CN115894728B - 一种米邦塔仙人掌多糖map-2和制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种米邦塔仙人掌多糖MAP‑2，所述米邦塔仙人掌多糖MAP‑2的单糖组成为葡萄糖醛酸GlcA、葡萄糖Glc、木糖Xyl、阿拉伯糖Ara和半乳糖醛酸GalA，其摩尔比是2.889±1％:12.910±1％:4.546±1％:6.807±1％:1.604±1％，还公开了其制备方法和应用。米邦塔仙人掌多糖MAP‑2在抗糖尿病药物制备中的用途为首次发现，其对α‑淀粉酶和α‑葡萄糖苷酶活性表现出了较好的抑制作用，具有良好的降糖活性，且整体抑制能力均强于阿卡波糖，还能避免阿卡波糖引起的不良反应，因此，在治疗糖尿病方面是一种更安全和更有效的药物，也为米邦塔仙人掌提供了一个新的产业开发和应用方向。
Description
技术领域
本发明属于植物提取物的应用技术领域，具体涉及一种米邦塔仙人掌多糖MAP-2和制备方法及其应用。
背景技术
植物多糖是一类广泛存在于植物体内的天然聚合物，具有多种生物活性，如：免疫调剂、抗氧化、抗病毒、降血糖、降血脂等。近年来，因其优秀的生物活性和良好的安全性已成为研究热点。
米邦塔仙人掌(Opuntia Milpa Alta)属仙人掌科，广泛生长在热带及亚热带地区，这种植物兼具食用和药用双重功能，在食品和医药领域得到了广泛应用。如：米邦塔仙人掌中膳食纤维含量高，常食用米邦塔仙人掌，不仅可以吸收其中的钾、铁、锶等矿物质和维生素，还可食入大量的乳酸菌及乳酸产物。而中医理论认为，米邦塔仙人掌具有清热解毒、镇痛的功效，民间常用于十二指肠溃疡、腮腺炎及由于注射引起的感染等。此外，研究发现，米邦塔仙人掌中富含多糖、多酚、黄酮和生物碱等活性物质，近年来，Opuntia Milpa中多糖物质的研究引起了学者们的极大关注。如：采用热水法获取仙人掌中的多糖，结果表明，仙人掌多糖主要由Man、Rha、Xyl、Ara、GlcA、Rib、Glc七种单糖组成，且具有良好的神经保护作用。(Zhao longyan)通过超声提取仙人掌中的多糖类物质，结果显示，多糖包含Rha、Ara、GlcA、Glc、AraA五种单糖，且可通过提高抗氧化水平来治疗高脂血症相关疾病。但是，迄今为止，系统性阐述不同提取方法对米邦塔仙人掌多糖(Opuntia Milpa Altapolysaccharide，MAP)的理化性质、结构特征及生物活性的影响未见报道。
发明内容
本发明提供米邦塔仙人掌多糖MAP-2在制备抗糖尿病药物中的应用，其首次被发现具有抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的作用，作为天然提取物，高效、安全，原料丰富易得。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种米邦塔仙人掌多糖MAP-2，所述米邦塔仙人掌多糖MAP-2的单糖组成为葡萄糖醛酸GlcA、葡萄糖Glc、木糖Xyl、阿拉伯糖Ara和半乳糖醛酸GalA，其摩尔比是2.889±1％:12.910±1％:4.546±1％:6.807±1％:1.604±1％。
前述米邦塔仙人掌多糖MAP-2的制备方法，包括如下步骤：
将米邦塔仙人掌粉碎、清洗后过滤得滤渣，减压烘干；采用96℃热水浸提，提取米邦塔仙人掌多糖；脱去蛋白和小分子物质后，以95％乙醇溶液醇沉，沉淀冷冻干燥，即得米邦塔仙人掌多糖MAP-2。
前述米邦塔仙人掌多糖MAP-2的制备方法，具体如下：
(1)米邦塔仙人掌粉碎、清洗：取新鲜米邦塔仙人掌，去皮，用粉碎机榨成泥浆，以g/mL1:2比例加入60-90℃石油醚为溶剂，65℃水浴回流提取2h，滤过，弃去滤液，重复操作2次，滤渣再次使用石油醚清洗2次，65℃减压烘干滤渣，得滤渣Ⅰ；
(2)米邦塔仙人掌分离滤渣：取药渣I，以g/mL 1:3比例向其加入蒸馏水，室温18℃浸提2h，离心分离滤渣和滤液，滤液减压浓缩至原体积的1/5，得滤渣A；
(3)米邦塔仙人掌多糖提取：采用热水浸提法，步骤(2)滤渣A采用96℃沸水浸提2h，料液比为1:4，收集滤液并减压浓缩，得米邦塔仙人掌多糖浓缩液；
(4)米邦塔仙人掌多糖脱蛋白和小分子物质：步骤(3)所得多糖浓缩液通过1mol·L-1的HCl溶液和1mol·L-1的NaOH溶液调节pH至6，以g/mL 3:100比例加入木瓜蛋白酶，50℃水浴反应45min，4000r·min-1离心10min，弃去沉淀，上清液中以体积比1:1加入3％三氯乙酸溶液，室温静置20min，4000r·min-1，10min离心舍弃沉淀，滤液减压浓缩至原体积的20％±1％，然后调节其pH值为6，在保持木瓜蛋白酶用量和反应温度不变的情况下，上清液与三氯乙酸溶液的体积比变成1:1/2，离心弃去沉淀，收集上清液，通过分子量为8000-14000的透析袋除去上清液中的小分子物质，时长为24h，浓缩目标液；
(5)醇沉：步骤(4)所得目标液以体积比1:4加入95％乙醇溶液醇沉，沉淀冷冻干燥后即得米邦塔仙人掌多糖MAP-2。
前述米邦塔仙人掌多糖MAP-2在制备抗糖尿病药物中的应用。
前述米邦塔仙人掌多糖MAP-2的应用，所述糖尿病为Ⅱ型糖尿病。
前述米邦塔仙人掌多糖MAP-2的应用，所述米邦塔仙人掌多糖MAP-2在制备α-淀粉酶和/或α-葡萄糖苷酶活性抑制药物中的作用。
本发明重点研究了米邦塔仙人掌多糖MAP-2对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，并研究了其化学结构、单糖组成、抑制多种类自由基能力和人体应用安全性，为寻找安全有效的抗糖尿病化合物提供了数据支持。
提取方法在天然多糖研究中起着重要作用，不同的提取方法会对多糖的得率、所获得多糖的单糖组成、化学结构与生物活性产生重要影响。例如：采用热水法、加压水提法和微波萃取法3种方法对秋葵中的多糖类物质进行提取，并获得OPP-W、0PP-P、OPP-M三种多糖，其提取率相似，但分子量存在显著性差异，OPP-W(6.597×106Da)和0PP-P(6.396×106Da)相似，OPP-W显著低于OPP-M(5.859×106Da)，生物活性实验结果表明，OPP-M和OPP-P具有良好的抗氧化活性，OPP-W和OPP-P的降血糖活性明显高于OPP-W。通过冷水浸提(CWE)、热水浸提(HWE)、温水浸提(WWE)和超声辅助法(UAE)4种提取方法从山药中获得四种山药多糖，结果显示，HWE具有最高得率(5.19％)和最大分子量(1076.4kDa)，而CWE糖醛酸含量(32.15％)最高，且抗氧化能力较强。由此可见，提取方法会对多糖的提取效率、结构特征以及生物活性产生显著性影响。因此，对植物多糖提取时，应充分考虑生物活性与提取方法选择的适应性。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了米邦塔仙人掌多糖MAP-2、其制备方法及在制备抗糖尿病药物中的应用。米邦塔仙人掌多糖MAP-2在抗糖尿病药物中的用途为首次发现，其对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性表现出了较好的抑制作用，且具有明显的量效关系和时间依赖性。MAP-2的α-葡萄糖苷酶抑制活性高于它们的α-淀粉酶抑制活性，适当的α-淀粉酶抑制活性和较高的a-葡萄糖苷酶抑制活性时解决和降低餐后高血糖水平的有效途径，且整体抑制能力均强于阿卡波糖。MAP-2不仅具有良好的降糖活性，也能避免阿卡波糖引起的不良反应，因此，在治疗Ⅱ型糖尿病方面是一种更安全和更有效的药物。而且米邦塔仙人掌多糖MAP-2作为天然提取物，原料丰富易得，为安全、低毒、高效的抗糖尿病药物的开发与应用奠定了基础。本发明也为米邦塔仙人掌提供了一个新的产业开发和应用方向。
附图说明
图1是米邦塔仙人掌多糖测定总糖含量、蛋白质含量和糖醛酸的测定标准曲线；其中A：总糖含量；B：蛋白质含量；C：糖醛酸；D：MAP-3测定标准曲线；
图2是米邦塔仙人掌多糖MAPs红外扫描结果；
图3是米邦塔仙人掌多糖三螺旋结构图；
图4是米邦塔仙人掌多糖单糖组成的HPLC分析图谱，其中A:MAP-1,B:MAP-2,C:MAP-3,D:MAP-4,E:MAP-5,F:MAP-6；
图5是米邦塔仙人掌多糖MAP-1～MAP-6的1H-NMR谱和13C-NMR谱，，其中A:1H-NMR谱,B:13C-NMR谱；
图6是米邦塔仙人掌多糖MAP-1～MAP-6对α-葡萄糖苷酶的抑制率，其中A:MAP-1,MAP-2和MAP-3,B:MAP-4,MAP-5和MAP-6；
图7是米邦塔仙人掌多糖MAP-1和MAP-6对α-淀粉酶的抑制率，其中A:MAP-1,MAP-2和MAP-3,B:MAP-4,MAP-5和MAP-6；
图8是米邦塔仙人掌多糖MAP-1～MAP-6对ABTS自由基的清除率，其中A:MAP-1,MAP-2和MAP-3,B:MAP-4,MAP-5和MAP-6；
图9是米邦塔仙人掌多糖MAP-1～MAP-6对DPPH自由基的清除率，其中A:MAP-1,MAP-2和MAP-3,B:MAP-4,MAP-5和MAP-6；
图10是米邦塔仙人掌多糖MAP-1～MAP-6对羟自由基的清除率，其中A:MAP-1,MAP-2和MAP-3,B:MAP-4,MAP-5和MAP-6；
图11是米邦塔仙人掌多糖MAP-1～MAP-6对透明质酸酶的抑制率，其中A:MAP-1,MAP-2和MAP-3,B:MAP-4,MAP-5和MAP-6；
图12是米邦塔仙人掌多糖MAP-1～MAP-6对乙醇脱氢酶的激活(抑制)率。
具体实施方式
实施例1：米邦塔仙人掌多糖MAP-2的制备：
将米邦塔仙人掌粉碎、清洗后过滤得滤渣，减压烘干；采用96℃热水浸提，提取米邦塔仙人掌多糖；脱去蛋白和小分子物质后，以95％乙醇溶液醇沉，沉淀冷冻干燥，即得米邦塔仙人掌多糖MAP-2。所得米邦塔仙人掌多糖MAP-2的单糖组成为葡萄糖醛酸GlcA、葡萄糖Glc、木糖Xyl、阿拉伯糖Ara和半乳糖醛酸GalA，其比例是2.889:12.910:4.546:6.807:1.604。
实施例2：米邦塔仙人掌多糖MAP-2的制备，具体包括以下步骤：
(1)米邦塔仙人掌粉碎、清洗：取12.0kg新鲜的米邦塔仙人掌，去皮，用粉碎机榨成泥浆，以g/mL 1:2比例加入60-90℃石油醚为溶剂，65℃水浴回流提取2h，滤过，弃去滤液，重复操作2次，滤渣再次使用石油醚清洗2次，65℃减压烘干滤渣，得滤渣Ⅰ；
(2)米邦塔仙人掌分离滤渣：取3.0kg滤渣I，以g/mL 1:3比例向其加入蒸馏水，室温18℃浸提2h，离心分离滤渣和滤液，滤液减压浓缩至原体积的1/5，得滤渣A；
(3)米邦塔仙人掌多糖提取：采用热水浸提法，步骤(2)滤渣A采用96℃沸水浸提2h，料液比为1:4，收集滤液并减压浓缩，得米邦塔仙人掌多糖浓缩液；
(4)米邦塔仙人掌多糖脱蛋白和小分子物质：步骤(3)所得多糖浓缩液通过1mol·L-1的HCl溶液和1mol·L-1的NaOH溶液调节pH至6，以g/mL 3:100比例加入木瓜蛋白酶，50℃水浴反应45min，4000r·min-1离心10min，弃去沉淀，上清液中以体积比1:1加入3％三氯乙酸溶液，室温静置20min，4000r·min-1，10min离心舍弃沉淀，滤液减压浓缩至原体积的20％±1％，然后调节其pH值为6，在保持木瓜蛋白酶用量和反应温度不变的情况下，上清液与三氯乙酸溶液的体积比变成1:1/2，离心弃去沉淀，收集上清液，通过分子量为8000-14000的透析袋除去上清液中的小分子物质，时长为24h，浓缩目标液；
(5)醇沉：步骤(4)所得目标液以体积比1:4加入95％乙醇溶液醇沉，沉淀冷冻干燥后即得米邦塔仙人掌多糖MAP-2。所得米邦塔仙人掌多糖MAP-2的单糖组成为葡萄糖醛酸GlcA、葡萄糖Glc、木糖Xyl、阿拉伯糖Ara和半乳糖醛酸GalA，其比例是2.889:12.910:4.546:6.807:1.604。
实施例3：实施例1-2所得米邦塔仙人掌多糖MAP-2在制备抗糖尿病药物中的应用。
实验例：
采用冷水浸提、96℃热水浸提、50％乙醇超声浸提、25％乙醇超声浸提、水超声浸提和80℃热水浸提6种不同的提取方式对米邦塔仙人掌中的多糖类物质进行提取，经纯化后获得了相应的多糖组分(MAP-1～MAP-6)。多糖得率和化学组成结果表明，MAP-6的得率最高，且多糖含量可高达96.45±0.45％，MAP-5的糖醛酸含量最高，是MAP-1的2.4倍。单糖组成方面，MAP-1～MAP-6主要包含Glc、GlcA、Xyl、GalA、Ara五种单糖，但不同组分的单糖组成比例具有显著性差异。FT-IR分析显示，MAP-1～MAP-6都具有α-构型和β-构型。
单糖是决定多糖独特性质和结构的基本单元，而受提取方法的影响，单糖组成的不同，可能会导致多糖化学结构和生物活性存在潜在差异。本研究通过PMP柱前衍生化法发现，不同提取方法得到的MAP单糖组成有一定的差异，结果如图4所示。
主要缩写符号说明
| 英文缩写 | 英文全称 | 中文 |
| MAP-1 | Opuntia Milpa Alta MAP-1 | 米邦塔仙人掌多糖MAP-1 |
| MAP-2 | Opuntia Milpa Alta MAP-2 | 米邦塔仙人掌多糖MAP-2 |
| MAP-3 | Opuntia Milpa Alta MAP-3 | 米邦塔仙人掌多糖MAP-3 |
| MAP-4 | Opuntia Milpa Alta MAP-4 | 米邦塔仙人掌多糖MAP-4 |
| MAP-5 | Opuntia Milpa Alta MAP-5 | 米邦塔仙人掌多糖MAP-5 |
| MAP-6 | Opuntia Milpa Alta MAP-6 | 米邦塔仙人掌多糖MAP-6 |
| Arb | Arabinose | 阿拉伯糖 |
| Man | Mannose | 甘露糖 |
| Rha | rhamnose | 鼠李糖 |
| Glc | glucose | 葡萄糖 |
| Xyl | Xylose | 木糖 |
| GalA | Galacturonic acid | 半乳糖醛酸 |
| GlcA | Glucuronic acid | 葡萄糖醛酸 |
一、米邦塔仙人掌多糖MAP-2成分的研究
以葡萄糖为对照品，采用苯酚-硫酸法测定MAP-1～MAP-6中的多糖含量。移取0.4mL MAP-1～MAP-6溶液于试管中，加蒸馏水补充至0.5mL，混匀，分别加入0.3mL 6％的苯酚溶液后迅速加入1.5mL浓硫酸，立即摇匀，然后，置沸水浴中加热30min，取出自然冷却至室温后，在波长为490nm处测定A490值，计算米邦塔仙人掌总糖含量。以牛血清蛋白为标准，考马斯亮蓝G-250法测定不同MAP蛋白质含量，取200μL 0.1mg·mL-1仙人掌多糖溶液于试管中，加入1mL考马斯亮蓝G-250溶液，避光放置10min，立即于595nm处测定A595值，计算仙人掌多糖中蛋白质的含量。以葡萄糖醛酸为对照，采用咔唑-硫酸法测定其糖醛酸含量，稍有改动。取200μL 0.1mg·mL-1仙人掌多糖样品溶液，冰水浴中加入5mL四硼酸钠-硫酸溶液，涡旋混合器混匀，沸水浴20min，取出后立即冷却至室温，加0.15％咔唑溶液0.2mL，摇匀，室温反应2h，于523nm处测定A523值。计算其含量。此外，通过定性分析的手段，利用碘化铋钾试剂法和福林酚法分析MAP-1～MAP-6中的生物碱和多酚物质。
1.1米邦塔仙人掌多糖的单糖组成
采用PMP柱前衍生化高效液相色谱法分析MAP-1～MAP-6的单糖组成。将10mg MAP-1～MAP-6样品溶于2mL的2mol·L-1H2SO4，密封后于100℃水浴中水解8h，然后冷却至室温，通过4mol·L-1NaOH调节pH值至7，蒸馏水稀释至8mL后离心(1500r·min-1，5min)，收集上清液，即获得各MAP的酸水解样品，低温保存备用。准确称取各单糖标准品(Fuc、Gal、GalA、Glc、GlcA、Man、Xyl、Rha、Ara)5mg，溶解于10mL蒸馏水中，移取1mL样品溶液和对照品溶液于试管中，然后依次分别加入1mL 0.5mol·mL-1PMP与1mL 0.3mol·L-1NaOH溶液，75℃水浴1.5h，反应完成后冷却至室温，分别加入1mL0.3mol·L-1的盐酸后，再加入1.5mL蒸馏水进行稀释。最后，加入5mL CHCl3去除多余的PMP，离心(1500r·min-1，5min)，收集上清，即得到MAP的衍生样品和对照品溶液，溶液用0.45mm的滤膜过滤用于HPLC分析。
所有样品均采用Agilent 1260高效液相色谱系统(Agilent Technologies,USA)检测。以PBS(A,0.1mol·mL-1，pH6.8)和乙腈(B)的混合物为流动相，柱温30℃，流速1mL·min-1，经过ZORBOX SB-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5mm)梯度洗脱，洗脱条件如表1所示，于波长245nm的紫外检测器下进行检测。
表1米邦塔仙人掌多糖单糖组成的梯度洗脱法
1.2 UV-Vis和FT-IR光谱分析
取200μL 0.1mg·mL-1的MAP-1，MAP-2，MAP-3，MAP-4，MAP-5，MAP-6多糖溶液，于200-400nm范围内进行紫外-可见扫描。称取1-2mg MAP样品置于玛瑙研钵中，加入150-200mg干燥的KBr晶体，研磨均匀后压片，在4000-400cm-1范围测定MAP的FT-IR谱图。
1.3核磁共振(NMR)分析
将15-20mg MAP样品溶解于99.9％D2O中，并使用Varian INOVA 400MHz核磁共振波谱仪测定样品的1H-NMR和13C-NMR。
1.4三螺旋结构分析
取10mg刚果红燃料，溶液100mL蒸馏水中。然后，将1mL MAP溶液与1mL刚果红溶液混合摇匀，然后加入一定体积2mol·L-1的NaOH溶液，使溶液中NaOH终浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol·L-1，室温放置20min后，采用SpectraMax Plus 384在300-700nm范围内进行扫描，记录不同NaOH浓度下的最大吸收波长，以蒸馏水代替样品作为对照。最后，以NaOH浓度(mol·L-1)为横坐标，最大吸收波长为纵坐标作图。
1.5体外抗高血糖活性测定
1.5.1α-葡萄糖苷酶抑制活性
向96孔板中分别加入50μL不同浓度的(0.5、1、2、4、8、16mg·mL-1)MAP样品溶液，25μL 0.1U·mL-1α-葡萄糖苷酶(由0.1mol·L-1，pH6.8的PBS溶液配制)，37℃孵育10min后，迅速加入25μL 1.5mmol·L-1PNPG(由0.1mol·L-1，pH 6.8的PBS溶液配制)，37℃孵育30min，最后，加入100μL 0.2mol·L-1Na2CO3终止反应，于405nm处测A405值。
式中:
A1为样品(阿卡波糖)与α-葡萄糖苷酶的吸光度
A2为PBS代替α-葡萄糖苷酶的吸光度
A0为空白对照(PBS代替样品)
1.5.2α-淀粉酶抑制活性
向试管中依次加入100μL不同浓度(0.5、1、2、4、8、16mg·mL-1)的MAP样品溶液，100μL 0.5mg·mL-1α-淀粉酶(由0.1mol·L-1，pH6.8的PBS溶液配制)，37℃水浴反应10min；然后加入200μL 1％可溶性淀粉，37℃水浴反应10min后，转移至100℃水浴10min，加入100μLDNS终止反应，冷却至室温，加入4mL蒸馏水稀释，于540nm处测A540值。
式中:
A1为样品(阿卡波糖)与α-淀粉酶的吸光度
A2为PBS代替α-淀粉酶的吸光度
A0为空白对照(PBS代替样品)
1.6体外抗氧化活性测定
1.6.1 2,20-叠氮基-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)自由基清除活性
以VC作阳性对照，精密称取38.90mg(精确到0.00001g)ABTS和15.16mg过硫酸钾，转移至10m L，定容，按1:1混合后于4℃避光反应12～16h，形成ABTS储备液。使用前用水稀释，使其在734nm处的吸光度值为0.7±0.02。将不同浓度(0.5、1、2、4、8、16mg·mL-1)的MAP样品溶液或抗坏血酸溶液(VC)以体积比为1:1加入ABTS储备液，混合均匀，室温避光反应15min，以水作为空白，734nm处测A734值，平行三份。数据按以下公式计算ABTS自由基清除率。
式中：
Ai为MAP/VC溶液与ABTS溶液反应的吸光度值；
Aj为水与MAP/VC溶液的吸光度值；
A0为水与ABTS溶液的吸光度值。
1.6.2 2,2-二苯基-1-吡啶酰肼(DPPH)自由基清除活性
精密称取11.70mg(精确到0.00001g)DPPH，用甲醇溶解后转移至100mL棕色容量瓶，定容，避光保存。将不同浓度(0.5、1、2、4、8、16mg·mL-1)的MAP样品溶液和VC分别以体积比为1:1加入配置好的DPPH溶液，混合均匀，室温避光反应30min，以甲醇作空白，517nm处测A517值，平行三份，数据按公式计算DPPH自由基清除率。
式中：
Ai为MAP/VC溶液与DPPH溶液反应的吸光度值；
Aj为甲醇与MAP/VC溶液的吸光度值；
A0为甲醇与DPPH溶液的吸光度值。
1.6.3羟基自由基清除活性
分别取9.0mmol·L-1水杨酸-乙醇溶液，9.0mmol·L-1硫酸亚铁溶液，不同浓度(0.5、1、2、4、8、16mg·mL-1)的MAP溶液以及8.8mmol·L-1的H2O2溶液各2mL于具塞试管中,混匀后在37℃条件下反应30min，反应结束后于510nm处测吸光度值。同时分别以VC和蒸馏水为阳性和空白对照，按照前述相同的处理方法进行样品处理，并测定510nm处的吸光度值。按下列公式进行抑制率的计算。
式中：
Ai为MAP/VC和羟自由基的吸光度；
Aj为不含羟自由基的MAP/VC溶液吸光度；
A0为蒸馏水和羟自由基的吸光度。
1.7体外抗过敏
用于MAPs的vitro anti-allergy活性测试，主要流程为：分别取100μL不同浓度(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0mg·mL-1)的MAP样品溶液和100μL 1mg·mL-1的透明质酸酶于具塞试管中，混匀；再用乙酸-乙酸钠缓冲液(0.2mol·L-1)定容至0.9mL，摇匀，置于37℃的水浴中反应15min，再次加入100μL透明质酸钠溶液(3.44mg·mL-1)后，于37℃恒温条件下反应10min；反应结束后加入4mL 2.5％CTAB(溶于2％NaOH溶液)，常温静置15min后于405nm处测定吸光度值，并按以下公式计算抑制率。
式中：
A1为多糖MAP和透明质酸酶的吸光度；
A2为不含透明质酸酶的MAP溶液吸光度；
A0为蒸馏水和透明质酸酶的吸光度。
1.8体外治疗
采用改性的Valle&Hoch法测定MAP对乙醇脱氢酶活性。简要地，向96孔板中分别加入100μL焦磷酸钠缓冲液(pH8.8)，70μL 2mmol·L-1NAD+溶液，35μL 2mol·L-1乙醇溶液，20μL不同浓度(0.5、1、2、4、8、16mg·mL-1)的MAP样品溶液，35℃孵育5min，迅速加入20μL0.15U·mL-1ADH溶液后，立即在340nm处测定吸光度值，每隔10s读数一次，连续测定5min。以H2O代替MAP样品作空白对照，按照前述相同的方法处理样品并测定响应的吸光度值。
以A340对时间作图，取反应初始时线性部分，计算A340·min-1的增加值，根据NADH在340nm处的摩尔消光系数为6.20，计算酶活力。ADH的活性以每分钟NADH生成的纳摩尔数表示，计算公式如下。
注：其中△A340是平均每分钟的吸光度变化值。
1.9统计分析
所有数据平均测定3次，以均数±标准差表示，并进行单因素方差分析(ANOVA)。所有计算均使用统计软件进行。
2.结果和讨论
2.1 MAP的理化特性
2.1.1 MAP的产率和化学组成
多糖在水和低浓度的乙醇溶液中具有较好的溶解性和较强的生物活性。因此，本发明采用6种不同方法对MAP进行提取，并获得相应的多糖组分MPA-1～MAP-6，其得率分别为5.16％、4.99％、3.70％、3.43％、2.91％和25.83％。采用热水法提取MAPs，其得率为0.694％，可能受药材来源的影响，以米邦塔仙人掌湿重计算其多糖得率的情况下，MAP-6的得率是MAPs的1.3倍。此外，通过硫酸-苯酚法、考马斯亮蓝G-250法、咔唑-硫酸法和定性的手段对MAP-1～MAP-6的总糖含量、蛋白质含量、糖醛酸含量及其他成分进行分析测定，结果见图1(A、B和C)和表2，数据结果表明，提取方法不同，MAP基本成分存在差异，尤其是糖醛酸含量差异较显著，如，MAP-5中糖醛酸含量最高(15.17％)，是MAP-1的2.4倍，然而，定性结果显示，MAP-1～MAP-6中都不含多酚、氨基酸、生物碱等物质。通过紫外-可见光谱分析，发现MAP-1～MAP-6的谱图大致相似，因此，仅选取MAP-3为例，结果如图1D所示，在波长260nm处无吸收峰，而280nm处有较弱的吸收峰，说明含少量蛋白质，不含多肽、氨基酸物质，与酶联免疫法测定结果一致，见表2。
表2 MAP-1～MAP-6基本成分和提取率
数值表示为平均值±标准差(n＝3)，以MAP-5为对照，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
2.1.2 MAP的单糖组成
单糖是决定多糖独特性质和结构的基本单元，而受提取方法的影响，单糖组成的不同，可能会导致多糖化学结构和生物活性存在潜在差异。本发明通过PMP柱前衍生化法发现，不同提取方法得到的MAP单糖组成有一定的差异，结果如图4所示，MAP-1和MAP-6主要包含GlcA、Glc、Xyl、Ara四种单糖，单糖比例分别为1.830:17.234:2.438:3.383和0.878:30.397:1.408:1.817；而MAP-2、MAP-3、MAP-4、MAP-5主要由GlcA、Glc、Xyl、Ara、GalA五种单糖组成，其比例分别是2.889:12.910:4.546:6.807:1.604、1.976:14.850:2.913:4.067:1.344、2.210:13.807:3.766:5.214:1.667和2.529:9.285:3.642:4.868:1.483。此外，单糖含量结果表明，Glc和Ara是MAP中主要的单糖，且MAP-6中的Glc是MAP-5的3.3倍，本发明MAP-2中Ara的含量是MAP-6的3.7倍，而这一结论与采用热水法提取的MAPs的单糖组成结果相似，Ara含量都较高，这说明提取方法不同，MAP的单糖组成类型相似，但单糖含量的差异较大，而这一差异也可能是导致其化学结构和生物活性不同的关键因素。
2.2 MAP的结构特征
2.2.1 FT-IR光谱分析FT–IR
红外光谱具有较高的特征性，可用于分析和确定样品中某些特定的官能团，在多糖的研究中，红外光谱还可以区分呋喃、吡喃及某些糖苷键的类型。图2是MAP-1～MAP-6的红外扫描结果，不同提取方法得到的FT-IR谱图相似。其中，3429cm-1附近较强的吸收峰是O-H的伸缩振动，2927cm-1附近的吸收是C-H的伸缩振动，说明可能含有-CH2或-CH3基团。而1724cm-1附近的吸收峰被认为是羧基(-COOH)产物的振动，证明MAP-1～MAP-6是酸性多糖，但MAP-1此处吸收不强，其多糖可能偏中性。此外，1641cm-1处的吸收是羰基(C＝O)的伸缩振动，被用来判断多糖中是否含糖醛酸，而MAP-1～MAP-6在此处都有较强的吸收，尤其是MAP-5，说明该多糖中糖醛酸含量较高，这也与基本成分测定结果相吻合。1546cm-1附近较弱的吸收可能是N-H的伸缩振动，证明MAP-1～MAP-6中都有蛋白质，且含量较少，1248cm-1是氧桥(O-O)的振动，1080cm-1附近的吸收峰是C-O的伸缩振动峰，1155cm-1和1024cm-1附近是C-O-C不对称拉伸振动，说明MAP-1～MAP-6具有吡喃型糖苷键。此外，MAP-6在935cm-1处有较弱的吸收，可能是由α-D-吡喃葡萄糖结构所引起的。800～900cm-1范围内的吸收峰被认为是由α-构型和β-构型所引起的，而MAP-1～MAP-6在此处都有不同程度的吸收，说明六种MAP中的α-构型和β-构型可能以不同比例存在。
2.2.2核磁共振分析
通过NMR分析可判断多糖结构中的糖残基数目、糖环构型、异头构型及连接位置等。1H-NMR和13C-NMR谱图中多糖的典型信号分别集中在δH3.0～5.5ppm和δC57～110ppm范围内，根据δH4.0～5.5异头质子和δC90～110异头碳的共振信号，可判断多糖的异头构型(α-型和β-型)和糖环构型(吡喃糖和呋喃糖)。通常情况下，异头氢质子的δ大于5.0的为α-型糖苷，而β-型糖苷异头氢质子的δ小于5.0，此外，呋喃糖的C2和C4一般在δ82～84有信号，而吡喃糖糖C3和C5的δ通常小于80。
结果如图5A所示，MAP-1～MAP-6异头氢的共振区域主要分布在δ4.2～5.3，分别为4.2、δ4.4、δ4.6、δ4.9、δ5.0、δ5.2、δ5.3，说明6种多糖同时含有α-吡喃型糖苷和β-吡喃型糖苷，但不同方法得到的MAP两种构型比例存在较大差异。比如，MAP-1中α-构型和β-构型比例为1:1.5；MAP-3和MAP-4主要以β-构型为主，α-构型和β-构型比例分别为1:4和1:2.5；而MAP-6则以α-构型为主。此外，由于氘代试剂在δ4.7ppm左右的干扰，δ4.6ppm处的信号不清楚，可能是β-甘露糖中H的振动，而δ3.3～3.8ppm是C2～C6上的氢。
13C-NMR既可确定各种碳的位移,以及单糖残基的种类、取代位置和分支点,还能区别构型和构象,对MAP的结构解析起到关键性作用。结果如图B所示，MAP-1～MAP-6的13C-NMR信号主要集中δ57.4～104.3ppm之间，δ92.1～104.3ppm是MAP的异头碳质子信号，MAP在δ104.3、δ103.2、δ99.8、δ98.6、δ95.9和δ92.1ppm处的信号归因于C-1的6个异头碳。δ104.3、δ103.2ppm的信号是由β-Glc和β-Man分别引起的，δ99.8、δ98.6、δ95.9、δ92.1、δ76.5、δ73.9、δ72.9ppm归属于1,4-α-吡喃葡萄糖基残基，δ76.4、δ74.7、δ71.4ppm的信号可能是1,4-β-甘露糖基残基的C-4，C-5和C-2的化学位移动峰。据研究报道，δ82～84ppm处的信号对应呋喃醛糖的C4及呋喃酮糖的C5，而MAP在δ82～88ppm处均无化学位移，说明糖残基是吡喃型糖苷，这一结果与FT-IR分析一致。Δ60～80ppm的信号表示糖环上C2～C6，δ60ppm附近的信号是由糖基和甘露糖基残基的非取代C-6共振产生的。NMR数据结果显示，MAP中可能含有甘露糖信号，但可能由于水解不够彻底，单糖组成分析结果中甘露糖的特征峰不明显，几乎未检测出来。
2.2.3三螺旋结构分析
三螺旋多糖是自然界中存在的具有特殊链结构的一类生物大分子，它不仅具有较高的生物活性，而且具有特殊的分子识别能力以及其他多糖无法比拟的功能特性。本文采用刚果红染色方法分析MAP-1～MAP-6的三螺旋结构，如图3所示，随着NaOH浓度增加，刚果红与MAP-1，MAP-2，MAP-3，MAP-4，MAP-5，MAP-6形成的络合物的最大吸收波长相应减小，除MAP-1在浓度小于0.5mol·mL-1时，最大吸收波长减少较快以外，其余多糖组分均与空白对照几乎一致，说明MAP-1～MAP-6可能不具有三螺旋结构。
2.3体外抗高血糖活性测定
2.3.1α-葡萄糖苷酶抑制活性
抑制α-葡萄糖苷酶活性可以延缓碳水化合物的吸收和降低餐后血糖水平，是预防Ⅱ型糖尿病的重要策略。目前，已经有报道证实仙人掌多糖在体内具有显著的降血糖活性，但是否是潜在的α-葡萄糖苷酶抑制剂尚不清楚。因此，本发明以α-葡萄糖苷酶阿卡波糖为阳性对照，探究MAP-1～MAP-6是否能够对α-葡萄糖苷酶起抑制作用。
因此，本发明采用6种提取方法获取米邦塔仙人掌中的多糖类物质，探究MAP-1～MAP-6体外抑制Ⅱ型糖尿病靶酶(α-glucosidase andα-amylase)的抑制作用。
因此，有必要确定MAP是否可能是潜在的α-葡萄糖苷酶抑制剂。本发明以阿卡波糖为阳性对照，采用6种提取方法获得MAP-1～MAP-6，并探讨了其对α-葡萄糖苷酶的抑制效果，结果如图6所示，随着质量浓度的从0.5mg·mL-1升至16mg·mL-1，MAP-1～MAP-6对α-葡萄糖苷酶的抑制率呈剂量依赖性升高。当浓度为0.5mg·mL-1时，MAP-4、MAP-6的抑制率低于阳性对照，但1mg·mL-1后，阳性对照的抑制率显著(P＜0.01)低于MAP-6，与此同时，在研究的质量浓度范围内，MAP-1、MAP-2、MAP-5对α-葡萄糖苷酶的抑制率高于阿卡波糖，且差异性尤其显著(P＜0.001)，特别是MAP-2，16mg·mL-1时，抑制率可高达93.05±2.05％，是阿卡波糖的1.5倍。
此外，通过水提法提取的木瓜多糖，通过测定其抑制α-葡萄糖苷酶活性实验发现，质量浓度为10mg·mL-1时，抑制率最高可达72.65％，而在MAPs的a-葡萄糖苷酶抑制活性在0.5mg·mL-1时MAP-1和MAP-2的抑制率已高于74.90±2.21％，其抑制率是木瓜籽多糖的1倍多.除此之外，MAP-1～MAP-6对α-葡萄糖苷酶的抑制率还显著高于紫草多糖(comfreypolysaccharides)、桑葚多糖(Fructus Mori polysaccharides)小鹿霍根多糖(Rhynchosia minima root polysaccharides)(Mengying Duan&Mengying Duan&XuejingJia),这说明MAP对α-葡萄糖苷酶有很好的抑制作用，是一种有效的α-葡萄糖苷酶抑制剂。
据报道，含Rha、Ara、Man、GalA和GlcA五种单糖的多糖具有较强的a-葡萄糖苷酶抑制能力。此外，多糖对α-葡萄糖苷酶具有较好的抑制作用与Glc和Ara的含量有关，而这一结论与MAP抑制α-葡萄糖苷酶活性结果相似。MAP-2中Ara和GlcA含量最高，分别为6.807和2.889，且对α-葡萄糖苷酶的抑制作用显著高于其他MAP组分，说明在抑制α-葡萄糖苷酶的过程中，Ara和GlcA含量可能是一个主要影响因素。与此同时，MAP-1和MAP-5对α-葡萄糖苷酶的抑制率仅次MAP-2之后，而MAP-1的抑制作用除了受Ara和GlcA含量的影响，还可能与Glc含量有关。而在单糖组成实验中，MAP-4中GlcA和Ara的含量都比MAP-1高，但对α-葡萄糖苷酶的抑制率显著低于MAP-1，这说明除了单糖组成和含量影响MAP抑制α-葡萄糖苷酶活性外，总糖含量(见表2)也可能是其中的影响因素之一。这些结果表明MAP可作为一种有效的α-葡萄糖苷酶抑制剂或治疗Ⅱ型糖尿病的功能性食品，特别是MAP-1、MAP-2和MAP-5。
2.3.2α-淀粉酶抑制活性
α-淀粉酶作用于淀粉，可随机切割糖链内部的a-1,4糖苷键，释放出葡萄糖，从而引起Ⅱ型糖尿病患者餐后血糖水平升高。因此，抑制α-淀粉酶活性对控制餐后高血糖症很重要。结果如图7所示，与抑制α-葡萄糖苷酶活性结果不同，MAP-1～MAP-6对α-淀粉酶的抑制效果相对较低，不同MAP组分对α-淀粉酶有一定的抑制作用，且呈剂量依赖性关系，在0.5～16mg·mL-1范围内，MAP-1～MAP-6的IC50值由低到高依次为MAP-6(1.53mg·mL-1)<MAP-4(2.69mg·mL-1)<MAP-2(2.74mg·mL-1)<MAP-3(2.86mg·mL-1)<MAP-5(3.47mg·mL-1)<MAP-1(47.86mg·mL-1)，MAP-6的IC50值最低，16mg·mL-1时，其抑制率可高达89.17±0.98％，同质量浓度下，抑制率可以是MA-4、MAP-2、MAP-3、MAP-5的1.7～2.3倍，MAP-1的31.3倍。与此同时，除MAP-1外，MAP-2～MAP-6的IC50显著(P＜0.05)低于阳性对照阿卡波糖(8.07mg·mL-1)，这说明MAP-1～MAP-6确实降低了α-淀粉酶活性，阻止了α-淀粉酶对淀粉的作用，且效果优于阿卡波糖。同时，相比于木瓜籽多糖(IC50 6.24mg·mL-1)、桑葚多糖(IC50 19.31mg·mL-1)和薄荷多糖(IC50 11.65mg·mL-1等天然多糖，MAP-6具有更高的α-淀粉酶抑制活性。然而，GalA的存在有助于多糖发挥α-淀粉酶抑制作用，同时，还有相关文献报道，单糖组成对抑制α-淀粉酶活性有一定影响。如表2所示，抑制α-淀粉酶效果最好的MAP-6中含量Glc最高，可提供大量羟基与消化酶结合，从而降低酶活性；其次是MAP-4，高含量的GlcA和GalA中较多的酮基可以与酶结合，使得α-淀粉酶活性降低。此外，从NMR谱图分析中可知，MAP-2～MAP-6属于酸性多糖，而MAP-1偏中性，相较之下，酸性多糖可能对α-淀粉酶抑制作用更好。
研究表明，多糖抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性与其存在的游离羧基和羟基有关，这些游离的基团可以与消化酶中的氨基酸残基相互作用，从而导致酶失活。同时，研究表明粘性多糖可阻止酶与底物的相互作用，限制葡萄糖从活性点扩散。因此，MAP-1～MAP-6具有较高的降血糖活性，可能是由于其较高的糖醛酸含量，从而具有更多的游离羧基和羰基可以阻止葡萄糖的扩散。另外，可以看出，MAP-1～MAP-6的α-葡萄糖苷酶抑制活性高于它们的α-淀粉酶抑制活性，且整体抑制能力均强于阿卡波糖，这种现象是有利的，因为，高的α-淀粉酶抑制活性无法水解淀粉，从而延长淀粉在胃肠道内滞留时长，产生腹胀、腹痛和腹泻等不良反应。因此，适当的α-淀粉酶抑制活性和较高的a-葡萄糖苷酶抑制活性时解决和降低餐后高血糖水平的有效途径。从MAP-1～MAP-6对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性来看，MAP-1～MAP-6不仅具有良好的降糖活性，也能避免阿卡波糖引起的不良反应，因此，在治疗Ⅱ型糖尿病方面，是一种更安全和更有效的药物，但具体作用机制还有待进一步研究。
2.4体外抗氧化活性测定
2.4.1 ABTS自由基清除活性
体内过量的自由基会增加肝病、糖尿病和衰老等疾病的风险，而多糖因具有副作用小和抗氧化能力强的优点备受关注。因此，本发明采用不同提取方法获得六种多糖组分(MAP-1～MAP-6)并对其抗氧化能力进行了评价，主要包括ABTS、DPPH自由基清除能力和羟自由基清楚能力。
ABTS自由基可通过接收氢原子或电子与抗氧化剂发生反应，而对ABTS自由基的清除能力能间接说明多糖的抗氧化活性。结果如图8所示，多糖样品除MAP-2和MAP-6外，均表现出较强的ABTS自由基清除能力，且清除率随多糖浓度的增加而升高。从整体上升趋势来看，MAP对ABTS自由基的清除效率显著低于VC，其活性依次为MAP-3>MAP-5>MAP-4>MAP-1>MAP-2>MAP-6。当浓度为16mg·mL-1时MAP-3对ABTS的清除率可高达80.05±1.39％，是其他组分的1.1～2.3倍。
2.4.2 DPPH自由基清除活性
DPPH自由基可以接受电子或氢自由基，变成稳定的抗磁性分子。因此，通过测定DPPH自由基的吸收减弱程度，可间接评价样品的抗氧化活性。以清除率表示MAP-1～MAP-6对DPPH自由基的清除能力，清除率越高，其抗氧化活性越强。结果如图9所示，MAP-1～MAP-6对DPPH自由基的清除效率与多糖浓度在一定浓度范围内存在剂量效应关系，随多糖浓度增加，清除DPPH自由基能力逐渐增强。同时，六种MAP和VC对DPPH自由基有不同程度的清除作用，其中VC的清除率显著高于MAP。当浓度增加到16mg·mL-1时，MAP-1、MAP-2、MAP-3、MAP-4、MAP-5、MAP-6和VC的清除率分别是74.16±0.86％、63.04±0.44％、47.76±0.74％、77.05±0.36％、53.28±0.69％、47.67±0.43％和93.43±0.12％。六多糖组分对DPPH自由基的清除能力显著低于VC，但MAP-1和MAP-4具有较强的清除能力。MAP-2、MAP-3、MAP-5和MAP-6的清除活性显著低于MAP-1和MAP-4，且在浓度为16mg·mL-1时差异尤为显著。
2.4.3羟基自由基清除活性
羟基自由基是体内典型的活性氧自由基，对周围生物大分子的破坏力极强。因此，清除羟基自由基对细胞或食物系统的抗氧化防御非常关键。MAP-1～MAP-6对羟自由基的清除作用，结果如图10所示，6种样品在不同浓度下均表现出不同的清除能力，且呈剂量依赖性。0.5mg·mL-1时，MAP-4对强自由基的抑制率最高为29.77±0.69％。在16mg·mL-1时，MAP-2的抑制效果最好，其抑制率为47.26±0.23％，而低浓度时MAP-5对羟自由基几乎没有抑制作用，直至16mg·mL-1时其抑制率仅为19.41±0.23％。此外，在0.5mg·mL-1～16mg·mL-1浓度范围内，随着浓度的增加MAP对羟自由基的抑制率增加较缓，在相同浓度水平下，MAP-1、MAP-2、MAP-3、MAP-4、MAP-5、MAP-6对羟基自由基的清除能力显著(P＜0.05)低于VC。
通过MAP-1～MAP-6抗氧化活性数据可知，整体来说，多糖清除ABTS自由能力＞DPPH自由基能力＞羟自由基能力，但清除率都远低于阳性对照。此外，可能受多糖的单糖组成、化学结构以及构象的影响，与balsam pear polysaccharide、turmericpolysaccharides和Allium sativum polysaccharide等天然多糖相比，MAP-1～MAP-6有一定的抗氧化活性，但清除效果不是很理想，特别是MAP-6的抗氧化作用较差。因此，在抗氧化活性方面，可能进一步深入研究的意义不大，但在其他活性中，也许会起到一定的协同作用。
2.5体外抗过敏
透明质酸是一种分子量较大的多糖，主要存在于细胞外基质中，尤其是软结缔组织中。透明质酸酶可将透明酸中的N-乙酰-D葡萄糖胺与D-葡萄糖醛酸之间的b-1,4键随机水解，促进细胞增殖和迁移，并可能参与了一些恶性肿瘤的发展。因此，透明质酸酶的抑制作用被用作体外抗炎和抗过敏活性试验。本发明采用六种方法提取米邦塔中的多糖物质，并以不同浓度(0.5、1、2、4、8、16mg·mL-1)对透明质酸酶的抑制作用进行了评价，结果如图11所示。可见，在测定的多糖浓度范围内，透明质酸酶的抑制率与多糖用量呈正相关。当浓度为0.5mg·mL-1时，MAP-5的抑制率仅为8.71±3.25％，但当浓度提高至1mg·mL-1时，MAP-5对透明质酸酶的抑制率迅速增加，2mg·mL-1后，MAP-5的抑制率较其他多糖组分差异性尤其显著，其IC50是其他多糖的2.0～23.9倍。此外，除MAP-2以外，其他多糖组分在16mg·mL-1时，抑制率都在50％以上，且IC50从低到高依次为：MAP-5(4.27mg·mL-1)<MAP-3(8.67mg·mL-1)<MAP-6(10.00mg·mL-1)<MAP-4(13.33mg·mL-1)<MAP-1(13.80mg·mL-1)<MAP-2(102.32mg·mL-1)。这说明，可能除了MAP-2外，其他5个多糖组分可作为透明质酸酶抑制剂进一步研发。
2.6体外抗乙醇脱氢酶
酒精与一系列疾病有关，如肝损伤、高血压、中风和癌症等。而乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase,ADH)是参与体内乙醇代谢的主要酶，它可以借助烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化还原酶(NAD+)将乙醇转化为乙醛，从而显著降低体内乙醇的浓度。因此，本实验以ADH为作用靶点，采用所建立的ADH体外活性筛选模型，测定了MAP-1～MAP-6对ADH活性的影响。不同MAP组分对ADH表现出不同程度的激活(抑制)作用。由图12可见，低浓度时，MAP-1和MAP-2对ADH主要以抑制作用为主，而随着浓度增加，抑制率逐渐减小，在2mg·mL-1～16mg·mL-1范围内，MAP-1和MAP-2对ADH的激活率呈剂量依赖性。然而，与MAP-1和MAP-2相反，MAP-4在低浓度时对ADH表现出较强的激活作用，但4mg·mL-1后激活率为零且转为抑制率，抑制效果随着浓度的增加而越来越好。此外，当浓度为16mg·mL-1时，MAP-6对ADH发挥抑制作用，而在0.5mg·mL-1～8mg·mL-1范围内，MAP-6对ADH的激活率显著高于其他MAP组分，最高可达27.03±4.37％。然而，在测定的浓度范围内，MAP-2、MAP-3、MAP-5对ADH的激活率呈良好的量效关系。以上结果表明，MAP-1～MAP-6在一定浓度范围内可以激活ADH，发挥一定的解酒作用，但是整体激活率均为超过25％，显著低于桑葚多糖，这说明，MAP可能在此领域的活性不够明显，甚至是没有活性。
3结论
本发明采用不同方法分级提取米邦塔中的功能性多糖。结果表明，MAP-1～MAP-6的提取率、理化性质、化学结构和生物活性均存在显著性差异，但具有相似的典型红外光谱特征。MAP-6的得率最高，显著高于其他多糖组分。然而，受提取方法的影响，MAP-1～MAP-6不同组分间单糖含量存在显著性差异。此外，MAP-1～MAP-6的抗氧化活性、抑制透明质酸酶活性和激活乙醇脱氢酶活性相对较差，而对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶具有显著的抑制活性。因此，综合各项指标，MAP-2可作为一种更安全且效果较好的降血糖药物，而本发明为米邦塔仙人掌多糖进行了系统性研究，为其在食品和制药行业的应用提供重要参考。
Claims (4)
1.一种米邦塔仙人掌多糖MAP-2，其特征在于，所述多糖通过如下方法制备：
(1)米邦塔仙人掌粉碎、清洗：取新鲜米邦塔仙人掌，去皮，用粉碎机榨成泥浆，以g/mL1:2比例加入60-90℃石油醚为溶剂，65℃水浴回流提取2h，滤过，弃去滤液，重复操作2次，滤渣再次使用石油醚清洗2次，65℃减压烘干滤渣，得滤渣Ⅰ；
(2)米邦塔仙人掌分离滤渣：取滤渣I，以g/mL 1:3比例向其加入蒸馏水，室温18℃浸提2h，离心分离滤渣和滤液，滤液减压浓缩至原体积的1/5，得滤渣A；
(3)米邦塔仙人掌多糖提取：采用热水浸提法，步骤(2)滤渣A采用96℃沸水浸提2h，料液比为1:4，收集滤液并减压浓缩，得米邦塔仙人掌多糖浓缩液；
(4)米邦塔仙人掌多糖脱蛋白和小分子物质：步骤(3)所得多糖浓缩液通过1mol·L-1的HCl溶液和1mol·L-1的NaOH溶液调节pH至6，以g/mL 3:100比例加入木瓜蛋白酶，50℃水浴反应45min，4000r·min-1离心10min，弃去沉淀，上清液中以体积比1:1加入3％三氯乙酸溶液，室温静置20min，4000r·min-1，10min离心舍弃沉淀，滤液减压浓缩至原体积的20％±1％，然后调节其pH值为6，在保持木瓜蛋白酶用量和反应温度不变的情况下，上清液与三氯乙酸溶液的体积比变成1:1/2，离心弃去沉淀，收集上清液，通过分子量为8000-14000的透析袋除去上清液中的小分子物质，时长为24h，浓缩目标液；
(5)醇沉：步骤(4)所得目标液以体积比1:4加入95％乙醇溶液醇沉，沉淀冷冻干燥后即得米邦塔仙人掌多糖MAP-2。
2.如权利要求1所述米邦塔仙人掌多糖MAP-2在制备抗糖尿病药物中的应用。
3.根据权利要求2所述米邦塔仙人掌多糖MAP-2的应用，其特征在于：所述糖尿病为Ⅱ型糖尿病。
4.根据权利要求2所述米邦塔仙人掌多糖MAP-2的应用，其特征在于：所述米邦塔仙人掌多糖MAP-2对Ⅱ型糖尿病中α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。
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