 등에서도 널리 사용되면서 미세 핵산 단편을 이용한 연구가 매우 활발하다. 이러한 작은 단편을 분리하기 위해 연구자들은 그동안 일반적으로 사용되는 아가로스의 농도를 높이거나, 전기영동 시간을 짧게 하거나, 낮은 전압하에서 전기영동을 실시하거나, 전기영동용 버퍼(buffer)를 달리 사용하는 등의 방법을 많이 이용해 왔다. 그러나 이러한 방법을 사용하더라도 50 염기쌍 이하의 작은 단편을 분리하는데는 많은 어려움이 있어 왔다.

한편, 이러한 용도로 개발된 대표적인 제품으로 미국 FMC Bioproducts사의 Nusieve 3:1 아가로스가 있으나, 기존에 존재하는 일반 아가로스와 극소 단편 아가로스의 혼합형태에 지나지 않기 때문에 진정 저분자 분리용에 특수하게 제작되었다고 보기는 어렵다.

이에 본 발명은 상기의 문제점으로부터 안출된 것으로, 국내에서 손쉽게 구할 수 있는 한천으로부터 일반 아가로스보다 부가가치가 훨씬 뛰어나고 활용도가 높은 짧은 단편 DNA 편자 분리용 아가로스를 제조하는 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본발명은 한천 용액에 키토산 용액을 첨가하여 아가로펙틴을 침전시켜 제거하고, 상층액을 분리한 후, 분말화하여 아가로스를 제조하는 방법에 있어서,

상기 아가로펙틴이 침전되어 제거되고 남은 상층액에 산용액을 첨가하여 pH를 2~4로 조절하고 1~6시간 동안 교반한 후, 알칼리를 첨가하여 중화시키는 단계; 및,

중화된 아가로스 수용액을 상온으로 냉각한 후, 여기에 40~70%(v/v) 농도의 에탄올을 아가로스 수용액 총량을 기준으로 하여 1.0배 첨가하여 침전되는 침전물 분리한 후, 상층액을 회수하여 분말화하는 것을 특징으로 하는 아가로스의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명에 의한 짧은 단편 DNA 편자 분리용 아가로스 제조공정을 상세히 설명한다. 참고적으로 도 1은 개략적인 제조공정을 보여주는 공정도이고 여기서 s는 단계(step)을 의미한다.

원료인 한천은 우뭇가사리, 꼬시래기, 돌가사리, 애기곱슬이, 부챗살과 같은 홍조류로부터 제조된 식품 첨가용 한천, 공업용 배지 한천, 미생물 배양용 배지 한천, 또는 한천의 겔강도가 높은 공업용 고강도 한천을 사용할 수 있다.

원료 한천을 통상적인 방법을 사용하여 아가로스펙틴을 제거하여도 무방하나 바람직하게 하기의 방법으로 제거시키는 것이 좋다.

원료 한천을 수용화 및 가수분해 공정이 용이하도록 분쇄기를 이용하여 입자를 50~100 메쉬로 분쇄하여 분말 한천을 얻고(S1). 분말화된 한천은 40~70℃의 온수로 세척하여 이물질과 염류를 제거한다(S2).

한천의 농도가 0.5~10%(W/V)가 되도록 물에 첨가하고 온도를 90~120℃로 상승시켜 0.5~2시간 정도 온도를 유지하여 한천을 완전히 용해시킨 후 온도를 55~90℃로 유지한다(S3).

이 한천 용액에 키토산 또는 수용성 키토산 용액을 전체 수용액의 0.1~4%(W/V)의 비율이 되게 첨가하고, 55~90℃에서 서서히 교반하면서 5~24 시간 동안 반응시키면서 한천 중의 아가로펙틴 성분을 침전시키고(S4), 반응이 끝난 후 침전물을 필터프레스(Filter Press) 등을 이용한 여과법으로 침전물을 제거하고 상층액을 취한다(S5). 이때, 상층액의 온도는 55~75℃로 유지하는 것이 좋다.

상기의 방법에 의하여 제조되거나 통상적인 방법으로 아가로펙틴이 제거되고 남은 상층액에 산용액을 첨가하여 수용액의 수소이온 농도를 2~4 사이로 조절하여 1~6 시간 동안 서서히 교반(S6)한 후 알칼리를 첨가하여 중화시킨다(S7).

이때 상기 pH 및 시간의 범위내에서만 본원발명의 효과로서 분자량 5,000~20,000 정도의 아가로스를 제조하기에 충분할 정도로 가수분해가 이루어지며, 상기 범위를 벗어나게 되면 가수분해가 과도하게 되거나 불충분하게 되어 본원발명의 효과로서 분자량 5,000~20,000 정도의 아가로스를 제조할 수 없으므로 바람직스럽지 못하다.

한편, 상기 산용액은 염산을 사용하는 것이 바람직하고, 알칼리는 수산화나트륨을 사용하는 것이 바람직하다.

중화된 아가로스 수용액을 상온으로 냉각시킨 후, 40~70%의 에탄올을 아가로스 용액 총액량의 1.0 배가 되도록 첨가하여 비수용성 성분을 침전시킨 다음(S8) 여과 또는 원심분리를 이용하여 침전물을 제거하고 상층액을 취한다(S9).

이때, 에탄올 함량이 과도하게 많을 경우에는 미세입자까지 포획되어 초저분자 아가로스가 제조되기 때문에 바람직스럽지 못하고, 에탄올 함량이 부족한 경우에는 침전효과가 떨어지게 되는 문제점이 있다.

상기 침전물을 제거한 후 회수한 상층액을 농축(S10)하고 분말화시켜 짧은 단편 DNA 편자 분리용 아가로스를 제조한다.

한편, 바람직하게 상기 분말화는 스프레이 드라이기(Spray Dryer)를 통해 분말화(S11) 시키는 것이 좋다.

이하 본 발명의 구성을 하기 실험예 및 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하지만 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실험예 1: 짧은 단편 DNA 편자 분리에 있어, 산도의 영향 조사

2%(W/V) 한천 수용액 1L로부터 아가로펙틴 성분을 제거한 한천 수용액에 염산을 첨가하여 수용액 중의 한천 성분을 가수분해시켜 분자량 5,000~20,000 달톤(Da) 사이의 짧은 가지의 아가로스를 제조하고자 하였다. 분자량에 따른 아가로스 절편의 분리는 컷 오프(Cut off) 5,000과 20,000의 한외여과 분리막을 교차 사용해 실시하였으며 건조 중량 측정을 통해 짧은 단편용 아가로스의 회수량을 측정하였다. 우선 상층액의 온도를 60℃로, 반응 시간을 1 시간으로 조절한 다음 염산을 이용한 수소이온 농도를 차이를 이용하여 최적의 수소이온 농도를 찾고자 하였다.

표 1은 분자량 5,000~20,000 사이의 아가로스를 다량으로 획득하기 위한 수소이온 농도별 시험결과이다.

수소이온 농도 변화에 따른 저분자 아가로스 회수 정도 비교

수소이온농도(pH)	1.5	2.0	2.5	3.0	3.5	4.0	4.5	5.0
저단편 아가로스 회수량(g/L)	3.8	6.7	8.5	8.3	8.2	6.8	4.5	4.3

상기에서 보는 바와 같이 수소이온의 농도가 2 내지 4일때 회수량이 6.0(g/L) 이상을 나타내어 바람직하였다.

실험예 2: 짧은 단편 DNA 편자 분리에 있어, 에탄올 첨가량의 영향 조사

염산 등을 이용하여 가수분해된 아가로스 수용액으로부터 본 발명에서 목적으로 하는 저분자형 아가로스(분자량 5,000~20,000Da)와 고분자형 아가로스(20,000Da 이상)를 적절히 분리하고 저분자형 아가로스의 비율을 높이기 위해 에탄올 침전법을 통한 분리를 실시하였다. 우선 수소이온 농도 2.5 하에서 가수분해된 아가로스 수용액 1L를 가성소다를 이용하여 수소이온 농도를 7.0으로 조절한 다음 수용액과 동일한 양의 에탄올을 농도를 달리하여 첨가하였으며, 반응 후 침전물 등은 여과를 통해 제거하고 상층액을 실험예 1의 경우에서처럼 한외여과를 통해 저분자 아가로스 수용액을 따로 분리한 후 건조중량 측정을 통해 최적의 에탄올 사용량 및 농도를 찾고자 하였다. 본 실험의 목적은 초저분자 아가로스(분자량 5,000Da 이하)를 적절히 제거함으로써 전체 아가로스 내 저분자형 아가로스 비율을 최대화하는 것이 목적이었다.

표 2는 이러한 목적으로 실시된 최적의 에탄올 농도를 찾기 위한 실험 결과이다.

에탄올 사용비율에 따른 저단편 아가로스 회수량 및 비율

에탄올농도(%,v.v)	20	30	40	50	60	70	80	90
저단편 아가로스 회수량(g/L)	2.8	4.1	4.7	6.3	7.5	8.2	8.4	8.4
전체 아가로스 회수량(g/L)	7.1	8.8	9.4	11.2	12.6	13.3	13.9	14.2
저단편 아가로스 비율(%)	39	47	50	56	60	62	60	59

상기에서 보는 바와 같이 에탄올 사용비율이 40%(v/v) 미만일 때는 저단편 아가로스의 비율이 50%(v/v) 미만이라서 바람직스럽지 못하였고, 70%(v/v)를 초과하는 경우에는 저단편 아가로스 회수율이 오히려 떨어지는 문제가 있어 바람직스럽지 못하였다.

실시예 1: 본원발명 아가로스의 제조

원료 한천으로 식품 첨가용 한천을 수용화 및 가수분해 공정이 용이하도록 분쇄기를 이용하여 입자를 50~100 메쉬로 분쇄하여 분말 한천 70g을 얻었다. 분말화된 한천은 40~70℃의 온수로 세척하여 이물질과 염류를 제거하였다.

한천의 농도가 0.7%(W/V)가 되도록 물을 첨가하고 온도를 100℃로 상승시켜 1시간 정도 온도를 유지하여 한천을 용해시킨 후 온도를 65℃로 유지하였다.

이 한천 용액에 키토산 또는 수용성 키토산 용액을 전체 수용액의 2%(W/V)의 비율이 되게 첨가하고, 70℃에서 서서히 교반하면서 15 시간 동안 반응시키면서 한천 중의 아가로펙틴 성분을 침전시키고, 반응이 끝난 후 침전물을 필터프레스(Filter Press) 등을 이용한 여과법으로 제거하고 상층액을 취하였다.

이 상층액의 온도를 60℃로 유지하면서 염산(HCl)을 이용하여 수용액의 수소이온 농도를 3으로 조절하여 3.5 시간 동안 서서히 교반한 다음 가성소다 분말을 이용하여 수소이온 농도를 7로 조절하였다.

중화된 아가로스 수용액의 온도를 25℃로 낮춘 다음 55%(v/v)의 에탄올을 아가로스 용액량의 1.0 배가 되도록 첨가하여 비수용성 성분을 침전시킨 다음 여과 또는 원심분리를 이용하여 침전물을 제거하고 상층액을 취하였다.

상층액을 감압 농축하에서 70% 농도가 되도록 농축시킨 다음, 이 농축액을 스프레이 드라이기(Spray Dryer)를 통해 분말화시켜서 최종적인 짧은 단편 DNA 편자 분리용 아가로스를 제조하였다.

실험예 3: 본원발명의 방법으로 제조된 아가로스의 성분 조사

상기 실시예 1에서 제조된 아가로스와 원료 한천의 황산기 함량, 회분함량, 겔강도, 전기저항도(electroendosmsis) 등 화학적 특성을 조사한 결과는 표 3과 같았다.

원료 한천과 제조된 저단편 DNA 편자 분리용 아가로스의 특성 비교

	원료 한천	저단편용 아가로스
황산기(%)	1.82	0.14
회분(%)	2.67	0.81
겔강도(g/cm2)	1,251	1,330
전기저항도(-mr)	0.22	0.11

실험예 4: 본원발명의 방법으로 제조된 아가로스의 효과 조사

상기 실시예 1의 방법으로 제조된 아가로스 1g를 이용하여 2% 겔을 제조하고, 9개의 단편이 포함되어 있는 100bp DNA ladder marker를 시료 500ng으로 80V의 전압 조건하에서 120 분간 전개하여 전기영동 실험을 실시하였다. 전기 영동 완료 후 에티디움브로마이드(EtBr)로 염색하여 그 결과를 확인하였으며, 그 결과는 도 2와 같다.

이상, 상기에서 설명한 바와 같이 본 발명은 국내에서 쉽게 구할 수 있는 원료 한천을 이용하여 짧은 단편 DNA 편자를 분리할 수 있는 뛰어난 효과를 제공하는 분자량 5,000~20,000 정도의 아가로스를 제공하므로 생물산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

도 1은 본 발명의 짧은 단편 DNA 편자 분리용 아가로스 제조 공정도이다.

도 2는 본 발명의 방법으로 제조된 아가로스를 이용하여 전기영동을 한 실험결과를 보여주는 사진도이다.

Claims (4)

1. 한천 용액에 키토산 용액을 첨가하여 아가로펙틴을 침전시켜 제거하고, 상층액을 분리한 후, 분말화하여 아가로스를 제조하는 방법에 있어서,

   상기 아가로펙틴이 침전되어 제거되고 남은 상층액에 산용액을 첨가하여 pH를 2~4로 조절하고 1~6시간 동안 교반한 후, 알칼리를 첨가하여 중화시키는 단계; 및,

   중화된 아가로스 수용액을 상온으로 냉각한 후, 여기에 40~70%(v/v) 농도의 에탄올을 아가로스 수용액 총량을 기준으로 하여 1.0배 첨가하여 침전되는 침전물 분리한 후, 상층액을 회수하여 분말화하는 것을 특징으로 하는 아가로스의 제조방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 산 용액은 염산용액인 것을 특징으로 하는 아가로스의 제조방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 알칼리는 수산화 나트륨인 것을 특징으로 하는 아가로스의 제조방법.
4. 제 1항에 있어서, 상기 분말화는 스프레이 드라이기를 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 아가로스의 제조방법.