CN104586773B - 一种云芝多糖颗粒冲剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术、药学和食品科学领域，具体涉及一种云芝多糖颗粒冲剂及其制备方法与应用。本发明以云芝多糖提取物为主要原料，再添加适量的辅料制成。其制备方法为：将所述的云芝多糖颗粒冲剂的组分混合搅匀；用乙醇制成软材；过筛，干燥，过筛整粒，制得云芝多糖颗粒冲剂。本发明的颗粒冲剂制备过程简单，条件易控；制成颗粒冲剂储存时间明显延长，且易溶于水；与含糖冲剂相比，具有溶解性好、防潮、去其味和提高疗效等特点，适用于高脂血症，扩大了使用范围，且具有良好的降血脂作用。

Description

一种云芝多糖颗粒冲剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术、药学和食品科学领域，具体涉及一种云芝多糖颗粒冲剂及其制备方法与应用。

背景技术

云芝多糖来自液体培养的云芝菌丝体中的胞内多糖或发酵液中的胞外多糖。研究发现云芝多糖能降低大鼠大脑组织的脂质过氧化水平，并加速自由基的清除(Chen etal.,2013)。特别地，饶刚等人通过临床观察验证了云芝多糖对高脂血症有明显疗效，是一种安全的制剂(饶刚，2007)。王红等人也发现PSK有一定降血脂作用，具有一定的时效性和改善血液的黏、凝、聚状态(王红，2011)云芝菌株发酵的目的是收获菌丝体和发酵液,提取得到云芝胞内多糖和胞外多糖,这就要求提高产量,同时现在已有发酵制备云芝胞内胞外多糖及其产品的分离纯化的最适合条件(孙静，2012)。云芝糖肽在体内对荷瘤小鼠的免疫调节作用可能是通过TLR4信号通路来实现的(董冰，2014)；宋娟娜等在颗粒成型工艺研究中加入一定的辅料发现颗粒的成型性、溶解性及抗湿性都有所增强(宋娟娜等，2008)，表明对多糖添加一定辅料，可提高多糖稳定性，降低其吸湿性。云芝多糖通常具有较强的吸湿性，易吸收空气中的水分，结块、甚至霉变，从而影响药品的质量和疗效，为了降低其吸湿性而便于储藏，一般加入适量的辅料与之混合。目前云芝多糖颗粒冲剂产品的开发尚不多见，本专利通过云芝多糖颗粒冲剂产品的研制，并且采用高血脂症小鼠实验来鉴定云芝多糖颗粒冲剂产品的降血脂功效，为云芝多糖产品的保健应用提供科学的依据。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种云芝多糖颗粒冲剂，该云芝多糖颗粒冲剂制作简单、成本低且吸湿率小、稳定性好。

本发明的另一个目的在于提供上述云芝多糖颗粒冲剂的制备方法。

本发明的另一个目的在于提供上述云芝多糖颗粒冲剂应用。

本发明的目的通过下述方案实现：

一种云芝多糖颗粒冲剂，包含如下按质量百分比计的组分：

所述的云芝多糖颗粒冲剂，优选包含如下按质量百分比计的组分：

所述的云芝多糖颗粒冲剂的制备方法，包含如下步骤：将所述的云芝多糖颗粒冲剂的组分混合搅匀；用乙醇制成软材；过筛，干燥，过筛整粒，制得云芝多糖颗粒冲剂；

所述的乙醇的体积分数为60％～80％；

所述的过筛是过14～40目筛；

所述的干燥温度为55～60℃；

所述的干燥温度优选为55℃；

所述的云芝多糖提取物的制备方法，包括如下步骤：

(1)云芝(Coriolus versicolor)液体深层发酵后，分离得到云芝菌丝体和发酵液，其中，云芝菌丝体干燥粉碎并过筛后脱脂，干燥，得到脱脂后的菌丝体；发酵液超滤去除小分子物质，得到云芝超滤液；

(2)热水浸提脱脂后的菌丝体，得到含云芝胞内多糖的浸提液；

(3)将步骤(1)得到的云芝超滤液和步骤(2)得到的浸提液分别浓缩，得到超滤浓缩液和浸提浓缩液；

(4)步骤(3)制备得到的超滤浓缩液和浸提浓缩液分别加入乙醇沉降多糖，待析出粗多糖，离心得到沉淀；先醇沉再去蛋白可以节约试剂和减少多糖损失；

(5)用水分别溶解步骤(4)制得的沉淀，并调节多糖溶液pH至7.5～8.5，采用胰蛋白酶和Sevage法去蛋白，分别得到去蛋白后的胞外多糖提取液和胞内多糖提取液；

(6)分别调节步骤(5)中制得的去蛋白后的胞外多糖提取液和胞内多糖提取液pH至7.5～8.0，滴加质量分数为30％的H₂O₂，在50～55℃水浴保温2～3h，对其进行氧化脱色处理；将脱色后的胞外多糖提取液和胞内多糖提取液装入截留分子量为8000～15000Da的透析袋中以蒸馏水透析2～3d，每8～10h更换一次蒸馏水；对透析完成后的溶液进行浓缩，并真空冷冻干燥，分别制得云芝胞外多糖提取物和云芝胞内多糖提取物；

步骤(1)中所述的云芝菌丝体干燥温度优选为50～55℃；所述的过筛筛目为14～40目，优选为40目；

步骤(1)中所述的脱脂方法优选为：以菌丝体粉末与石油醚按体积比1:2混匀，振荡或搅拌处理2～3d，脱去菌丝体中的脂质，离心留沉淀；重复脱脂1～2次；

步骤(1)中所述的超滤条件优选为进膜压力为10bar，通量3～5L/min，物料温度22℃；所述的超滤优选用1万分子量PS超滤膜超滤；

步骤(2)中所述的热水浸提云芝多糖时，料液比为1:30，提取时间为2～3h，提取温度为90℃，提取次数为1～3次；

步骤(3)中所述的浓缩的温度优选为55℃～60℃；优选为60℃；

步骤(4)中所述的乙醇用量为超滤浓缩液或浸提浓缩液体积的3～5倍；

步骤(4)中所述的沉降温度为0～8℃，沉降的时间为48～72h；

步骤(5)中所述的质量分数为30％的H₂O₂用量为每100mL多糖提取液加2mL的质量分数为30％的H₂O₂；

步骤(5)中所述的胰蛋白酶和Sevage法，包含如下步骤：

①将胰蛋白酶加入多糖溶液中充分混合并37℃～40℃振荡30～60min，再水浴灭酶10～15min，冷却至室温；

②加入0.2倍体积的氯仿正丁醇混合液，剧烈振荡30～40min；然后离心，弃取蛋白层及有机溶液，回收上清液；

③重复步骤②2～3次，得到去蛋白后的多糖提取液；

步骤①中所述的胰蛋白酶的初始浓度优选为2％(W/V)；所述的胰蛋白酶的用量为多糖溶液体积的8％～15％；所述的灭酶温度优选为100℃～110℃；

步骤①中所述的将胰蛋白酶加入多糖溶液中充分混合的具体操作优选为：配制2％(W/V)胰蛋白酶溶液，将胰蛋白酶溶液和多糖溶液分别35℃～40℃水浴预热10～15min，然后将预热后的胰蛋白酶溶液和多糖溶液充分混合；

步骤②所述的氯仿正丁醇混合液中氯仿和正丁醇的体积比为5:1；

步骤②所述的离心转速为8000～10000rpm，所述的离心时间为10～15min；

步骤(1)中所述的云芝(Coriolus versicolor)液体发酵的方法，包含如下步骤：

(Ⅰ)将云芝斜面母种活化培养后转接至斜面固体培养基中，24～27℃培养10～15d，直至菌丝铺满斜面为止，得到云芝斜面菌种；

(Ⅱ)从步骤(Ⅰ)制备得到的云芝斜面菌种上挑取4～6菌块，接种至200mL的液体发酵培养基中，室温静置24h，待菌块伤口处愈合后，在150rpm，27℃的条件下振荡培养6d，制得一级种子液；

(Ⅲ)将步骤(Ⅱ)制备得到的一级种子液转入50L种子罐培养二级种子液，接种量为7％，培养温度为27℃，转速为150rpm，罐压为0.05～0.07MPa，通气量1.5m³/h(V:V为1:0.6)，培养3d后转入500L发酵罐培养，初始培养条件温度，转速及罐压与种子罐相同，通气量为12m³/h，培养3～5d；

步骤(Ⅰ)所述的斜面固体培养基的配方为：马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，蛋白胨1g，(NH₄)₂SO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 1g，KH₂PO₄ 1g，琼脂20g，加蒸馏水定容至1000mL，pH调至6.5；

步骤(Ⅱ)和(Ⅲ)中用于一级种子液和二级种子液培养以及发酵培养的培养基配方为：步骤(1)中所述的云芝液体深层发酵的培养基配方为：葡萄糖50g，NH₄NO₃ 2g，KH₂PO₄2g，MgSO₄·7H₂O 1g，维生素B₁ 0.05g，水1000mL，pH 6.5；

一种云芝多糖提取物，根据上述制备方法制备得到；

所述的云芝胞内多糖提取物(IPCV)中总糖、还原糖、蛋白质含量分别为66.83％～69.93％，3.22％～3.88％，0.17％～0.33％；云芝胞外多糖提取物(EPCV)中总糖、还原糖、蛋白质含量分别为66.29％～68.16％，3.53％～4.87％，0.21％～0.35％；

本发明制备得到云芝多糖颗粒冲剂具有良好的降血脂作用，显著降低动脉粥样硬化指数，具有抗动脉粥样硬化的能力；

所述的云芝多糖颗粒冲剂在降血脂药物与保健食品应用中的使用剂量为2998.5mg/kg·d(含200mg/kg·d云芝多糖提取物)。

本发明以云芝多糖提取物为主要原料，并添加一定的辅料，其中辅料应具有良好的流动性，吸湿性低、易成型，有润湿性，有利于崩解与溶出，不影响指标成分的溶出，不与指标成分相互作用，且不影响疗效，以可溶性淀粉、糊精等为辅料效果较好，该颗粒冲剂乳白色，易溶于水。在外观、融化性具有良好的效果，加入糊精的处方所制颗粒成型性好，溶解后无沉淀产生，单独用糊精制得的颗粒成型性一般，不易完全溶解；可溶性淀粉的粘合性大，在形成颗粒有较大的作用。

与现有的技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

本发明的云芝多糖颗粒冲剂，通过多糖提取物与各辅料按适当比例制得，此法制得的多糖冲剂以云芝多糖为功能成分，以可溶性淀粉为稀释剂，以甜蜜素为甜味剂。甜蜜素具有高甜度、低热能、无毒性以及无副作用等特点，且热量仅为蔗糖的1/1000，甜度为蔗糖的40倍。制备过程简单，条件易控制。此多糖颗粒的储存时间明显延长，且易溶于水；本发明制成的颗粒剂与含糖冲剂相比，具有溶解性好、防潮、无异味、高疗效等特点，可适用于高血脂症患者，扩大了使用范围，且具有良好的保护肝脏的作用。

附图说明

图1是实施例4中各处方的吸湿百分率比较分析图。

图2是云芝多糖颗粒冲剂对小鼠血清TC和TG影响的结果分析图。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。

实施例中涉及到的培养基配方：

斜面固体培养基配方：马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，蛋白胨1g，(NH₄)₂SO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 1g，KH₂PO₄ 1g，琼脂20g，加蒸馏水定容至1000mL，pH调至6.5；

液体发酵培养基配方：葡萄糖50g，NH₄NO₃ 2g，KH₂PO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 1g，维生素B₁ 0.05g，水1000mL，pH 6.5；

云芝(Coriolus versicolor)菌株由华南师范大学生命科学学院提供(张峰源,张松,曾剑锋.罗炜杰,云芝、灵芝和柱状田头菇胞外多糖对果蝇寿命的影响.生命科学研究,11(2):130-133,2007.)；

实施例1

(1)云芝(C.versicolor)经斜面或平板菌种培养、液体振荡培养和液体深层发酵培养，得到菌丝体和发酵液，具体方法如下：

①斜面或平板菌种培养：将活化后的云芝斜面母种菌丝块接入新的斜面固体培养基中，24℃培养10d，置于4℃保存备用；

②一级液体菌种培养：取200mL液体发酵培养基装入500mL三角瓶，在121℃灭菌20min，并接入4个黄豆大小的的云芝母种菌丝块；室温静置24h，待菌块伤口处愈合后在27℃，转速150rpm，避光恒温振荡培养6天，得到一级种子液；

③二级液体菌种培养：50L种子罐装入液体发酵培养基35L，125℃灭菌20min；冷却后接入2.45L培养好的一级种子液，培养温度为27℃，转速为150rpm，罐压为0.05～0.07MPa，通气量约1.5m³/h(V:V为1:0.6)培养3天，取样观察可发现到种子液清澈透亮，菌丝体丰富，大小均匀。

④液体深层发酵培养：将培养好的二级种子液转入500L发酵罐培养，初始培养条件温度，转速及罐压与种子罐相同，通气量约为12m³/h，培养4d；

(2)发酵产物4000rpm离心10min并真空抽滤分离菌丝体，获得澄清的发酵液和云芝菌丝体；发酵液经1万分子量PS超滤膜超滤去除小分子物质后，浓缩至20L，得到云芝超滤液，其中，超滤条件为：进膜压力约为10bar，通量4L/min，物料温度22℃；

(3)将云芝菌丝体于50℃的恒温箱烘干，粉碎，并过40目筛后，进行脱脂处理(菌丝体粉末与石油醚按体积比1:2混匀，于摇床振荡2d，脱去菌丝体粉中的脂质，离心后将粉末按上述步骤重复脱脂一次)；脱脂后的菌丝体粉末干燥备用，待进行多糖的提取；

(4)以料液比为1:30，提取时间为2h，提取温度为90℃，提取次数为2次的工艺参数热水浸提云芝多糖得到含有云芝胞内多糖的浸提液；

(5)用旋转蒸发仪将步骤(2)得到的云芝超滤液和步骤(4)得到的浸提液分别在60℃减压浓缩至原体积的1/5(尽量浓缩到水分极少的粘稠状态)，得到超滤浓缩液和浸提浓缩液；

(6)将步骤(5)制备得到的超滤浓缩液和浸提浓缩液分别加入4倍体积的乙醇，置于4℃冰箱冷藏2d，待析出粗多糖，离心得到沉淀；

(7)用100mL蒸馏水溶解沉淀，调节多糖溶液pH至8.0，称取2.0g胰蛋白酶溶于100mL蒸馏水中，将胰蛋白酶溶液及多糖溶液同时放入37℃水浴锅中预热10min，把两者充分混合(胰蛋白酶溶液的添加体积为多糖溶液体积的10％)，并振荡保持30min后放入100℃水浴灭酶10min，冷却至室温；然后加入0.2倍体积的氯仿和正丁醇混合液(氯仿:正丁醇(V：V)＝5:1)，剧烈震荡30min，然后8000rpm离心10min，弃去蛋白层和有机溶液，回收上清液；此过程重复2次，收集上清液；即为去蛋白后的云芝胞外多糖提取液和云芝胞内多糖提取液；

(8)分别调节去蛋白后的云芝胞外多糖提取液和云芝胞内多糖提取液pH至8.0，然后滴加质量分数为30％的H₂O₂(100mL提取液加2mL的质量分数为30％的H₂O₂)，在50℃水浴保温2h，对其氧化脱色处理；然后将脱色后的提取液装入截留分子量为8000～15000Da的透析袋中以蒸馏水透析3d，每8h更换一次蒸馏水；最后，对透析完成后的溶液进行浓缩，并真空冷冻干燥，获得云芝胞内多糖和胞外多糖提取物。

云芝胞内多糖提取物和云芝胞外多糖提取物，经苯酚硫酸法测定含总糖分别为66.83％和66.29％，经DNS比色法测定含还原糖分别为3.22％和3.53％，经考马斯亮兰法测定含蛋白分别为0.17％和0.21％。

实施例2

(1)云芝(C.versicolor)经斜面或平板菌种培养、液体振荡培养和液体深层发酵培养，得到菌丝体和发酵液，具体方法件如下：

①斜面或平板菌种培养：将活化后的云芝斜面母种菌丝块接入新的斜面固体培养基中，25℃培养12d，置于4℃保存备用；

②一级液体菌种培养：取200mL液体发酵培养基装入500mL三角瓶，在121℃灭菌20min，并接入6个黄豆大小的的云芝母种菌丝块；室温静置24h，待菌块伤口处愈合后在27℃，转速150rpm，避光恒温振荡培养6天，得到一级种子液；

③二级液体菌种培养：50L种子罐装入液体发酵培养基35L，125℃灭菌20min；冷却后接入2.45L培养好的一级种子液，培养温度为27℃，转速为150rpm，罐压为0.05～0.07MPa，通气量约1.5m³/h(V:V为1:0.6)培养3天，取样观察可发现到种子液清澈透亮，菌丝体丰富，大小均匀；

④液体深层发酵培养：将培养好的二级种子液转入500L发酵罐培养，初始培养条件温度，转速及罐压与种子罐相同，通气量约为12m³/h，培养5d；

(2)发酵产物4000rpm离心10min并真空抽滤分离菌丝体，获得澄清的发酵液和云芝菌丝体；发酵液经1万分子量PS超滤膜超滤去除小分子物质后，浓缩至20L，得到云芝超滤液，其中，超滤条件为：进膜压力约为10bar，通量5L/min，物料温度22℃；

(3)将云芝菌丝体于55℃的恒温箱烘干，粉碎，并过20目筛后，进行脱脂处理(菌丝体粉末与石油醚按体积比1:2混匀，于摇床振荡3d，脱去菌丝体粉中的脂质，离心后将粉末按上述步骤重复脱脂二次)；脱脂后的菌丝体粉末干燥备用，待进行多糖的提取；

(4)以料液比为1:30，提取时间为3h，提取温度为90℃，提取次数为3次的工艺参数热水浸提脱脂后的菌丝体得到含有云芝胞内多糖的浸提液；

(5)用旋转蒸发仪将步骤(2)得到的云芝超滤液和步骤(4)得到的浸提液分别在55℃减压浓缩至原体积的1/7(尽量浓缩到水分极少的粘稠状态)，得到超滤浓缩液和浸提浓缩液；

(6)将步骤(5)制备得到的超滤浓缩液和浸提浓缩液分别加入3倍体积的乙醇，置于0℃冷藏12h，待析出粗多糖，离心得到沉淀；

(7)用100mL蒸馏水溶解沉淀，调节多糖溶液pH至8.5，称取2.0g胰蛋白酶溶于100mL蒸馏水中，将胰蛋白酶溶液及多糖溶液同时放入38℃水浴锅中预热12min，把两者充分混合(胰蛋白酶溶液的添加体积为多糖溶液体积的10％)，并振荡保持45min后放入105℃水浴灭酶12min，冷却至室温；然后加入0.2倍体积的氯仿和正丁醇混合液(氯仿:正丁醇(V：V)＝5:1)，剧烈震荡35min，再8500rpm离心12min，弃去蛋白层和有机溶液，回收上清液；此过程重复2次，收集上清液；即为去蛋白后的云芝胞外多糖提取液和云芝胞内多糖提取液；

(8)分别调节去蛋白后的云芝胞外多糖提取液和云芝胞内多糖提取液pH至8.5，然后滴加质量分数为30％的H₂O₂(100mL提取液加2mL的质量分数为30％的H₂O₂)，在55℃水浴保温3h，对其氧化脱色处理；然后将脱色后的提取液装入截留分子量为8000～15000Da的透析袋中以蒸馏水透析2d，每8h更换一次蒸馏水；最后，对透析完成后的溶液进行浓缩，并真空冷冻干燥，获得云芝胞内和胞外多糖提取物(IPCV和EPCV)。

云芝胞内和胞外多糖提取物，经苯酚硫酸法测定含总糖分别为67.66％和67.53％，经DNS比色法测定含还原糖分别为3.56％和4.23％，经考马斯亮兰法测定含蛋白分别为0.23％和0.27％。

实施例3

(1)云芝(C.versicolor)经斜面或平板菌种培养、液体振荡培养和液体深层发酵培养，得到菌丝体和发酵液，具体方法件如下：

①斜面或平板菌种培养：将活化后的云芝斜面母种菌丝块接入新的斜面固体培养基中，27℃培养15d，置于4℃保存备用；

②一级液体菌种培养：取200mL液体发酵培养基装入500mL三角瓶，在121℃灭菌20min，并接入5个黄豆大小的的云芝母种菌丝块；室温静置24h，待菌块伤口处愈合后在27℃，转速150rpm，避光恒温振荡培养6天，得到一级种子液；

③二级液体菌种培养：50L种子罐装入液体发酵培养基35L，125℃灭菌20min；冷却后接入2.45L培养好的一级种子液，培养温度为27℃，转速为150rpm，罐压为0.05～0.07MPa，通气量约1.5m³/h(V:V为1:0.6)培养3天，取样观察可发现到种子液清澈透亮，菌丝体丰富，大小均匀；

④液体深层发酵培养：将培养好的二级种子液转入500L发酵罐培养，初始培养条件温度，转速及罐压与种子罐相同，通气量约为12m³/h，培养3d；

(2)发酵产物4000rpm离心10min并真空抽滤分离菌丝体，获得澄清的发酵液和云芝菌丝体；发酵液经1万分子量PS超滤膜超滤去除小分子物质后，浓缩至20L，得到云芝超滤液，其中，超滤条件为：进膜压力约为10bar，通量3L/min，物料温度22℃；

(3)将云芝菌丝体于52℃的恒温箱烘干，粉碎，并过14目筛后，进行脱脂处理(菌丝体粉末与石油醚按体积比1:2混匀，于摇床振荡2.5d，脱去菌丝体粉中的脂质，离心后将粉末按上述步骤重复脱脂一次)；脱脂后的菌丝体粉末干燥备用，待进行多糖的提取；

(4)以料液比为1:30，提取时间为3h，提取温度为90℃，提取次数为1次的工艺参数热水浸提脱脂后的菌丝体得到含有云芝胞内多糖的浸提液；

(5)用旋转蒸发仪将将步骤(2)得到的云芝超滤液和步骤(4)得到的浸提液分别在58℃减压浓缩至原体积的1/10(尽量浓缩到水分极少的粘稠状态)，得到超滤浓缩液和浸提浓缩液；

(6)将步骤(5)制备得到的超滤浓缩液和浸提浓缩液分别加入5倍体积的乙醇，置于8℃冷藏1d，待析出粗多糖，离心得到沉淀；

(7)用100mL蒸馏水溶解沉淀，调节多糖溶液pH至8.0，称取2.0g胰蛋白酶溶于100mL蒸馏水中，将胰蛋白酶溶液及多糖溶液同时放入40℃水浴锅中预热15min，把两者充分混合(胰蛋白酶溶液的添加体积为多糖溶液体积的10％)，并振荡保持60min后放入110℃水浴灭酶15min，冷却至室温；然后加入0.2倍体积的氯仿和正丁醇混合液(氯仿:正丁醇(V：V)＝5:1)，剧烈震荡40min，然后8000rpm离心15min，弃去蛋白层和有机溶液，回收上清液；此过程重复1次，收集上清液；即为去蛋白后的云芝胞外多糖提取液和云芝胞内多糖提取液；

(8)分别调节去蛋白后的云芝胞外多糖提取液和云芝胞内多糖提取液pH至8.0，然后滴加质量分数为30％的H₂O₂(100mL提取液加2mL的质量分数为30％的H₂O₂)，在52℃水浴保温2.5h，对其氧化脱色处理；然后将脱色后的提取液装入截留分子量为8000～15000Da的透析袋中以蒸馏水透析3d，每10h更换一次蒸馏水；最后，对透析完成后的溶液进行浓缩，并真空冷冻干燥，获得云芝胞内和胞外多糖提取物(IPCV和EPCV)。

云芝胞内和胞外多糖提取物，经苯酚硫酸法测定含总糖分别为69.93％和68.16％，经DNS比色法测定含还原糖分别为3.88％和4.87％，经考马斯亮兰法测定含蛋白分别为0.33％和0.35％。

实施例4

(1)云芝胞内多糖颗粒冲剂的处方选择：

实施例1制备得到的云芝胞内多糖提取物与可溶性淀粉、糊精、β-环糊精和甜蜜素按比例混合搅匀，其中，每个处方添加质量百分比6.67％的云芝胞内多糖提取物，可溶性淀粉、糊精、β-环糊精和甜蜜素按表1中的质量比添加至总质量百分比为100％；用75％乙醇制软材，过100目筛，55℃干燥，得颗粒，再过100目筛后整粒，分装，制得云芝多糖颗粒冲剂；

表1 处方选择(质量比)

(2)云芝多糖颗粒冲剂制粒情况

表2 各处方的制粒情况

由表2可知，以β-环糊精为主要辅料做成的颗粒冲剂，粘性大，成型性差。而以糊精为主要辅料做成的颗粒冲剂，成型性好，适合制粒。

(3)粒度的考察

在按比例配制的颗粒冲剂样品中，粒度在14～80目之间占80％者，为成型性一般；粒度在14～60目之间占50％以上者，为成型性好(表3)。

表3 各处方的粒度情况

在同目数范围内，与处方①组比较，＊＊P<0.01.

由表3可知，处方①与处方③，处方④存在极显著性差异。数据表明，五个处方在14～60目之间的粒度都达到50％以上，成型性好。但是，处方①粒度不均，硬度大，在小于14目范围内比例达到40％，而其他处方粒度均匀，说明糊精在颗粒成型和粘合方面起到主要作用。在大于80目的范围内，处方③、处方④和处方⑤明显多于处方①，且这三个处方所得颗粒硬度适中，较易成型，说明淀粉在颗粒的粘合性方面起到一定的作用。

(4)休止角的考察

休止角用固定漏斗法来测定。将3只漏斗串联并固定于水平放置的坐标纸上适宜高度处,使漏斗下口距坐标纸的距离为H(0.5～1.5cm)，小心地将按比例配制的颗粒冲剂样品沿漏斗壁倒入最上面的漏斗中,直到最下面漏斗药粉的圆锥体尖端接触到漏斗口为止,此时由坐标纸测出圆锥体底部的直径R，计算出休止角(tgA＝2H/R)，每个处方测定3次。

表3 各处方的休止角情况

与处方一组比较，＊＊：P<0.01.

由表3可知，处方①和处方⑤的休止角偏大，其中处方③的休止角最小。从数据可以看出，适量的淀粉有降低休止角，减小摩擦力，促进流动性的作用，而淀粉过量反而会导致休止角增大。猜测可能是过量的淀粉导致颗粒的粘合增强。

(5)吸湿率的考察

将按比例配制的颗粒冲剂样品进行吸湿百分率的测定。将烧杯烘至恒重，冷却后准确称重，加入颗粒冲剂样品，使烧杯底部匀摊厚2mm左右的药粉，105度烘干5h，使其至恒重，取出，干燥器冷却，准确称量。将烘至恒重的颗粒瓶放在相对湿度78％，22℃的人工气候箱内，于1、2、3、5和15h定时称量。按下式计算吸湿百分率，每个处方平行做3份。

由图1可知，随着时间的增加，每个处方的吸收率逐渐上升。15h之后，处方②的吸收率最高，达到6％，而处方③的吸湿率最低，只有4.5％。说明淀粉对吸湿率有很大的影响。同时，处方④和处方⑤因为辅料的量多而吸湿率大，在同质量辅料中，对于吸湿率，淀粉影响最大，次之是β-环糊精。

(6)各项指标

按《中华人民共和国药典》1995年版附录颗粒剂项目的质量标准进行检测。

表4 指标情况

由表4可知，β-环糊精：糊精：可溶性淀粉：甜蜜素的比例按照1：4：1：0.04混合搅拌后，即云芝多糖提取物、β-环糊精、糊精、可溶性淀粉和甜蜜素的质量比优选为6.67：15.45：61.81：15.45:0.62；在外观，溶化性方面具有良好的效果，加入糊精的处方所制颗粒成型性好，溶解后无沉淀产生。

实施例5

一种云芝多糖颗粒冲剂的制备方法，取云芝多糖提取物0.43g(实施例1制备得到的云芝胞内多糖提取物)、β-环糊精4g、糊精1g、可溶性淀粉1g、甜蜜素0.02g混合搅匀，用体积分数为75％的乙醇制成软材，用14目筛粒，55℃干燥，得颗粒，再过14目筛后整粒，然后分装每袋5g，即得到云芝多糖颗粒冲剂，该颗粒冲剂淡黄色，易溶于水。

实施例6 云芝多糖颗粒冲剂降血脂的小鼠实验(低剂量颗粒冲剂)

本次实验所用小鼠是SPF级雄性昆明小鼠(20±2g)，购自广东省中医药大学实验动物中心，许可证号：SCXK(粤)2013-0020)；高脂饲料(配方为：10％猪油、1.0％胆固醇、0.3％胆盐、88.7％普通饲料)和普通饲料，购自广东省医学实验动物中心。

(1)SPF级昆明雄性小鼠分组及小鼠高脂血症模型的建立：正常对照组(NC)，高脂模型组(HFC)，辛伐他汀(10mg/kg bw·d)的阳性对照组(XZK)，云芝多糖颗粒冲剂低剂量组给药0.75g/kg.d(含多糖50mg/kg.d，实施例5制备得到的云芝多糖颗粒冲剂)，每组10只。所有处理组用普通饲料饲养一周(5g/只·天)，然后阳性对照组和实验组高脂饲料饲养，造模3天(4.5g/只·天)，正常对照组用普通饲料饲养3天。

(2)正式实验28天：除NC组喂食普通饲料外，其他各实验组用高脂饲料喂养，第一周5g/只·天，第二周5.5g/只·天，第三周6g/只·天，第四周6g/只·天，实验持续28d。每天8:00和18:00定时对实验处理组小鼠灌胃各药物2次，每只小鼠灌胃量均为0.5mL，正常对照组和高脂模型组灌胃等体积的蒸馏水。实验进行28d。实验期间每周称量一次体重，每日观察小鼠摄食，自主活动情况。

最后测定小鼠心脏，肝脏，脾脏和肾脏指数；4周后禁食12h，断头取血，分别测定小鼠血清总胆固醇(T C)、甘油三酯(TG)指标，根据各试剂盒说明书测定。

上述实验数据如表5、表6和图2所示：从表10可知，与高脂模型组相比，颗粒冲剂低剂量组，使高血脂症小鼠血清TC极显著降低10.24％。与高脂模型组比较，阳性药物使TC降低13.33％(P<0.01)。与阳性药物相比，云芝多糖颗粒冲剂表现出比辛伐他汀更佳的降低TC的效果，但差异不显著(P>0.05)。由表6可知，与高脂模型组比较，颗粒冲剂低剂量组可以明显降低肝指数(P<0.05)，这表明云芝胞内多糖颗粒冲剂，可减轻高血脂症小鼠肝脏指数，有效保护肝脏。与高脂模型组比较，颗粒冲剂低剂量组明显降低脾指数(P<0.05)，而各组的心指数和肾指数未发生显著变化(P>0.05)。

表5 云芝多糖颗粒冲剂对小鼠血清TC及TG水平的影响

注：与正常对照组相比#P<0.05，##P<0.01；与高脂模型组相比，*：P<0.05，**：P<0.01。

表6 云芝多糖颗粒冲剂对小鼠脏器指数的影响

注：与正常对照组相比#P<0.05，##P<0.01；与高脂模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。

实施例7 云芝多糖颗粒冲剂降血脂的小鼠实验(高剂量颗粒冲剂)

本次实验所用小鼠与高脂饲料同实施例6；

(1)SPF级昆明雄性小鼠分组及小鼠高脂血症模型的建立：正常对照组(NC)，高脂模型组(HFC)，辛伐他汀(10mg/kg bw·d)的阳性对照组(XZK)，云芝多糖颗粒冲剂高剂量组给药3g/kg.d冲剂(含多糖200mg/kg.d，，实施例5制备得到的云芝多糖颗粒冲剂)，每组10只。所有处理组用普通饲料饲养一周(5g/只·天)，然后阳性对照组和实验组高脂饲料饲养，造模3天(4.5g/只·天)，正常对照组用普通饲料饲养3天。

(2)正式实验28天：除NC组喂食普通饲料外，其他各实验组用高脂饲料喂养。实验期间定量给食，自由饮水，第一周5g/只·天，第二周5.5g/只·天，第三周6g/只·天，第四周6g/只·天，实验持续28d。每天8:00和18:00定时对实验处理组小鼠灌胃各药物2次，每只小鼠灌胃量均为0.5mL，正常对照组和高脂模型组灌胃等体积的蒸馏水。实验进行28d。实验期间每周称量一次体重，每日观察小鼠摄食，自主活动情况。

观察小鼠自主活动和体重变化，测定小鼠心脏，肝脏，脾脏和肾脏指数；4周后禁食12h，断头取血，分别测定小鼠血清总胆固醇(T C)、甘油三酯(TG)指标，根据各试剂盒说明书测定。

上述实验数据如表7、表8和图2所示：从表7可知，与高脂模型组相比，高剂量组使高血脂症小鼠血清TC极显著降低22.86％。与高脂模型组比较，阳性药物使TC降低13.33％(P<0.01)。与阳性药物相比，云芝多糖颗粒冲剂均表现出比辛伐他汀更佳的降低TC的效果，但差异不显著(P>0.05)。由表8可知，与高脂模型组比较，颗粒冲剂高剂量组和阳性对照组均极显著降低了肝指数水平(P<0.01)，降幅分别达到了7％和11％。这表明云芝多糖颗粒冲剂，可减轻高血脂症小鼠肝脏指数，有效保护肝脏。

表7 云芝多糖颗粒冲剂对小鼠血清TC及TG水平的影响

注：与正常对照组相比#P<0.05，##P<0.01；与高脂模型组相比，*：P<0.05，**：P<0.01。

表8 云芝多糖颗粒冲剂对小鼠脏器指数的影响

注：与正常对照组相比#P<0.05，##P<0.01；与高脂模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。

综上分析，云芝多糖颗粒冲剂在3g/kg.d(含多糖200mg/kg.d)降低TG的效果最好；云芝多糖颗粒冲剂，可有效降低高脂血症小鼠的肝指数，起到保护肝脏的作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种云芝多糖颗粒冲剂在制备降血脂药物或保健食品中的应用，其特征在于，所述的云芝多糖颗粒冲剂包含如下按质量百分比计的组分：

所述的云芝多糖提取物由如下方法制备得到：

(1)云芝(Coriolus versicolor)液体深层发酵后，分离得到云芝菌丝体和发酵液，其中，云芝菌丝体干燥粉碎并过筛后脱脂，干燥，得到脱脂后的菌丝体；发酵液超滤去除小分子物质，得到云芝超滤液；

(2)热水浸提脱脂后的菌丝体，得到含云芝胞内多糖的浸提液；

(3)将步骤(1)得到的云芝超滤液和步骤(2)得到的浸提液分别浓缩，得到超滤浓缩液和浸提浓缩液；

(4)步骤(3)制备得到的超滤浓缩液和浸提浓缩液分别加入乙醇沉降多糖，待析出粗多糖，离心得到沉淀；

(5)用水分别溶解步骤(4)制得的沉淀，并调节多糖溶液pH至7.5～8.5，采用胰蛋白酶和Sevage法去蛋白，分别得到去蛋白后的胞外多糖提取液和胞内多糖提取液；

(6)分别调节步骤(5)中制得的去蛋白后的胞外多糖提取液和胞内多糖提取液pH至7.5～8.0，滴加质量分数为30％的H₂O₂，在50～55℃水浴保温2～3h，对其进行氧化脱色处理；将脱色后的胞外多糖提取液和胞内多糖提取液装入截留分子量为8000～15000Da的透析袋中以蒸馏水透析2～3d，每8～10h更换一次蒸馏水；对透析完成后的溶液进行浓缩，并真空冷冻干燥，分别制得云芝胞外多糖提取物和云芝胞内多糖提取物；

步骤(1)中所述的云芝(Coriolus versicolor)液体深层发酵的方法，包含如下步骤：

(Ⅰ)将云芝斜面母种活化培养后转接至斜面固体培养基中，24～27℃培养10～15d，直至菌丝铺满斜面为止，得到云芝斜面菌种；

(Ⅱ)从步骤(Ⅰ)制备得到的云芝斜面菌种上挑取4～6菌块，接种至200mL的液体发酵培养基中，室温静置24h，待菌块伤口处愈合后，在150rpm，27℃的条件下振荡培养6d，制得一级种子液；

(Ⅲ)将步骤(Ⅱ)制备得到的一级种子液转入50L种子罐培养二级种子液，接种量为7％，培养温度为27℃，转速为150rpm，罐压为0.05～0.07MPa，通气量1.5m³/h，培养3d后转入500L发酵罐培养，初始培养条件温度，转速及罐压与种子罐相同，通气量为12m³/h，培养3～5d；

步骤(Ⅱ)和(Ⅲ)中用于一级种子液和二级种子液培养以及发酵培养的培养基配方为：葡萄糖50g，NH₄NO₃ 2g，KH₂PO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 1g，维生素B₁ 0.05g，水1000mL，pH 6.5；

所述的云芝多糖颗粒冲剂的使用剂量为2998.5mg/kg·d。

2.根据权利要求1所述的云芝多糖颗粒冲剂在制备降血脂药物或保健食品中的应用，其特征在于，所述的云芝多糖颗粒冲剂包含如下按质量百分比计的组分：

3.根据权利要求1所述的云芝多糖颗粒冲剂在制备降血脂药物或保健食品中的应用，其特征在于：

步骤(5)中所述的胰蛋白酶和Sevage法，包含如下步骤：

①将胰蛋白酶加入多糖溶液中充分混合并37℃～40℃振荡30～60min，再水浴灭酶10～15min，冷却至室温；

②加入0.2倍体积的氯仿正丁醇混合液，剧烈振荡30～40min；然后离心，弃取蛋白层及有机溶液，回收上清液；

③重复步骤②2～3次，得到去蛋白后的多糖提取液。

4.根据权利要求1～3任一项所述的云芝多糖颗粒冲剂在制备降血脂药物或保健食品中的应用，其特征在于，所述的云芝多糖颗粒冲剂的制备方法包含如下步骤：

将权利要求1～3任一项所述的云芝多糖颗粒冲剂的组分混合搅匀；用乙醇制成软材；过筛，干燥，过筛整粒，制得云芝多糖颗粒冲剂。

5.根据权利要求4所述的云芝多糖颗粒冲剂在制备降血脂药物或保健食品中的应用，其特征在于：

所述的乙醇的体积分数为60％～80％。

6.根据权利要求4所述的云芝多糖颗粒冲剂在制备降血脂药物或保健食品中的应用，其特征在于：

所述的过筛是过14～40目筛。

7.根据权利要求4所述的云芝多糖颗粒冲剂在制备降血脂药物或保健食品中的应用，其特征在于：

所述的干燥温度为55～60℃。