CN104073527A - 一种花生四烯酸的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种花生四烯酸的制备方法及其应用，其工艺流程包括：斜面菌种活化、种子培养、液体深层连续发酵、超滤膜分离并浓缩、脲包合。采用本发明制备发生四烯酸，操作简单，且可在发酵罐内实现连续发酵，延长发酵时间，提高花生四烯酸得率。经药效学评价，证实该花生四烯酸具有降血脂、降低胆固醇的作用，可用于制备治疗高血脂、高胆固醇的药物中。
Description
技术领域
本发明涉及一种花生四烯酸的制备方法及其应用。
背景技术
花生四烯酸（araehidonic acid，AA或ARA）系统命名为全顺-5,8,11,14-二十碳四烯酸，又名5,8,11,14-花生酸，分子量304.5，分子式C20H32O2，在室温下呈液体，沸点245℃，溶解于醇、醚和水中。由于ARA在成年人体内合成量极少，婴幼儿体内无法合成。因此，从食物中提取额外的ARA对人体细胞组织特别是脑组织的生长发育至关重要。ARA油脂的传统来源是从动物肝脏、猪肾上腺、血液和蛋黄中提取，但动物组织中的ARA含量很低（约为0.2%），来源少，且受季节限制，价格昂贵，无法满足日益增长的市场需求。目前，利用发酵法生产ARA，因受原料和自然条件影响较小，含量稳定，可实现工业化大规模生产，所以越来越受重视。现有的微生物发酵法生产生的花生四烯酸存在产率较低、生产成本较高等问题。
为了克服上述技术缺点，本发明采用生物发酵法-膜分离联用生产花生四烯酸，具有操作简单、设备投入小、产率高等优点。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种花生四烯酸的制备方法及其所得产品在制备治疗高血脂、高胆固醇的药物中的应用。
本发明通过以下技术方案予以实现：
1.一种花生四烯酸的制备方法，包括如下步骤：
a.高山被孢霉接种于斜面PDA培养基上，28℃恒温培养7~10天；
b.三角瓶内装种子培养基，于120℃灭菌30min，冷却后，按5~10%的接种量接入孢子悬浮液，置于摇床于200r/min、28℃的条件下培养4~6天；
c.将种液接入装有培养基发酵罐发酵，发酵温度为28℃，发酵时每1L发酵液通以1L/min气体并以200 r/min的速度进行搅拌，发酵72小时后将发酵液强制循环，通过0.2μm的微孔滤膜，滤过速度控制在1个发酵罐体积/小时，在稳态条件下连续排放滤液，固体菌丝体被截留在发酵罐内重复使用，同时用泵连续输入新鲜液体培养基，保持发酵罐内物料的体积恒定，连续发酵36h，结束发酵，收集所有滤液，即得总发酵液；
d.将总发酵液通过分子量截留值为3000~5000的超滤膜进行超滤，排除滤液，循环操作，直至浓缩液的体积降至原来的1/3；
e.将所得浓缩液加入3~6倍的95%的乙醇，0~4℃静置20h，收集沉淀，洗涤干燥，得ARA油脂。
步骤b和c中所述的培养基含有下列重量体积百分比的物质：花生粉3%，蔗糖5.0%，磷酸二氢钾0.1%，碳酸钙0.2%，蛋白胨1.5%，酵母膏1.0%，pH6.5。
步骤c中所述的超滤膜分子截留量值为4000。
2.花生四烯酸在制备治疗高血脂、高胆固醇的药物中的应用
a.实验动物SD雄性大鼠50只，体重（170±20）g
b.实验方法
将大鼠在实验环境下喂养普通饲料，观察5~10天，鼠尾静脉取血，离心血清，测定各项血脂指标正常值。随机分5组大鼠，每组10只，分别为正常对照组、高脂模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，除正常对照组外，各组动物换用高胆固醇饲料喂养，高脂模型组不给药；低剂量组灌胃给予样品2mg/kg；中剂量组灌胃给予样品4mg/kg；高剂量组给予样品6mg/kg；正常组和模型组以等量生理盐水对照。6周后眼球取血测定各项指标，按酶学和免疫投射比浊法分别测定血脂各项。
c.数据处理
表1 花生四烯酸对大鼠血脂的影响
与模型组比较：**P＜0.01
d.结果
由c中的实验数据可看出，实验6周后，与高脂模型组相比，低剂量组的TC、LDC-C分别下降了53.9%、48.4%；中剂量组的TC、LDC-C分别下降了63.1%、61.9%；高剂量组的TC、LDC-C分别下降了74.5%、84.8%。本研究证实花生四烯酸可使TC、LDC-C显著降低，而各剂量组HPL-C水平分别提高了5.7%、17.1%、44.7%，有所上升，并呈剂量依赖性。总体来说花生四烯酸具有显著的降血脂功效。
本发明简单易行，且产率较高。所得产品经药效学评价，具有明显的降血脂、降胆固醇的作用。
下面将结合具体实施方式进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
具体实施方式：
实施例1：
高山被孢霉接种于斜面PDA培养基上，28℃恒温培养7天；三角瓶内装种子培养基(配方为花生粉3%，蔗糖5.0%，磷酸二氢钾0.1%，碳酸钙0.2%，蛋白胨1.5%，酵母膏1.0%，pH6.5)，于120℃灭菌30min，冷却后，按5%的接种量接入孢子悬浮液，置于摇床于200r/min、28℃的条件下培养4天；将种液接入装有培养基发酵罐发酵，发酵温度为28℃，发酵时每1L发酵液通以1L/min气体并以200 r/min的速度进行搅拌，发酵72小时后将发酵液强制循环，通过0.2μm的微孔滤膜，滤过速度控制在1个发酵罐体积/小时，在稳态条件下连续排放滤液，固体菌丝体被截留在发酵罐内重复使用，同时用泵连续输入新鲜液体培养基，保持发酵罐内物料的体积恒定，连续发酵36h，结束发酵，收集所有滤液，即得总发酵液；将总发酵液通过分子量截留值为3000的超滤膜进行超滤，排除滤液，循环操作，直至浓缩液的体积降至原来的1/3；将所得浓缩液加入3倍的95%的乙醇，0℃静置20h，收集沉淀，洗涤干燥，得ARA油脂，其浓度为78.99%。
实施例2：
高山被孢霉接种于斜面PDA培养基上，28℃恒温培养10天；三角瓶内装种子培养基(配方为花生粉3%，蔗糖5.0%，磷酸二氢钾0.1%，碳酸钙0.2%，蛋白胨1.5%，酵母膏1.0%，pH6.5)，于120℃灭菌30min，冷却后，按10%的接种量接入孢子悬浮液，置于摇床于200r/min、28℃的条件下培养6天；将种液接入装有培养基发酵罐发酵，发酵温度为28℃，发酵时每1L发酵液通以1L/min气体并以200 r/min的速度进行搅拌，发酵72小时后将发酵液强制循环，通过0.2μm的微孔滤膜，滤过速度控制在1个发酵罐体积/小时，在稳态条件下连续排放滤液，固体菌丝体被截留在发酵罐内重复使用，同时用泵连续输入新鲜液体培养基，保持发酵罐内物料的体积恒定，连续发酵36h，结束发酵，收集所有滤液，即得总发酵液；将总发酵液通过分子量截留值为4000的超滤膜进行超滤，排除滤液，循环操作，直至浓缩液的体积降至原来的1/3；将所得浓缩液加入5倍的95%的乙醇，4℃静置20h，收集沉淀，洗涤干燥，得ARA油脂，其浓度为85.33%。
实施例3：
高山被孢霉接种于斜面PDA培养基上，28℃恒温培养8天；三角瓶内装种子培养基(配方为花生粉3%，蔗糖5.0%，磷酸二氢钾0.1%，碳酸钙0.2%，蛋白胨1.5%，酵母膏1.0%，pH6.5)，于120℃灭菌30min，冷却后，按5%的接种量接入孢子悬浮液，置于摇床于200r/min、28℃的条件下培养5天；将种液接入装有培养基发酵罐发酵，发酵温度为28℃，发酵时每1L发酵液通以1L/min气体并以200 r/min的速度进行搅拌，发酵72小时后将发酵液强制循环，通过0.2μm的微孔滤膜，滤过速度控制在1个发酵罐体积/小时，在稳态条件下连续排放滤液，固体菌丝体被截留在发酵罐内重复使用，同时用泵连续输入新鲜液体培养基，保持发酵罐内物料的体积恒定，连续发酵36h，结束发酵，收集所有滤液，即得总发酵液；将总发酵液通过分子量截留值为5000的超滤膜进行超滤，排除滤液，循环操作，直至浓缩液的体积降至原来的1/3；将所得浓缩液加入6倍的95%的乙醇，2℃静置20h，收集沉淀，洗涤干燥，得ARA油脂，其浓度为82.14%。
Claims (4)
1. 一种花生四烯酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a. 高山被孢霉接种于斜面PDA培养基上，28℃恒温培养7~10天；
b. 三角瓶内装种子培养基，于120℃灭菌30min，冷却后，按5~10%的接种量接入孢子悬浮液，置于摇床于200r/min、28℃的条件下培养4~6天；
c. 将种液接入装有培养基发酵罐发酵，发酵温度为28℃，发酵时每1L发酵液通以1L/min气体并以200 r/min的速度进行搅拌，发酵72小时后将发酵液强制循环，通过0.2μm的微孔滤膜，滤过速度控制在1个发酵罐体积/小时，在稳态条件下连续排放滤液，固体菌丝体被截留在发酵罐内重复使用，同时用泵连续输入新鲜液体培养基，保持发酵罐内物料的体积恒定，连续发酵36h，结束发酵，收集所有滤液，即得总发酵液；
d. 将总发酵液通过分子量截留值为3000~5000的超滤膜进行超滤，排除滤液，循环操作，直至浓缩液的体积降至原来的1/3；
e. 将所得浓缩液加入3~6倍的95%的乙醇，0~4℃静置20h，收集沉淀，洗涤干燥，得ARA油脂。
2. 根据权利要求1所述的一种花生四烯酸的制备方法，其特征在于，步骤b和c中所述的培养基含有下列重量体积百分比的物质：花生粉3%，蔗糖5.0%，磷酸二氢钾0.1%，碳酸钙0.2%，蛋白胨1.5%，酵母膏1.0%，pH6.5。
3. 根据权利要求1所述的一种花生四烯酸的制备方法，其特征在于，步骤c中所述的超滤膜分子截留量值为4000。
4. 根据权利要求1~3所述的制备方法制备的花生四烯酸在制备治疗高血脂或高胆固醇药物中的应用。
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| CN201410266352.1A CN104073527A (zh) | 2014-06-16 | 2014-06-16 | 一种花生四烯酸的制备方法及其应用 |
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN107974470A (zh) * | 2016-10-25 | 2018-05-01 | 华中科技大学 | 一种提高被孢霉合成多不饱和脂肪酸油脂的方法 |
| CN111398440A (zh) * | 2020-03-06 | 2020-07-10 | 厦门市健康医疗大数据中心(厦门市医药研究所) | 一种血液中花生四烯酸的检测方法 |
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2014
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|---|---|---|---|---|
| CN107974470A (zh) * | 2016-10-25 | 2018-05-01 | 华中科技大学 | 一种提高被孢霉合成多不饱和脂肪酸油脂的方法 |
| CN107974470B (zh) * | 2016-10-25 | 2020-11-13 | 华中科技大学 | 一种提高被孢霉合成多不饱和脂肪酸油脂的方法 |
| CN111398440A (zh) * | 2020-03-06 | 2020-07-10 | 厦门市健康医疗大数据中心(厦门市医药研究所) | 一种血液中花生四烯酸的检测方法 |
| CN111398440B (zh) * | 2020-03-06 | 2022-09-20 | 厦门市健康医疗大数据中心(厦门市医药研究所) | 一种血液中花生四烯酸的检测方法 |
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