CN113092623B - 何首乌叶中主要黄酮类化合物含量的hplc检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种何首乌叶中主要黄酮类化合物含量的HPLC检测方法，包括：(1)制备杨梅苷、槲皮苷和山柰酚‑3‑O‑鼠李糖苷的标准品分别绘制杨梅苷、槲皮苷和山柰酚‑3‑O‑鼠李糖苷的标准曲线并确定其线性回归方程；(2)将待检测的何首乌叶样品溶液采用高效液相色谱仪进行分析，将样品进行梯度洗脱，分别测定洗脱物三个优势峰的峰面积；(3)对照标准曲线和线性回归方程计算待检测何首乌叶样品中杨梅苷、槲皮苷和山柰酚‑3‑O‑鼠李糖苷的含量。本发明所建立的何首乌叶中主要黄酮类化合物含量的HPLC检测方法选择性好、灵敏度高、准确可靠，为何首乌叶制品的品质分析和质量控制提供了新的分析方法及依据。

Description

何首乌叶中主要黄酮类化合物含量的HPLC检测方法
技术领域
本发明涉及何首乌叶中黄酮类化合物含量的检测方法，尤其涉及何首乌叶中黄酮类化合物含量的HPLC检测方法，属于何首乌叶中主要黄酮类化合物含量的检测领域。
背景技术
何首乌(Polygonum multiflorum Thunb.)，又名夜交藤，首乌藤，为蓼科(Polygonaceae)何首乌属(Fallopia Adans.)多年生草本植物何首乌的干燥块茎。在《本草纲目》、《中国药典》上均有收录记载，《本草纲目》曰“性甘、平；归心、肝经。具有养血安神、祛风通络的功效。用于失眠多梦、血虚身痛、风湿痹痛、皮肤瘙痒等症。”何首乌中含有多种生物活性类物质，其中最主要的包括黄酮类化合物、二苯乙烯苷类化合物、蒽醌类化合物、多酚类化合物和磷脂类及脂肪酸类等活性成分。现代药理研究表明何首乌具有镇静安神、抗慢性炎症及抗菌等作用。
随着国民生活水平的提高，当今人们对健康愈发重视。何首乌作为我国传统的补益中药，其性状评价和品质鉴定的内容和领域需有所拓宽。目前何首乌块根的化学成分及含量测定已有大量学者进行了研究，而何首乌的其余部分如何首乌叶中的化学成分及其含量，仍存在着研究不够深入、评价标准模糊、体系不够完善、分析方法难以统一等问题，造成整个行业总体缺乏标准的鉴定体系，发展步伐缓慢。黄酮类化合物作为何首乌中的重要活性物质之一，也是广受人们关注的天然自由基清除剂，具有抗氧化、抗衰老、抗三高的作用。何首乌叶中黄酮类化合物的含量测定研究，对于提高何首乌资源的整体利用率，提升何首乌的整体价值有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种何首乌叶中主要黄酮类化合物含量的HPLC(高效液相色谱)检测方法。
本发明的目的通过下述技术方案来实现，
一种何首乌叶中主要黄酮类化合物含量的HPLC检测方法，包括：
(1)制备杨梅苷、槲皮苷、山柰酚-3-O-鼠李糖苷的标准品，吸取不同浓度的标准品采用高效液相色谱仪进行分析，以进样浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标分别绘制标准曲线，确定杨梅苷、槲皮苷、山柰酚-3-O-鼠李糖苷的线性回归方程；
(2)将待检测的何首乌叶样品溶液采用高效液相色谱仪进行分析，将样品进行梯度洗脱，测定洗脱物的优势峰的峰面积；
(3)通过步骤(1)的线性回归方程计算待检测何首乌叶样品中杨梅苷、槲皮苷和山柰酚-3-O-鼠李糖苷的含量。
具体地，步骤(1)中所确定的线性回归方程如下：
杨梅苷：Y1＝4201.6X1-80.608,R2＝0.9981；
槲皮苷：Y2＝15561X2-98.699,R2＝0.9991；
山柰酚-3-O-鼠李糖苷：Y3＝18931X3-61.969,R2＝1。
具体地，步骤(2)中所述的何首乌叶样品溶液的制备包括：将何首乌叶烘干，粉碎过筛后加入甲醇水溶液进行超声提取得到待检测的样品溶液。
具体地，步骤(2)中，所述的甲醇水溶液的浓度优选为70-95％。
具体地，步骤(2)中，所述的超声提取的条件优选为：温度为30-50℃、超声时间为25-60min、超声频率为30-50kHz。
具体地，步骤(1)或(2)中采用高效液相色谱仪进行分析的色谱条件优选为：固定相是以十八烷基键合硅胶为填料的色谱柱；流动相A为100％乙腈溶液，流动相B为超纯水；流速：0.5mL-1.5mL/min；检测波长：200-280nm；进样量：5-20μL；柱温：30-40℃。
具体地，采用梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：
时间：0～10min，流动相A：15，流动相B：85；时间：10-13min，流动相A：25，流动相B：75；时间13-35min，流动相A：25，流动相B：75。
本发明对所建立的何首乌叶中主要黄酮类化合物含量的HPLC检测方法进行了方法学验证包括专属性实验、精密度实验、稳定性实验、重复性实验、加样回收实验，验证试验结果显示，本发明所建立的检测方法良好以及仪器精密良好，在所建立的检测条件下检测样品中主要黄酮类化合物含量具有可行性。
本发明所建立的何首乌叶中主要黄酮类化合物含量的HPLC检测方法选择性好、灵敏度高、准确可靠，为何首乌制品的品质分析和质量控制提供了新的分析方法及依据。
附图说明
图1是杨梅苷标准曲线。
图2是槲皮苷标准曲线。
图3是山柰酚-3-O-鼠李糖苷标准曲线。
图4是供试品溶液色谱图。
图5是对照品溶液色谱图。
图6是空白溶剂色谱图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1何首乌叶中主要黄酮类化合物含量测定方法建立
何首乌叶中主要黄酮类化合物含量的HPLC检测方法，包括：
(1)、制备杨梅苷、槲皮苷、山柰酚-3-O-鼠李糖苷的标准品，吸取不同浓度的标准品采用高效液相色谱仪进行分析，高效液相色谱仪进行分析的色谱条件为：固定相是以十八烷基键合硅胶为填料的色谱柱；流动相A为100％乙腈溶液，流动相B为超纯水；流速：0.5mL-1.5mL/min；检测波长：200-280nm；进样量：5-20μL；柱温：30-40℃。以进样浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标分别绘制标准曲线，确定杨梅苷、槲皮苷、山柰酚-3-O-鼠李糖苷的线性回归方程；所确定的线性回归方程如下：
杨梅苷：Y1＝4201.6X1-80.608,R2＝0.9981；
槲皮苷：Y2＝15561X2-98.699,R2＝0.9991；
山柰酚-3-O-鼠李糖苷：Y3＝18931X3-61.969,R2＝1。
(2)、将适量的何首乌叶，65℃下烘至恒重，粉碎过筛。精密称取细粉，加入甲醇溶液进行超声提取得到样品溶液。其甲醇溶液浓度为70-95％，温度为30-50℃、超声时间为25-60min、超声频率为30-50kHz。将待检测的何首乌叶样品溶液采用高效液相色谱仪进行分析，高效液相色谱仪进行分析的色谱条件为：固定相是以十八烷基键合硅胶为填料的色谱柱；流动相A为100％乙腈溶液，流动相B为超纯水；流速：0.5mL-1.5mL/min；检测波长：200-280nm；进样量：5-20μL；柱温：30-40℃。将样品进行梯度洗脱，测定洗脱物的优势峰的峰面积；其中梯度洗脱程序见表1。
表1 梯度洗脱程序
(3)、通过步骤(1)的线性回归方程计算待检测何首乌叶样品中杨梅苷、槲皮苷和山柰酚-3-O-鼠李糖苷的含量。
方法学验证
(1)标准曲线的制定
精密称取杨梅苷标准品2.9mg、槲皮苷标准品3.2mg、山柰酚-3-O-鼠李糖苷标准品3.1mg，并用甲醇配制成1mg/mL的母液，之后依次稀释至不同浓度，用0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液每次10μL进样检测，记录峰面积，以峰面积Y为纵坐标，标准品浓度X(mg/mL)为横坐标绘制标准曲线。得到杨梅苷、槲皮苷、山柰酚-3-O-鼠李糖苷标准品的回归方程如下：
杨梅苷：Y1＝4201.6X1-80.608,R2＝0.9981；
槲皮苷：Y2＝15561X2-98.699,R2＝0.9991；
山柰酚-3-O-鼠李糖苷：Y3＝18931X3-61.969,R2＝1。
表明杨梅苷、槲皮苷、山柰酚-3-O-鼠李糖苷的线性关系良好，其标准曲线分别见图1-图3。
(2)专属性试验
精密移取浓度为0.33mg/mL的杨梅苷、0.33mg/mL的槲皮苷、0.33mg/mL的山柰酚-3-O-鼠李糖苷的混合对照品溶液M1，何首乌叶样液M2和空白阴性溶液M3，0.22μm过滤，按照实施例1的色谱条件测定。
专属性试验结果如图4-图6所示，各成分分离效果理想(分离度均大于1.5)，表明空白溶剂对主要物质的测定没有干扰，该方法专属性良好。
(3)精密度试验
取混合对照品溶液M1，重复进样6次，进样量为10μL，按照实施例1的色谱条件测定，记录其峰面积，计算RSD。
试验结果表明：杨梅苷、槲皮苷、山柰酚-3-O-鼠李糖苷的峰面积RSD(％)均小于1.0％，表明仪器精密度良好。
表2 精密度试验结果
(4)稳定性试验
取混合对照品溶液M1,分别在0、3、6、9、12、24h进样，进样量为10μL，按照实施例1的色谱条件测定，记录其峰面积，计算RSD。
试验结果表明，杨梅苷、槲皮苷、山柰酚-3-O-鼠李糖苷的峰面积RSD(％)均小于1.0％，
表明溶液在24小时内稳定性良好，能满足测定要求。
表3稳定性试验结果
(5)重复性试验
抽取一份何首乌叶粉末样品50mg，精密稳定，用甲醇定容至10mL，0.22μm过滤得样品溶液，平行制备6份样品溶液，进样量为10μL。按照实施例1的色谱条件测定，记录其峰面积，计算RSD。
表4 重复性试验结果
(6)加样回收试验
精密称取一定量杨梅苷、槲皮苷、山柰酚-3-O-鼠李糖苷标准品(溶解后再分装定容)分别置于6个锥形瓶中，分别精密加入已知含量的何首乌叶粉0.1g，其杨梅苷、槲皮苷、山柰酚-3-O-鼠李糖苷的含量分别为0.94mg、0.87mg、0.52mg，定容10ml。进样量10μL，按照实施例1的色谱条件测定，记录其峰面积，按照公式(1)计算回收率和RSD。
试验结果如表5所示。结果表明，杨梅苷、槲皮苷、山柰酚-3-O-鼠李糖苷的加样回收率均在95～105％之间，平均回收率分别为99.49％，、97.29％和97.56％，RSD均小于2.0％，表明本发明建立的方法可靠，符合含量测定的要求。
表5 加样回收试验结果

Claims (1)

1.一种何首乌叶中主要黄酮类化合物含量的HPLC检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）制备杨梅苷、槲皮苷和山柰酚-3-O-鼠李糖苷的标准品，吸取不同浓度的混合标准品采用高效液相色谱仪进行分析，以进样浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标分别绘制杨梅苷、槲皮苷、山柰酚-3-O-鼠李糖苷的标准曲线并确定杨梅苷、槲皮苷、山柰酚-3-O-鼠李糖苷的线性回归方程；所确定的杨梅苷、槲皮苷、山柰酚-3-O-鼠李糖苷的线性回归方程分别如下：
杨梅苷：Y1=4201.6X1-80.608, R2=0.9981；
槲皮苷：Y2=15561X2-98.699, R2=0.9991；
山柰酚-3-O-鼠李糖苷：Y3=18931X3-61.969, R2=1；
(2) 将何首乌叶烘干，粉碎过筛后加入浓度为70%-95%甲醇水溶液进行超声提取得到待检测的样品溶液；将待检测的何首乌叶样品溶液采用高效液相色谱仪进行分析，将样品进行梯度洗脱，分别测定洗脱物三个优势峰的峰面积；超声提取的条件为：温度为30-50℃、超声时间为25-60 min、超声频率为30-50kHz；
(3)对照步骤（1）的标准曲线和线性回归方程计算待检测何首乌叶样品中杨梅苷、槲皮苷和山柰酚-3-O-鼠李糖苷的含量；
步骤（1）或（3）中采用高效液相色谱仪进行分析的色谱条件为：流动相A为100%乙腈溶液，流动相B为超纯水；所述的色谱条件中固定相是以十八烷基键合硅胶为填料的色谱柱；流速0.5-1.5mL/min；检测波长：200-280nm；进样量：5-20μL；柱温：30-40℃；
梯度洗脱程序如下：
时间：0~10 min，流动相A：15，流动相B：85；时间：10~13min，流动相A：25，流动相B：75；时间：13~35min，流动相A：25，流动相B：75。
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