CN101912522A

CN101912522A - 六味生脉片剂的检测方法

Info

Publication number: CN101912522A
Application number: CN 201010241370
Authority: CN
Inventors: 李彦; 卿光明; 钟瑛
Original assignee: MEIDAKANG PHARMACEUTICAL CO Ltd SICHUAN PROV
Current assignee: MEIDAKANG PHARMACEUTICAL CO Ltd SICHUAN PROV
Priority date: 2010-07-28
Filing date: 2010-07-28
Publication date: 2010-12-15
Anticipated expiration: 2030-07-28
Also published as: CN101912522B

Abstract

本发明公开一种六味生脉片剂的检测方法，该检测方法包括性状、检查、鉴别和含量测定项目。它是针对现有六味生脉片(原益寿康泰片)的质量控制标准简单，产品质量不易控制的缺点，对制剂的成分鉴别和含量测定进行了研究，拟定了HPLC法以取代原双波长薄层扫描测定丹参酮ⅡA的含量，以及在鉴别当中增加了人参所含人参皂苷的薄层鉴别和当归的薄层鉴别。所采用的方法专属性强、精密度高，重现性好，回收率高，提高了六味生脉片的质量控制标准，从而保证了该制剂的临床疗效。

Description

六味生脉片剂的检测方法

技术领域

本发明涉及一种六味生脉片剂的检测方法，属于对药品进行质量控制的技术领域。

背景技术

六味生脉片为丹参、人参、麦冬等中药组成的复方制剂，具有补气养阴，养血活血的功效。药理研究表明该制剂能延缓衰老，提高机体免疫功能等。适用于老年气阴两虚所致的倦怠乏力，食欲不振，失眠多梦，心悸气短等症。

六味生脉片原药品名称为“益寿康泰片”，其质量标准收载于1993年版《四川省药品标准(中药成方制剂)》中，最初由卫生部门批准为保健品，后在国家药监局保健品整顿行动中，本申请人对其质量控制标准进行了再研究，形成了现在执行的“六味生脉片质量标准”，因其组方合理，用于补气养阴、养血活血的功效明显，且安全无明显的毒副作用，最终被国家药监局批准为中药保健药品，并按中药命名原则，依其组方及其功效将其药品名称重新修订为现在的“六味生脉片”。

在产品生产过程的质量控制中，本申请人的研究人员发现，原“益寿康泰片”质量标准所拟定的检测方法中，对方中主要起补气、养血活血的人参和当归等药材无专属的鉴别检查方法，所采用的方法均是对含内酯化合物及含显萤光化合物等一大类物质的鉴别检查，专属性不强，不能对药品质量及药品真伪起到很好的控制和监查作用；还有，药品组方中列为君药的丹参有效成份丹参酮ⅡA的含量检测方法，也不尽科学合理，所采用样品前处理方法是加热回流提取，且加热提取时间较长，需用1.5小时左右，而丹参酮ⅡA的热不稳定性，在长时间加热条件下易发生降解，使其检出值降低，不能有效反应药品中有效成份丹参酮ⅡA的真实含量；而双波长薄层扫描测定法也存在程序繁琐，检出结果易受薄层点样和展开过程中的人为操作因素及实验材料薄层板的优劣等诸多因素的影响，导致结果误差较大，重现性差，使含量测定值不能反应产品药效成份的真实值。因此，用该质量检测方法不能有效的控制产品质量，不能准确真实地反应产品的质量情况，对产品的质量没有起到有效的监控作用，从而影响了该产品的生产成本及临床疗效。

发明内容

本发明的目的，是提供一种六味生脉片剂的检测方法。本发明针对上述现有六味生脉片(即原益寿康泰片)的质量控制标准简单，鉴别检查专属性不强，含量测定方法所得结果误差较大，含量测定值不能反应产品药效成份的真实值，使产品质量不易控制的缺点，对六味生脉片制剂的成分鉴别和含量测定进行了研究，拟定了HPLC法以取代原双波长薄层扫描测定丹参酮ⅡA的含量，以及在鉴别当中增加了人参所含人参皂苷的薄层鉴别和当归的薄层鉴别，提高了六味生脉片的质量控制标准，从而保证了该制剂的临床疗效。

本发明所述的六味生脉片是这样构成的：【处方】丹参257g、人参32g、麦冬192g、五味子97g、当归97g、枸杞子160g；【制法】以上六味，除丹参外，枸杞子等五味，用70％乙醇回流提取三次，第一次加4倍量提取3小时，第二、三次各加3倍量，各提取2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇，浓缩成相对密度为1.35～1.40(50℃)的稠膏；丹参用乙醇回流提取三次，第一次加4倍量提取3小时，第二、三次各加3倍量，各提取2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇，浓缩成相对密度为1.35～1.40(50℃)的稠膏；合并上述两种稠膏，在70℃～80℃、-0.08Mpa条件下减压干燥，粉碎，加入淀粉适量混匀，制粒，干燥，加硬脂酸镁适量，压制成1000片，包薄膜衣，即得。

本发明所述的检测方法，主要包括性状、鉴别、检查、含量测定项目；其中鉴别是对该制剂中丹参所含丹参酮ⅡA的薄层鉴别，人参所含人参皂苷的薄层鉴别，当归的薄层鉴别，含量测定是对制剂中丹参所含丹参酮ⅡA的含量测定。

丹参酮ⅡA的鉴别是以丹参酮ⅡA为对照品，以氯仿为展开剂的薄层鉴别法；

人参皂苷的鉴别是以人参皂苷Rb1、Rg1、Re为对照品，以氯仿∶甲醇∶水＝13∶7∶2为展开剂的薄层色谱法；

当归的鉴别是以当归对照药材作为对照，以石油醚∶醋酸乙酯＝9∶1为展开剂的薄层色谱法；

所述鉴别包括以下项目：

(1)丹参酮ⅡA的成分鉴别

取本品，除去包衣，研细，加丙酮，回流提取，滤过，滤液作为供试品溶液，另取丹参酮ⅡA对照品，加无水乙醇制成对照品溶液；吸取上述两种溶液，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿为展开剂，展开，取出，晾干，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

(2)人参皂苷的成分鉴别

取本品，除去包衣，研细，加乙醚，超声提取，滤过，滤渣挥干乙醚，加甲醇1，超声提取，滤过，滤液蒸干，残渣加氢氧化钠溶液使溶解，通过已处理好的D₁₀₁型大孔吸附树脂柱，用氢氧化钠溶液洗脱，弃去碱液，继用水洗至洗脱液呈中性，弃去水液，再用乙醇溶液洗脱，弃去乙醇溶液，最后用乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，取上清液作为供试品溶液，另取人参皂苷Rb1、Rg1、Re为对照品，加甲醇制成混合溶液，作为对照品溶液；吸取上述供试品溶液、对照品溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶甲醇∶水＝13∶7∶2，10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液，烘至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

(3)当归的鉴别

取本品，除去包衣，研细，加乙醚，超声提取，滤过，滤液挥干，残渣加醋酸乙酯使溶解，作为供试品溶液；另取当归对照药材，加乙醚，超声提取，滤过，滤液作为对照药材溶液，吸取上述供试品溶液、对照品溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚∶醋酸乙酯＝9∶1为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯光(365nm)下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

具体的鉴别的方法包括以下项目：

(1)丹参酮ⅡA的成分鉴别：

取本品5片，除去包衣，研细，加丙酮10ml，回流提取2小时，滤过，滤液作为供试品溶液，另取丹参酮ⅡA对照品，加无水乙醇制成1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿为展开剂，展开，取出，晾干，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

(2)人参皂苷的成分鉴别：

取本品20片，除去包衣，研细，加乙醚30ml，超声提取15分钟，滤过，滤渣挥干乙醚，加甲醇30ml，超声提取15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加1％氢氧化钠溶液10ml使溶解，通过已处理好的D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5cm，长12cm)，用1％氢氧化钠溶液90ml洗脱，弃去碱液，继用水洗至洗脱液呈中性，弃去水液，再用20％乙醇溶液70ml洗脱，弃去20％乙醇溶液，最后用70％乙醇溶液100ml洗脱，收集70m％乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，取上清液作为供试品溶液，另取人参皂苷Rb1、Rg1、Re为对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液；吸取上述供试品溶液10μl、对照品溶液4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶甲醇∶水＝13∶7∶2，10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开约17cm，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃烘至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

(3)当归的鉴别：

取本品10片，除去包衣，研细，加乙醚20ml，超声提取15分钟，滤过，滤液挥干，残渣加醋酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液；另取当归对照药材0.5g，加乙醚5ml，超声提取15分钟，滤过，滤液作为对照药材溶液，吸取上述供试品溶液10μl、对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)∶醋酸乙酯＝9∶1为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯光(365nm)下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

丹参酮ⅡA的含量测定是以丹参酮ⅡA为对照品，以甲醇∶水＝70∶30为流动相的高效液相色谱法。

所述含量测定的方法

丹参酮ⅡA的含量测定

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇∶水＝70∶30为流动相，检测波长为270nm，理论板数按丹参酮ⅡA峰计算应不低于7000；精密称取丹参酮丹参酮ⅡA对照品，置棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取，置棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得对照品溶液；取本品，除去包衣，精密称定，研细，精密称取，置具塞磨口棕色三角瓶中，精密加入甲醇，称定重量，超声提取，放至室温，用甲醇补足减失的重量，过滤，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入高效液相色谱仪，测定，即得，本品每片含丹参以丹参酮ⅡA计不得少于0.30mg。

更具体的含量测定的方法：

丹参酮ⅡA的含量测定

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇∶水＝70∶30为流动相，检测波长为270nm，理论板数按丹参酮ⅡA峰计算应不低于7000；精密称取丹参酮丹参酮ⅡA对照品10ml，置50ml棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取2ml，置25ml棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得对照品溶液(每1ml中含丹参酮ⅡA16μg)；取本品20片，除去包衣，精密称定，研细，精密称取0.7g，置具塞磨口棕色三角瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声提取30分钟，放至室温，用甲醇补足减失的重量，过滤，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得，本品每片含丹参以丹参酮ⅡA计不得少于0.30mg。

为了确保本发明的成分鉴别和含量测定方法科学、合理、可行，本申请人对方法中药品成分的鉴别和含量测定方法进行了研究，具体试验资料如下：

一.人参皂苷的薄层鉴别研究

由于人参主要含皂苷类等成分，故设计以人参皂苷Rb1、Rg1、Re为对照，对方中人参进行鉴别。由于制法项下，药材采用乙醇回流提取，提取出成分较多，故样品的前处理较麻烦。方法1：取本品10g(相当于人参药材1g)，置索氏提取器中用乙醚提取2小时，弃去乙醚，残渣挥干乙醚，加水饱和正丁醇100ml超声提取1小时，滤过，正丁醇提取液用1％氢氧化钠水溶液洗至水相几乎无色，然后再用蒸馏水洗至中性，KT醇挥干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。方法2：取本品20片，除去糖衣，研细，加乙醚30ml，超声处理15分钟，滤过，残渣挥干乙醚，加甲醇30ml，超声处理15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加1％氢氧化钠溶液10ml使溶解，通过已处理好的D101型大孔树脂柱(柱径1.50m，长12cm)，用1％氢氧化钠溶液90ml洗脱，弃去碱液，继用水洗至洗脱液呈中性，弃去水液，再用20％乙醇溶液70ml洗脱，弃去20％乙醇溶液，最后用70％乙醇溶液100ml洗脱，收集70％乙醇溶液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，取上清液作为供试品溶液。吸附剂选用硅胶G板，展开剂选用氯仿∶醋酸乙酯∶甲醇∶水＝15∶40∶22∶10，10℃以下放置的下层液及氯仿∶甲醇∶水＝13∶7∶2，10℃以下放置的下层液，显色剂为10％硫酸乙醇溶液。方法1的提取较复杂，因乳化严重，供试品中Rb1斑点极弱，方法2的供试品处理较易，且能检出Rb1斑点，故正文中采用方法2的前处理方法。由于本品制法项下，药材采用95％乙醇，70％乙醇提取，提取出成分较多，虽然按皂苷性质，对样品进行前处理，但展开显色后，目光下斑点较少，但紫外光灯下荧光斑点很多，故检测时，选择日光下检视，阴性无干扰。

二.当归的薄层鉴别研究

研究中曾拟对当归中所含阿魏酸进行薄层鉴别，方法设计为：取本品6.35g置索氏提取器中，加乙醚加热提取4-5小时，乙醚提取液蒸干，残渣加石油醚(60～90℃)浸渍二次(15ml×2，2分钟)，倾去石油醚，残渣加2ml无水乙醇∶氯仿＝3∶2使溶解，作为供试品溶液。另取阿魏酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液10μl，对照品溶液5μl，分别点于同一含羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以苯∶甲醇∶冰醋酸＝30∶3∶1为展开剂，展开，取出，晾干，氨气熏后立即置紫外光灯(365nm)检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，应显相同颜色的荧光斑点。因干扰多，色谱分离不好，由于当归主要含挥发油，内酯，阿魏酸等成分，后设计以当归药材为对照，对方中当归进行鉴别。样品采用乙醚提取即可。吸附剂采用硅胶G板，展开剂选用石油醚(60～90℃)∶醋酸乙酯＝9∶1及正己烷∶醋酸乙酯＝9∶1，显色剂选用紫外光灯(365nm)下检视。供试品中，均检出当归斑点，阴性无干扰。

三、丹参酮ⅡA含量测定方法研究

1.实验所用仪器

仪器名称	型号
		高效液相色谱仪	WATERS600，486检测器
色谱数据工作站	Empower软件、Waters Bus、SAT/IN Moduel
		色谱柱	NOVA-PAK(4.6×250mm)，NOVA-PAK(3.9×150mm)
色谱柱	大连依利特Hypersil(4.6×250mm)
		电子天平	METTLE AE240(感量0.1mg、0.01mg)

2.实验试剂与试药

试剂：色谱纯甲醇(Fisher scientific)，水为蒸馏水用前超声脱气，其余均为分析纯。

对照品：丹参酮IIA(批号：0766-200011)，中国药品生物制品检定所

供试品：040201、040202、040203(美大康中心实验室提供)

阴性样品：040204批(美大康中心实验室提供)

3.检测方法的选择

3.1HPLC法的方法预试

以HPLC法测定丹参酮IIA的含量，已成为检定丹参中脂溶性成分丹参酮II A的主流方法，本实验借鉴《中国药典》二000年版一部丹参药材项下HPLC含量测定方法，对六味生脉片制成的供试品进行实验，看药典提供的色谱系统，样品制备方法，是否能使被检测成分丹参酮IIA峰达到基线分离，峰形对称，而阴性样品以无干扰。

(1)色谱系统：流动相甲醇∶水＝90∶30色谱柱大连依利特Hpersil柱4.6×300mm，检测波长270nm

(2)对照品溶液的制备：精密称取丹参酮ⅡA对照品0.00235g，置于25ml棕色容量瓶中，溶解定容，取2ml，置于10ml棕色容量瓶中。

(3)供试品、阴性样品液的制备：精密称取六味生脉片(040201)0.6778g，阴性样品(040204)0.6424g，参照《中国药典》二000版一部丹参药材项方法制成供试品液与阴性样品液。

(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品、阴性样品液各10ul，注入高效液相色谱仪，测定，记录色谱图。

从实验色谱图分析，六味生脉片供试品中与对照品丹参酮ⅡA保留时间相同的位置有丹参酮ⅡA峰，基线分离好，丹参酮IIA峰形对称，理论塔板数17000，但不足是被检测峰位置处阴性样品也有吸收，说明上述色谱系统用于丹参酮II A的含量测定有成功的可能，还须调整系统流动相的比例，来克服阴性样品的干扰。

3.2流动相的调整与确定

流动相为甲醇∶水＝90∶30的条件下，阴性样品有干扰，为了消除干扰的影响，我们对流动相的比例作了调整，分别在甲醇∶水＝70∶30，甲醇∶水＝80∶30两种流动相下按HPLC方法预试实验的方法，在大连依利特Hpersil柱(4.6×300mm)上作了两次实验，从实验的色谱峰图中可以看出，在大连依利特Hpersil柱(4.6×300)上，两种流动相都能使被检测成分丹参酮IIA达基线分离，峰形对称，但流动相甲醇∶水＝80∶30的色谱数据反应出阴性样品仍有一定干扰，而流动相为甲醇∶水＝70∶30的条件下做出的实验，则显示出阴性样品已完全没有干扰，缺点书甲醇∶水＝70∶30作流动相在大连依利特Hpersil柱(4.6×300mm)这样的长柱一上，保留时间偏长。

通过以上几次实验，申请人确定以甲醇∶水＝70∶30作HPLC法的流动相。

3.3分析柱的选择及理论塔板数的确定

由于用大连依利特Hpersi{柱(4.6×300mm)确定的甲醇∶水＝70∶30作流动相保留时间为37分钟，保留时间太长，理论塔板数太高，实验中考虑用Waters NOVA-PAK为填充剂的3.9×150nm柱与4.6×300mm色谱柱，按HPLC方法预试实验的方法进行实验，看在更换填充剂、缩短柱长的条件下，在满足分离条件的同时，能否将理论塔板数降下来，能否将保留时间缩短，以达到检测分板快速的目的。

从两次实验的色谱峰图可以看出，以Waters NOVA-PAK(3.9×150ram)柱实验，被检测峰低矮，峰形不对称，理论塔板数为3200，不能满足分离条件，而以Waters NOVA-PAK(4.6×300mm)柱作实验，从色谱图看，被检测峰基线分离好，峰形对称，保留时间为22分钟，理论塔板数为7200。

所以通过以上实验确定，将系统适用性的理论塔板数定为不低于7000。

4.检测条件的选择

4.1溶剂的选择

丹参药材中有效成分分为水溶性成分与脂溶性成分两类，脂溶性成分主要为结晶性蒽醌类化合物，有隐丹参酮，丹参酮I，丹参酮ⅡA、丹参酮ⅡB、丹参酮水溶性成分为丹参素、原儿茶醛、原儿茶酸。丹参脂溶性成分的提取文献材料与药典一致以甲醇作溶剂。所以本发明选取甲醇作溶剂。

4.2检测波长的选择

精密称取丹参酮ⅡA对照品0.00245g，置50ml量瓶中，甲醇溶解定容后，并稀释10倍，上普析Tu-1800spc，存250nm--290nm范围内进行扫描，丹参酮IIA对照品的最大吸收波为269.3nm，从而验证了中国药典方法和本发明选取270nm作为检测波长的一致性。

4.3对照品溶液的制备

本方法选取溶剂与中国药典一部丹参药材项标准一致，用甲醇作溶剂，制成16ug/ml的浓度(经预试该浓度下的吸收度A值符合药典规定，峰面积响应值适中)。

4.4供试品溶液的制备

根据溶剂的选择确定以甲醇作为供试品液的提取溶剂，由于原试行质量标准，供试品以索氏提取制备供试液的方法繁琐，所以申请人重点考查了回流提取及超声萃取制备供试液的方法。

4.4.1回流提取方式的考查

以中试样品040201作为供试品，去除糖衣后，研细，分别称取4份约0.7g的供试品入具塞锥瓶中，加甲醇50ml分别水浴回流1、2、3、4小时，以下按本发明测定方法，实验结果见表1。

表1

供试品称样量	0.6956(g)	0.6837(g)	0.6954(g)	0.7094(g)
					回流时间	1小时	2小时	3小时	4小时
丹参酮ⅡA含量	0.0924％	0.0920％	0.0914％	0.0910％

从表1数据看出，以甲醇作溶剂热回流，丹参酮ⅡA易于提出，1小时后丹参酮ⅡA已完全提出，随回流时间的延长，由于丹参酮ⅡA的热不稳定性，反而使检出值降低。

4.4.2超声萃取方式的考查

以中试样品040201作为供试品，去除糖衣后，研细，分别称取4份约0.7g的供试品入具塞锥瓶中，加甲醇50ml分别于超声仪上超声30分、1小、1.5小、2小时，以下按本发明测定方法，实验结果见表2。

表2

供试品称样量	0.7160(g)	0.7192	0.7179(g)	0.7214(g)
					萃取时间	30分	1小时	1.5小时	2小时
丹参酮ⅡA含量	0.0922％	0.0916％	0.0920％	0.0916％

从上表数据看出，用甲醇超声萃取30分钟能将丹参酮ⅡA完全提出，考虑到超声萃取与热回流两种提取方式比较，超声萃取更方便，提取时间更短；所以申请人确定以甲醇萃取30分钟作为供试品制备方法。

2.1.5线性关系的考查

精密称取丹参酮ⅡA对照品0.00278g，置50ml棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品的储备液。

精密吸取对照品的储备液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml，分别置10ml容量瓶中，加甲醇稀释定容。

分别取5种不同稀释浓度的丹参酮IIA对照品溶液各10ul，注入高效液相色谱仪中，按上述色谱条件进行分析，在270nm测定峰面积，结果见表3。

表3

浓度(ug/mg)	5.56	11.12	16.68	22.24	27.80
						峰面积(A)	387531	783042	1179620	1587332	1982478

丹参酮ⅡA浓度在0.0556-0.278ug范嘲内与响应值(峰面积)呈良好的线性关系，回归方程及相关系数：A＝1.39199 C+0.198867607，r＝0.99999(C为丹参酮ⅡA的浓度，单位g/ml，A为峰面积)，以浓度(μg/ml)为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。

2.1.6精密度试分别精密吸取对照品溶液(浓度为16.68ug/ml)，与供试品溶液(批号为040201)各10μl，按上述色谱条件连续进样5次，测定峰面积，结果见表4、表5。

表4 对照品精密度试验结果表

由表4可见：对照品连续进样5次，峰面积平均值为1196305，RSD＝..25％，表明对照品精密度良好

表5 六味生脉片样品精密度试验结果表

由表5可见：样品进样5次，峰面积平均值为1055935，RSD＝0.22％，表明样品精密度良好。

2.1.7稳定性试验

取批号为040201的样品，称取0.7001g，按供试品溶液的制备方法制备成供试液，与对照品溶液(浓度为19.28μg/ml)各取10ul，对照品溶液按1小时的时间间隔连续进样，样品溶液于1、2、4、8、16小时进样，记录色谱图，考查对照品及样品的稳定性，结果见表6、表7。

表6 对照品稳定性试验结果表

如表6所示，峰面积均值为1278303，RSD＝0.14％，表明对照品在6小时内测定稳定。

表7 六味生脉片样品溶液稳定性试验结果表

如表7所示，样品峰面积的平均值为981107，RSD＝0.1％，表明样品在16小时内稳定，在16小时内任一时间均可检测。

2.1.8重现性试验

取批号为040202的六味生脉片样品0.7g共5份，按样品分析方法进行测定，结果见表8。

表8 六味生脉片样品重现性试验结果表

如表8所示，该样品含量的平均值为0.146％，RSD＝0.97％，表明本发明提供的测定方法对六味生脉片的含量测定具有良好的重现性。

2.1.9加样回收率试验

称取混合均匀批号为040202的六味生脉片内容物5份，其含量为0.146％。按加入纯品量与所取样品含量之比1∶1加入对照品，按样品含量测定方法进行处理并测定，按下述公式计算回收率，结果见表9

计算式：

表9 加样回收率试验结果表

如表9所示，该方法的平均加样回收率为97.6％，RSD＝1.54％，可以看出该方法具有较好的可靠性。

2.1.10两种含量检测方法检测值之比

为了比较两种含量检测方法之间存在的方法差异，申请人以中试样品040204按原质量标准中的双波长薄层扫描法和新拟定的HPLC法进行多次含量测定，测定结果见表10。

表10 两种检测方法检测结果

NO

1

2

3

4

5

平均值

相对偏差

HPLC法

0.136％

0.134％

0.135％

0.134％

0.133％

0.134％

0.85％

双波长TLC法

0.141％

0.130％

0.137％

0.132％

0.140％

0.136％

3.56％

从表10可以看出，用拟定的HPLC法测定含量，经多次检测，其相对偏差为0.85％；而用原质量标准中的双波长薄层扫描法多次检测同一批产品含量，其相对偏差为3.56％。可见用原质量标准中的含量测定方法测定含量其重现性较差，而用HPLC法测定含量重同性好，更为准确。同时用HPLC法测定同一批产品其测定结果略低于双波长薄层扫描法测定结果。

本检测方法与原益寿康泰片的质量检测方法相比，将原来鉴别检查中专属性不强的显色反应取消，增加了人参及当归的专属性鉴别，并将丹参中丹参酮ⅡA的含量测定的供试品制备方式，由加热回流提取改为超声提取，测定方法由双波长薄层扫描提升为高效液相色谱法。

本发明的有效果益：

本发明的检测方法，所采用的鉴别方法专属性强、含量测定方法精密度高，重现性好，回收率高，供试品前处理简单，且超声提取使有效成份不发生降解，所采用的HPLC法也减小了原双波长薄层扫描测定中人为因素和实验材料对检测结果带来的误差，从而使产品药效成份的测定值更接近真实值，提高了对六味生脉片质量控制的有效性和质量控制标准，使其更能真实地反应产品的质量情况，提高了对六味生脉片产品质量的监控水准，从而保证了该六味生脉片剂生产成本的稳定可控和临床疗效。

具体实施方式

本六味生脉片剂的检测方法

【处方】丹参257g、人参32g、麦冬192g、五味子97g、当归97g、枸杞子160g。

【制法】以上六味，除丹参外，枸杞子等五味，用70％乙醇回流提取三次，第一次加4倍量提取3小时，第二、三次各加3倍量，各提取2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇，浓缩成相对密度为1.35～1.40(50℃)的稠膏；丹参用乙醇回流提取三次，第一次加4倍量提取3小时，第二、三次各加3倍量，各提取2小时，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇，浓缩成相对密度为1.35々1.40(50℃)的稠膏；合并上述两种稠膏，在70℃～80℃、-0.08Mpa条件下减压干燥，粉碎，加入淀粉适量混匀，制粒，干燥，加硬脂酸镁适量，压制成1000片，包薄膜衣，即得。

【性状】本品为薄膜衣片，除去薄膜衣后显棕色；气微香，味微甘、苦。

【鉴别】

(1)取本品5片，除去薄膜衣，研细，加丙酮10ml，回流提取2小时，滤过，滤液作为供试品溶液，另取丹参酮ⅡA对照品，加无水乙醇制成1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿为展开剂，展开，取出，晾干，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

(2)取本品20片，除去薄膜衣，研细，加乙醚30ml，超声提取15分钟，滤过，滤渣挥干乙醚，加甲醇30ml，超声提取15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加1％氢氧化钠溶液10ml使溶解，通过已处理好的D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5cm，长12cm)，用1％氢氧化钠溶液90ml洗脱，弃去碱液，继用水洗至洗脱液呈中性，弃去水液，再用20％乙醇溶液70ml洗脱，弃去20％乙醇溶液，最后用70％乙醇溶液100ml洗脱，收集70m％乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，取上清液作为供试品溶液，另取人参皂苷Rb1、Rg1、Re为对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液；吸取上述供试品溶液10μl、对照品溶液4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶甲醇∶水＝13∶7∶2，10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开约17cm，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃烘至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

(3)取本品10片，除去薄膜衣，研细，加乙醚20ml，超声提取15分钟，滤过，滤液挥干，残渣加醋酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液；另取当归对照药材0.5g，加乙醚5ml，超声提取15分钟，滤过，滤液作为对照药材溶液，吸取上述供试品溶液10μl、对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60~90℃)∶醋酸乙酯＝9∶1为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯光(365nm)下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

【检查】按中国药典2000年版一部片剂项下各项内容检查。

【含量测定】

丹参酮ⅡA的含量测定照高效液相色谱法(中国药典一部附录VID)测定

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇∶水＝70∶30为流动相，检测波长为270nm，理论板数按丹参酮ⅡA峰计算应不低于7000；精密称取丹参酮丹参酮ⅡA对照品10ml，置50ml棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取2ml，置25ml棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得对照品溶液(每1ml中含丹参酮ⅡA16μg)；取本品20片，除去薄膜衣，精密称定，研细，精密称取0.7g，置具塞磨口棕色三角瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声提取30分钟，放至室温，用甲醇补足减失的重量，过滤，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得，本品每片含丹参以丹参酮ⅡA计不得少于0.30mg。

Claims

1.一种六味生脉片剂的检测方法，所述六味生脉片剂由丹参257g、人参32g、麦冬192g、五味子97g、当归97g、枸杞子160g和适当铺料制备而成，该检测方法包括性状、检查、鉴别和含量测定项目；其特征在于：所述鉴别是对该制剂中丹参所含丹参酮ⅡA的薄层鉴别，人参所含人参皂苷的薄层鉴别，当归的薄层鉴别；所述含量测定是对制剂中丹参所含丹参酮ⅡA的含量测定：

2.根据权利要求1所述六味生脉片剂的检测方法，其特征在于：

具体的鉴别和含量测定包括：

(1)丹参酮ⅡA的成分鉴别

(2)人参皂苷的成分鉴别

取本品，除去包衣，研细，加乙醚，超声提取，滤过，滤渣挥干乙醚，加甲醇，超声提取，滤过，滤液蒸干，残渣加氢氧化钠溶液使溶解，通过已处理好的D₁₀₁型大孔吸附树脂柱，用氢氧化钠溶液洗脱，弃去碱液，继用水洗至洗脱液呈中性，弃去水液，再用乙醇溶液洗脱，弃去乙醇溶液，最后用乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，取上清液作为供试品溶液，另取人参皂苷Rb1、Rg1、Re对照品，加甲醇制成混合溶液，作为对照品溶液；吸取上述供试品溶液、对照品溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶甲醇∶水＝13∶7∶2，10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液，烘至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

(3)当归的鉴别

取本品，除去包衣，研细，加乙醚，超声提取，滤过，滤液挥干，残渣加醋酸乙酯使溶解，作为供试品溶液；另取当归对照药材，加乙醚，超声提取，滤过，滤液作为对照药材溶液，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚∶醋酸乙酯＝9∶1为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

(4)丹参酮ⅡA的含量测定

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇∶水＝70∶30为流动相，检测波长为270nm，理论板数按丹参酮ⅡA峰计算应不低于7000；精密称取丹参酮ⅡA对照品，置棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取，置棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得对照品溶液；取本品，除去包衣，精密称定，研细，精密称取，置具塞磨口棕色三角瓶中，精密加入甲醇，称定重量，超声提取，放至室温，用甲醇补足减失的重量，过滤，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入高效液相色谱仪，测定，即得，本品每片含丹参以丹参酮ⅡA计不得少于0.30mg。

3.根据权利要求2所述六味生脉片剂的检测方法，其特征在于：

更具体的鉴别和含量测定的方法包括

(1)丹参酮ⅡA的成分鉴别：

(2)人参皂苷的成分鉴别：

取本品20片，除去包衣，研细，加乙醚30ml，超声提取15分钟，滤过，滤渣挥干乙醚，加甲醇30ml，超声提取15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加1％氢氧化钠溶液10ml使溶解，通过已处理好的D₁₀₁型大孔吸附树脂柱，用1％氢氧化钠溶液90ml洗脱，弃去碱液，继用水洗至洗脱液呈中性，弃去水液，再用20％乙醇溶液70ml洗脱，弃去20％乙醇溶液，最后用70％乙醇溶液100ml洗脱，收集70％乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，取上清液作为供试品溶液，另取人参皂苷Rb1、Rg1、Re对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液；吸取上述供试品溶液10μl、对照品溶液4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿∶甲醇∶水＝13∶7∶2，10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开约17cm，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃烘至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

(3)当归的鉴别：

取本品10片，除去薄膜衣，研细，加乙醚20ml，超声提取15分钟，滤过，滤液挥干，残渣加醋酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液；另取当归对照药材0.5g，加乙醚5ml，超声提取15分钟，滤过，滤液作为对照药材溶液，吸取上述供试品溶液10μl、对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以沸点60～90℃石油醚∶醋酸乙酯＝9∶1为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

(4)丹参酮ⅡA的含量测定

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇∶水＝70∶30为流动相，检测波长为270nm，理论板数按丹参酮ⅡA峰计算应不低于7000；精密称取丹参酮ⅡA对照品10mg，置50ml棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取2ml，置25ml棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得每1ml中含丹参酮ⅡA16μg的对照品溶液；取本品20片，除去包衣，精密称定，研细，精密称取0.7g，置具塞磨口棕色三角瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声提取30分钟，放至室温，用甲醇补足减失的重量，过滤，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得，本品每片含丹参以丹参酮ⅡA计不得少于0.30mg。