CN104694400A - 一种固态发酵制备高色价红曲产品的方法 - Google Patents
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Abstract
一种固态发酵制备高色价红曲产品的方法，涉及一种可显著提高高粱红曲菌T3（Monascus kaoliang T3）色素产量的固态发酵培养基配方及其制备方法。所述固态发酵培养基配方中主要发酵基质为红米，同时添加少量的果糖（0.1%～1.0%）、氯化铵（0.01%～0.45%）、硫酸镁（0.05%～0.5%）和磷酸二氢钾（0.1%～0.5%），采用乳酸-水溶液0.01%～0.1%（w/v）控制培养基初始水份含量为25～55%，灭菌后即得高粱红曲菌T3（Monascus kaoliang T3）的固态发酵培养基。制备高色价红曲时，将高粱红曲菌T3（Monascus kaoliang T3）孢子悬液接种至冷却后的固态发酵培养基中培养，最后将发酵产物进行干燥即得高色价红曲产品。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，涉及一种色素高产菌株高粱红曲菌T3（Monascus kaoliang T3）的固态发酵培养基及其高色价红曲产品的制备方法。
背景技术
红曲也称丹曲，传统红曲的做法是以大米为原料，接种红曲菌经固体发酵而成，具有药食两用价值。红曲菌在分类学上属于真菌界，子囊菌门，真子囊菌纲， 散子囊菌目，红曲菌科，红曲菌属。
红曲在我国历史悠久，主要应用于酿酒、中药及食品添加剂等方面，在我国的福建、浙江、江西、广东、台湾一带广为使用，主要应用于酿酒、中药及食品添加剂等方面。红曲中具有多种生理活性的次级代谢物质（红曲色素、MonacolinK、γ-氨基丁酸等），具有健脾健胃、活血化瘀、降血压、降胆固醇和降血糖等作用，已成为研究的热点，引起众多学者的研究兴趣。其中，红曲色素作为目前世界上唯一微生物发酵生产的天然色素，符合食品着色剂“天然、营养、多功能”的发展方向，具有很好的应用前景。现代科学研究表明，红曲色素主要由化学结构不同、性质相近的红、橙、黄三类色素组成，具有抑菌、抗氧化、降血脂、抗老年痴呆和抗癌的等多种生理功效。
开发高色价的红曲产品，红曲霉菌株的选育和发酵培养基的选择与优化是至关重要。红曲霉属的许多菌株被用于红曲色素的生产，其中使用最广泛的有：紫色红曲霉、红色红曲霉、安卡红曲霉和丛毛红曲霉。到目前为止，尚未见以高粱红曲菌T3（Monascus kaoliang T3）为发酵菌种用于制备高色价红曲产品的研究报道。作为一株具有特殊生理功能的微生物，由于其生长代谢可能受到培养条件的影响，如碳源、氮源、无机盐、水份等，因此急需对高粱红曲菌T3培养基成分进行优化，从而开发高色价的红曲产品。在食品或医药行业，红曲品种很多，大都以谷物为原料制备的，如大米、大豆、小米、玉米、木薯、菠萝蜜籽等谷物（穆洪霞等，红曲霉发酵不同底物产色素的研究进展. 中国酿造, Vol.33, No.1, 2014.）。
红米，米色粉红，糯性，米粒细长，有香气，富含蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸和人体必需的多种维生素，其微量元素锌、铜、铁、硒、钼、钙、锰等含量比普通稻米高 0.5～3倍。有研究显示，红米还含有黄酮类化合物、生物碱、植物甾醇以及强心甙和 β-胡萝卜素等药用成分。中医认为红米能滋阴补肾、健脾开胃，是延缓衰老的保健食品。然而，目前尚未见以红米为主要固态发酵基质制备高色价红曲产品的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可显著提高高粱红曲菌T3（Monascus kaoliang T3）色素产量的固态发酵培养基配方及其配制方法。
本发明的另一目的在于提供一种高色价红曲产品的固态发酵制备方法。
所述高粱红曲菌T3（Monascus kaoliang T3）已于2014年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉 武汉大学，保藏编号为CCTCC NO： M2014642。
其步骤包括如下：
1）称取红米、果糖、氯化铵、硫酸镁和磷酸二氢钾依次加入到三角瓶或其它可高压灭菌的容器中，采用乳酸-水溶液调节培养基初始水份含量，灭菌后即得高粱红曲菌T3（Monascus kaoliang T3）的固态发酵培养基；
2）灭菌的培养基冷却至室温后，接种10mL的高粱红曲菌T3（Monascus kaoliang T3）的孢子悬液，将培养基原料与孢子悬液充分混匀后置于恒温培养箱中培养，培养温度为25～35℃，时间为6～26天，发酵终产物置于鼓风干燥箱中烘干，烘干温度为30～60℃，时间为8～16小时。
所述高粱红曲菌T3（Monascus kaoliang T3）是一种高产色素的红曲菌。
本发明所述高粱红曲菌T3（Monascus kaoliang T3）的固态发酵培养基配方组成：主要发酵基质为红米，同时添加果糖（0.1%～1.0%）、氯化铵 （0.01%～0.45%）、硫酸镁（0.05%～0.5%）和磷酸二氢钾（0.1%～0.5%），采用乳酸-水溶液（0.01%～0.1%（w/v））控制培养基初始水份含量为25～55%。
本发明以红米为主要固态发酵基质，考察了外加营养成分（碳氮源、无机盐、水份等）浓度对高粱红曲菌T3（Monascus kaoliang T3）红曲色素产量的影响，并利用中心组合设计实验对培养基组成进行了优化，开发出了一种适合生产高色价红曲色素的高粱红曲菌T3（Monascus kaoliang T3）的固态发酵培养基。
本发明所述高粱红曲菌T3（Monascus kaoliang T3）的固态发酵培养基的组成最好为，在1000mL的三角瓶或其它可高压灭菌的容器中含有：
红米 100g；
果糖 0.54%；
氯化铵 0.06%；
硫酸镁 0.20%；
磷酸二氢钾 0.30%；
采用0.05%（w/v）的乳酸-水溶液控制培养基初始水份含量为38.02%。
本发明所述高粱红曲菌T3（Monascus kaoliang T3）的固态发酵培养基的制备方法为：
称取红米、果糖、氯化铵、硫酸镁和磷酸二氢钾依次加入到1000mL三角瓶或其它可高压灭菌的容器中，采用0.05%（w/v）的乳酸-水溶液调节培养基初始水份含量为38.02%，灭菌后即得高粱红曲菌T3（Monascus kaoliang T3）的高粱红曲菌T3（Monascus kaoliang T3）的固态发酵培养基。
所述灭菌，可采用高压灭菌，所述高压灭菌的条件可为：温度121℃，时间30min。
本发明所述高色价红曲产品的固态发酵制备方法为：
灭菌后的固态发酵培养基冷却至室温后，接种10mL的高粱红曲菌T3（Monascus kaoliang T3）的孢子悬液，将培养基原料与孢子悬液充分混匀后置于恒温培养箱中发酵，发酵温度为25～35℃，发酵时间为6～26天，发酵终产物置于鼓风干燥箱中烘干，烘干温度为30～60℃，时间为8～16小时。
所述高粱红曲菌T3（Monascus kaoliang T3）孢子悬液的制备方法为：
将高粱红曲菌T3（Monascus kaoliang T3）菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂斜面，在26-35℃下活化培养5-8天，经活化扩培两次后，加入100mL的无菌孢子洗脱液（0.9%（w/v）氯化钠和0.1%（w/v）吐温80）洗脱斜面上的孢子。
所述发酵温度最好为30℃，发酵时间最好为10天。
所述发酵终产物的烘干温度最好为40℃，时间最好为10小时；
所述高色价红曲产品的水分含量为10％以下。
本发明的红曲菌经马铃薯葡萄糖琼脂斜面活化扩培、固态发酵培养基发酵，发酵获得的红米发酵产物中红曲菌生物量多、色素色价高、Monacolin K高以及含有必须脂肪酸亚油酸等抗氧化成分，制备周期短，具有丰富的营养价值和突出的医疗保健作用。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为本发明的固态发酵培养基中果糖和氯化铵两因素交互作用对色素产量影响的响应面三维图。
图2为本发明的固态发酵培养基中果糖和氯化铵两因素交互作用对色素产量影响的等高线图。
图3为本发明的固态发酵培养基中水份含量和果糖两因素交互作用对色素产量影响的响应面三维图。
图4为本发明的固态发酵培养基中水份含量和果糖两因素交互作用对色素产量影响的等高线图。
图5为本发明的固态发酵培养基中水份含量和氯化铵两因素交互作用对色素产量影响的响应面三维图。
图6为本发明的固态发酵培养基中水份含量和氯化铵两因素交互作用对色素产量影响的等高线图。
具体实施方式
下面结合实例，更具体的说明本发明内容。本发明的制备方法，并不局限于以下实例，对本发明的制备方法有任何形式的改变，都将落入本发明的保护范围。
1. 菌种与培养基
（1）菌种：高粱红曲菌T3（Monascus kaoliang T3）来源于福建农林大学生命科学学院从福建各地区的红曲米中分离并筛选到的，是一株高产红曲色素和低产桔霉素的红曲菌，经菌落形态特征观察、生理生化试验以及分子生物学鉴定手段，被鉴定为高粱红曲菌（Monascus kaoliang）。
（2）培养基：
马铃薯葡萄糖琼脂斜面：将200g马铃薯去皮，切成块煮沸30min，然后用纱布过滤获得马铃薯汁，再加葡萄糖20 g，琼脂粉15～20 g，自然pH，加热使得琼脂粉溶化，补足蒸馏水至1000mL，分装于250mL的茄形瓶中（100mL/瓶），于121℃高压灭菌30min；
红米固态发酵基础培养基：称取100g 红米加入到1000mL三角瓶或其它可高压灭菌的容器中，采用0.05%（w/v）的乳酸-水溶液调节培养基水份含量为50 %，121℃高压灭菌30min即得高粱红曲菌T3（Monascus kaoliang T3）的红米固态发酵基础培养基。
2. 红曲色素测定方法
取发酵物约0.5g，用70%乙醇溶液或水10毫升浸泡振荡，超声破20分钟过滤，取滤液适当稀释后在410nm、465nm、510nm下测吸光度值，红曲色价=（OD410+ OD465+ OD510）×稀释倍数。
以下给出所述高粱红曲菌T3（Monascus kaoliang T3）的固态发酵培养基的优化过程。
（1）氯化铵添加量对总色价的影响：
表1 氯化铵添加量对总色价的影响
由表1可知，在外加氯化铵添加量为0.05％时，总色价含量最高，所以最佳氯化铵添加量为0.05％。
（2）果糖添加量对总色价的影响：
表2 果糖添加量对总色价的影响
由表2可知，在外加果糖添加量为0.60％时，总色价含量最高，所以最佳果糖添加量为0.60％。
（3）硫酸镁添加量对总色价的影响：
表3 硫酸镁添加量对总色价的影响
由表3可知，在硫酸镁添加量为0.20％时，总色价含量最高，所以最佳硫酸镁添加量为0.20％。
（4）磷酸二氢钾添加量对总色价的影响：
表4 磷酸二氢钾添加量对总色价的影响
由表4可知，在磷酸二氢钾添加量为0.30％时，总色价含量最高，所以最佳磷酸二氢钾添加量为0.30％。
（5）水份含量对总色价的影响：
表5 水份含量对总色价的影响
由表5可知，在水份含量为42.29％时，总色价含量最高，所以最佳水份含量为42.29％。
（6）响应面优化试验：
根据单因素试验结果，利用Design Expert 8.0 软件根据 Box-Behnken 设计原则进行实验设计，设置以下3个变量：果糖添加量为A、氯化铵添加量为B和水份含量为C，以发酵产物的色素产量作为响应值，采用中心组合设计原则进行优化。
表6 实验因素与水平设定
表7 中心组合设计实验结果
根据所得数据进行多元回归分析，得到响应变量（果糖添加量、氯化铵添加量和水份含量）与响应值（色价）之间的多元二次回归方程。
Y=6393.62-401.51A-584.26B-976.81C+113.69AB-106.31AC+930.52BC-627.1A2-1928.31B2-1715.4C2
利用Design Expert 8.0软件根据多元二次回归方程进行绘图分析，得到回归方程的响应面及其等高线图（参见图1~6）。
表8 回归模型方差分析
注：(*P＜0.05,差异显著；**P＜0.01，差异极显著)。
由表8可知，模型的P＜0.01，表明回归方程显著；失拟项P=0.5996＞0.05，表明不显著，说明本试验的二次回归方程能很好地预测响应值；对回归方程进行检验模型的校正决定系数RAdj 2=0.9891，说明该模型能解释约98.91% 的响应值的变化；决定系数 R2=0.9943，表明方程拟合程度较好，试验误差较小；变异系数 CV表示试验的精确度，其值越小，试验结果的可靠性越高，本试验 CV=7.43%，在可接受范围内，说明试验结果可靠，可以用此模型回归方程代替试验真实点对高粱红曲菌T3（Monascus kaoliang T3）固态发酵产物的色素色价进行分析和预测。
由以上单因素实验结果，可知各因素对高粱红曲菌T3（Monascus kaoliang T3）的红曲色素产量均有一定的影响；通过响应曲面法优化高粱红曲菌T3（Monascus kaoliang T3）的固态发酵培养基，获得最佳的培养基配方组成是红米 100g，果糖 0.54%，氯化铵 0.06%，硫酸镁0.20%，磷酸二氢钾0.30%，水份含量 38.02%。
以下给出本发明制备所述的高粱红曲菌T3（Monascus kaoliang T3）固态发酵培养基的实施例。
实施例1
所述高粱红曲菌T3（Monascus kaoliang T3）固态发酵培养基的组成为：
红米 100g；
果糖 0.54%；
氯化铵 0.06%；
硫酸镁 0.20%；
磷酸二氢钾 0.30%；
采用0.05%（w/v）的乳酸-水溶液控制培养基初始水份含量为38.02%。
固态发酵培养基的制备方法：称取红米、果糖、氯化铵、硫酸镁和磷酸二氢钾依次加入到1000mL的三角瓶中，采用0.05%（w/v）的乳酸-水溶液调节培养基初始水份含量，八层纱布外加两层牛皮纸包扎，高压灭菌121℃，30min，灭菌后即得高粱红曲菌T3（Monascus kaoliang T3）的固态发酵培养基。
高色价红曲制备方法：待灭菌的固态培养基冷却至室温后，接种10mL的高粱红曲菌T3（Monascus kaoliang T3）的孢子悬液，将培养基原料与孢子悬液充分混匀后置于恒温培养箱中培养，培养温度为30℃，时间为10天，发酵终产物置于鼓风干燥箱中烘干，烘干温度为40℃，时间为10小时。经检测红曲色素的色价为6684.16 U·g-1，与回归模型的预测值（6693.99 U·g-1）非常接近，且比优化前的红米基础培养基提高了近10倍，说明利用响应曲面优化实验不仅可行而且有效。
实施例2
与实施例1类似，其区别在于固态发酵培养基的组成为：
红米 100g；
果糖 0.60%；
氯化铵 0.07%；
硫酸镁 0.20%；
磷酸二氢钾 0.30%；
采用0.05%（w/v）的乳酸-水溶液控制培养基初始水份含量为42.29%。
固态发酵培养基的制备方法：称取红米、果糖、氯化铵、硫酸镁和磷酸二氢钾依次加入到1000mL的三角瓶中，采用0.05%（w/v）的乳酸-水溶液调节培养基初始水份含量，八层纱布外加两层牛皮纸包扎， 121℃灭菌30分钟。待灭菌的固态培养基稍冷却后摇散，按12.5%接种量进行接种，接种后的红米再进行充分的摇散后，放入30℃恒温培养箱中培养10天，每天摇散红米使其发酵均匀而充分。将发酵好的红米取出，放入40℃烘10小时即得红米红曲，经红曲色素检测其色价值为6236.0 U·g-1。
实施例3
与实施例1类似，其区别在于固态发酵培养基的组成为：
红米 100g；
果糖 0.80%；
氯化铵 0.11%；
硫酸镁 0.20%；
磷酸二氢钾 0.30%；
采用0.05%（w/v）的乳酸-水溶液控制培养基初始水份含量为55%。固态发酵培养基的制备方法：称取红米、果糖、氯化铵、硫酸镁和磷酸二氢钾依次加入到1000mL的三角瓶中，采用0.05%（w/v）的乳酸-水溶液调节培养基初始水份含量，八层纱布外加两层牛皮纸包扎， 121℃灭菌30分钟。待灭菌的固态培养基稍冷却后摇散，按12.5%接种量进行接种，接种后的红米再进行充分的摇散后，放入30℃恒温培养箱中培养10天，每天摇散红米使其发酵均匀而充分。将发酵好的红米取出，放入40℃烘10小时即得红米红曲，经红曲色素检测其色价值为1106.65 U·g-1。
Claims (8)
1.一种高粱红曲菌，其特征在于：所述的高粱红曲菌T3（Monascus kaoliang T3）已于2014年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2014642。
2. 一种固态发酵制备高色价红曲产品的方法，其特征在于：其步骤包括如下：
1）称取红米、果糖、氯化铵、硫酸镁和磷酸二氢钾依次加入到三角瓶或其它可高压灭菌的容器中，采用乳酸-水溶液调节培养基初始水份含量，灭菌后即得高粱红曲菌T3（Monascus kaoliang T3）的固态发酵培养基；
2）灭菌的培养基冷却至室温后，接种10mL的高粱红曲菌T3（Monascus kaoliang T3）的孢子悬液，将培养基原料与孢子悬液充分混匀后置于恒温培养箱中培养，培养温度为25～35℃，时间为6～26天，发酵终产物置于鼓风干燥箱中烘干，烘干温度为30～60℃，时间为8～16小时。
3. 根据权利要求2所述的一种固态发酵制备高色价红曲产品的方法，其特征在于：所述的高粱红曲菌T3（Monascus kaoliang T3）的固态发酵培养基配方组成：主要发酵基质为红米，同时添加果糖0.1%～1.0%、氯化铵0.01%～0.45%、硫酸镁0.05%～0.5%和磷酸二氢钾0.1%～0.5%，采用乳酸-水溶液0.01%～0.1%（w/v）控制培养基初始水份含量为25～55%。
4. 根据权利要求2所述的一种固态发酵制备高色价红曲产品的方法，其特征在于：所述的高粱红曲菌T3（Monascus kaoliang T3）的固态发酵培养基配方组成是在1000mL的三角瓶或其它可高压灭菌的容器中含有：
红米 100g；
果糖 0.54%；
氯化铵 0.06%；
硫酸镁 0.20%；
磷酸二氢钾 0.30%；
采用0.05%（w/v）的乳酸-水溶液控制培养基初始水份含量为38.02%。
5. 根据权利要求2所述的一种固态发酵制备高色价红曲产品的方法，其特征在于高粱红曲菌T3（Monascus kaoliang T3）的孢子悬液是通过将高粱红曲菌T3菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂斜面，在26-35℃下活化培养5-8天，经活化扩培两次后，加入100mL的无菌孢子洗脱液洗脱斜面上的孢子而获得的；所述的无菌孢子洗脱液为0.9%（w/v）氯化钠和0.1%（w/v）吐温80。
6. 根据权利要求2所述的一种固态发酵制备高色价红曲产品的方法，其特征在于所述灭菌的条件为：温度121℃，时间30min。
7. 如权利要求2所述的一种固态发酵制备高色价红曲产品的方法，其特征在于发酵温度为30℃，发酵时间为10天。
8. 如权利要求2所述的一种固态发酵制备高色价红曲产品的方法，其特征在于发酵终产物的烘干温度为40℃，时间为10小时。
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
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