CN111796034A - 一种食品中异麦芽酮糖的分离和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种食品中异麦芽酮糖的分离和检测方法，分离方法包括将样品分散在水中，去除蛋白后微孔过滤，滤液使用酰胺键合色谱柱分离，分离使用的流动相为乙腈/去离子水。本发明一些分离方法的实例，采用对糖分离能力相对更弱但是具有更好稳定性的酰胺键合色谱柱，配合特定的洗脱程序，能将样品中，如食品中蔗糖与异麦芽酮糖完全分离；异麦芽酮糖的检出线低至50μg/mL。本发明一些检测方法的实例，在50‑1000ug/mL内工作曲线线性良好，相关系数r2＝0.9993，回收率在89.3％～98.3％之间。精密度(n＝6)为2.18％～2.58％。同时其前处理简单，易于操作，检测限低，在线性范围内线性良好，相关系数高，测量结果精确度高，是检测食品中异麦芽酮糖的有效方法。
Description
技术领域
本发明涉及食品检测领域，特别涉及一种食品中异麦芽酮糖的分离和检测方法。
背景技术
异麦芽酮糖(α-D-吡喃葡萄糖基-1,6-D-果糖，Isomaltulose)，又称帕拉金糖，是一种葡 萄糖和果糖以α-1,6糖苷键结合形成的还原性二糖，天然存在于蜂蜜、甘蔗汁，及其工业制成 品糖蜜、糖浆中。它是蔗糖的一种同分异构体，具有与蔗糖相似的甜味特性，可作为一种健 康食品添加剂，替代蔗糖应用于食品工业中。异麦芽酮糖是蔗糖的同分异构体，难以分离， 蔗糖是检测食品中异麦芽酮糖的重要干扰物质。
目前糖检测时较常用的检测色谱柱是氨基柱，如：CN104849395A公开了一种食品中异 麦芽酮糖的检测方法，所述的检测方法的色谱条件为采用色谱柱Hypersil APS-2(NH2)柱，规 格为250mm×4.6mm×5μm；流动相为乙腈与去离子水的体积比为88∶12～85∶15，流速为 1mL/min；柱温为40；进样体积为10μL；检测器选用蒸检测发光散射检测器，氮气流速为 1.6L/min，雾化器温度为50℃，蒸发管温度为80℃。
又如甘宾宾,蒋世琼.高效液相色谱法测定帕拉金糖[J].化工技术与开发,2001,030(003):40-41.公开采用高效液相色谱法(HPLC),以Kromasil KR100-5NH2柱为分析柱,乙腈- 水(4:1)为流动相,示差折光仪为检测器,一次进样能同时测定样品中果糖、葡萄糖、蔗糖、帕拉 金糖等.方法变异系数为0.41％～0.85％,回收率为98.67％～101.7％,线性相关系数为0.99992～ 1.0000.最低检出限在微克级。
虽然氨基柱在糖类分析中有较高的灵敏度和分离的，但氨基溶液水解，当样品通过时， 水解产物可以与样品一同进入检测器检测造成干扰。在长时间的使用过程中，流动相通过氨 基柱时氨基基团会有脱落，存在噪声；当样品纯度不高时，噪声也会很大，氨基柱的柱效下 降很快。氨基柱的柱效下降是由氨基本身特性决定的，使用后的常规保养是起不到太大作用 的，所以导致氨基柱的使用寿命较短。同时，目前用于异麦芽酮糖检测的HPLC常采用反相 系统，在流动相的选择上，多选择乙腈和水作为流动相，通过乙腈与水的不同比例的混合达 到分离异麦芽酮糖的目的。但是在氨基柱-乙腈水系统的分析中，随着检测异麦芽酮糖数量的 增加，氨基柱的柱效下降，使异麦芽酮糖的检出线降低。为了保证检测精度，必需经常更换 氨基柱，导致检测成本较高。
因此，在保护柱子寿命的前提下，利用液相色谱法检测食品中的异麦芽酮糖含量的检测 最主要解决的是如何使食品中蔗糖与异麦芽糖完全分离问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种食品中异麦芽酮糖的分离和 检测方法。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
一种样品中异麦芽酮糖的分离方法，包括：
样品前处理：称取样品，用去离子水分散样品，加入蛋白沉淀剂，混匀静置后过滤，取 滤液，进一步使用微孔滤膜过滤，得到微孔滤液；
分离：将微孔滤液进行色谱分离，所使用的色谱柱为酰胺键合色谱柱，流动相为乙腈/去 离子水(V/V)为75:25；流速为1mL/min，柱温为35℃，将异麦芽酮糖分离。
在一些实例中，所述蛋白沉淀剂为亚铁氰化钾溶液和酸性乙酸锌溶液。
在一些实例中，所述酰胺键合色谱柱为Waters Xbridge Amide，5.0μm，4.6×250mm。
在一些实例中，使用示差折光检测器检测异麦芽酮糖的分离情况并根据分离度收集相应 的洗出液。
在一些实例中，所述分离方法包括：
样品前处理：秤取约0.1g样品于小烧杯中，用去离子水约5mL超声溶解样品后转移到 10mL容量瓶中，缓慢加入亚铁氰化钾溶液，酸性乙酸锌溶液各0.5mL，加去离子水定容到刻度，静置30min，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液约2mL，用0.45μm微孔滤膜过滤到样品瓶 子中，待上机测定；
机分离检测：设定色谱条件，色谱柱：Waters Xbridge Amide，5.0μm，4.6×250mm；流动 相为乙腈/去离子水(V/V)为75:25；流速为1mL/min；柱温为35℃，示差折光检测器温度 为30℃；进样体积为10μL，将上述样品瓶置于自动进样盘中进行分离检测。
在一些实例中，
本发明的第二个方面，提供：
一种异麦芽酮糖的检测方法，包括：
1)配置异麦芽酮糖标准溶液；
2)HPLC分析：使用HPLC确定异麦芽酮糖标准溶液浓度与峰面积之间的关系，绘制标 准曲线；HPLC的条件为：酰胺键合色谱柱，流动相为乙腈/去离子水(V/V)为75:25； 流速为1mL/min，柱温为35℃；
3)按本发明第一个方面的分离方法处理得到样品的微孔滤液；
4)将微孔滤液进行HPLC分析，确定异麦芽酮糖的含量。
在一些实例中，所述酰胺键合色谱柱为Waters Xbridge Amide，5.0μm，4.6×250mm。
在一些实例中，HPLC分析中，使用示差折光检测器进行检测。
在一些实例中，所述示差折光检测器的温度为30℃。
在一些实例中，HPLC分析时，进样体积为10μL。
本发明的有益效果是：
本发明一些分离方法的实例，采用对糖分离能力相对更弱但是具有更好稳定性的酰胺键 合色谱柱，配合特定的洗脱程序，能将样品中，如食品中蔗糖与异麦芽酮糖完全分离；异麦 芽酮糖的检出线低至50μg/mL。
本发明一些检测方法的实例，在50-1000ug/mL内工作曲线线性良好，相关系数r2＝0.9993， 回收率在89.3％～98.3％之间。精密度(n＝6)为2.18％～2.58％。同时其前处理简单，易于操 作，检测限低，在线性范围内线性良好，相关系数高，测量结果精确度高，是检测食品中异 麦芽酮糖的有效方法。
附图说明
图1示实施例1样品中异麦芽酮糖和蔗糖的分离检测的高效液相色谱图。
图2示实施例2样品中异麦芽酮糖的标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明并不仅仅局限于下述实施例。
本发明涉及的仪器与设备：
e2695HPLC(美国Waters公司)配示差折光检测器；
Waters Xbridge Amide(5.0μm,4.6x250mm,美国Waters公司)；
AL104天平(Mettler-Toledo公司)；
数控超声波清洗仪：KQ-500DE；
HC-2518离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)；
移液枪(10-100μL，20-200μL，200-1000μL，5000μL，Eppendorf公司)；
0.45μm滤膜(津腾公司)。
本发明所涉及的样品与试剂：
样品：糖果，饼干，饮料；
试剂：异麦芽酮糖，去离子水，亚铁氰化钾，乙酸锌均为分析纯。
实施例1：各种溶液的配制
异麦芽酮糖标准储备液的配制：准确秤取0.0100g(精确到0.0001g)异麦芽酮糖于小烧 杯中，加去离子水溶解后转移到10mL容量瓶中并定容，得到浓度为1.0000mg/mL的异麦芽 酮糖标准储备液。
乙酸锌溶液的配制：秤取22.00g乙酸锌(Zn(CH3COO)2·2H2O)溶于少量水中，加入3mL 冰乙酸，加水稀释到100mL。
亚铁氰化钾溶液的配制：秤取10.60g亚铁氰化钾(K4Fe(CN)6·3H2O)溶于水后稀释到 100ml。
异麦芽酮糖标准工作溶液的配制：用移液枪分别吸取上述异麦芽酮糖标准储备液0.3mL， 1.0mL，3.0mL，5.0mL，8.0mL于10.0mL容量瓶中，再分别以去离子水定容到刻度即得到浓度为0.03mg/mL，0.1mg/mL，0.3mg/mL，0.5mg/mL，0.8mg/mL的标准曲线工作溶液。
实施例2：仪器条件的选择
色谱柱：Waters Xbridge Amide，5.0μm，4.6×250mm；流动相为乙腈/去离子水(V/V)为 75:25；流速为1mL/min；柱温为35℃，示差折光检测器温度为30℃；进样体积为10μL。
实施例3：样品中异麦芽酮糖和蔗糖的分离检测
样品前处理：秤取约0.1g样品于小烧杯中，用去离子水约5mL超声溶解样品后转移到 10mL容量瓶中，缓慢加入亚铁氰化钾溶液，酸性乙酸锌溶液各0.5mL，加去离子水定容到刻度，静置30min，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液约2mL，用0.45μm微孔滤膜过滤到样品瓶 子中，待上机测定；
上机分离检测：设定色谱条件，色谱柱：Waters Xbridge Amide，5.0μm，4.6×250mm；流 动相为乙腈/去离子水(V/V)为75:25；流速为1mL/min；柱温为35℃，示差折光检测器温 度为30℃；进样体积为10μL，将上述样品瓶置于自动进样盘中进行分离检测。
检测结果如图1所示：异麦芽酮糖和蔗糖完全分离。
实施例4：样品中异麦芽酮糖含量的测定
制作标准曲线
将实施例1配制好的标准使用溶液在实施例2优化好的色谱条件下进行测定，按浓度 (ug/mL)与峰面积之间的关系绘制标准曲线，曲线方程为Area＝806465x+6914.2，r2＝0.9993， 标准曲线见图2。
线性范围、检出限
在空白样品中加入一定量的标准溶液，使异麦芽酮糖的峰高与噪音之比接近3(即S/N＝3)。 此浓度即为最低检测浓度。由实验可知，本方法的最低检测浓度为50ug/mL。
实施例5：回收率与精密度
取空白糖果，饮料各3个，分别加入高、中、低三个浓度水平的异麦芽酮糖，每个水平 做3个平行实验，分析回收率与精密度，结果见表1。
表1回收率与精密度
实施例6：样品测定
将实施例1处理好的样品，在实施例2色谱条件下，对3种样品的配料表标明含有异麦 芽酮糖的代表性溶液和标准溶液进行色谱分析。结果表明，在所测的3种样品中，都含有蔗 糖，异麦芽酮糖在糖果和饼干中检出，但饮料中未检出，其结果如表2所示：
表2样品的异麦芽酮糖检测结果
| 项目 | 糖果 | 饼干 | 饮料 |
| 异麦芽酮糖 | 32.56mg/mL | 26.79mg/mL | 未检出 |
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员 来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等 同替换、改进等，均应包含在本发明的包含范围之内。
Claims (10)
1.一种样品中异麦芽酮糖的分离方法，包括：
样品前处理：称取样品，用去离子水分散样品，加入蛋白沉淀剂，混匀静置后过滤，取滤液，进一步使用微孔滤膜过滤，得到微孔滤液；
分离：将微孔滤液进行色谱分离，所使用的色谱柱为酰胺键合色谱柱，流动相为乙腈/去离子水(V/V)为75:25；流速为1mL/min，柱温为35℃，将异麦芽酮糖分离。
2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：所述蛋白沉淀剂为亚铁氰化钾溶液和酸性乙酸锌溶液。
3.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：所述酰胺键合色谱柱为WatersXbridge Amide，5.0μm，4.6×250mm。
4.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：使用示差折光检测器检测异麦芽酮糖的分离情况并根据分离度收集相应的洗出液。
5.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：包括：
样品前处理：秤取约0.1g样品于小烧杯中，用去离子水约5mL超声溶解样品后转移到10mL容量瓶中，缓慢加入亚铁氰化钾溶液，酸性乙酸锌溶液各0.5mL，加去离子水定容到刻度，静置30min，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液约2mL，用0.45μm微孔滤膜过滤到样品瓶子中，待上机测定；
上机分离检测：设定色谱条件，色谱柱：Waters Xbridge Amide，5.0μm，4.6×250mm；流动相为乙腈/去离子水(V/V)为75:25；流速为1mL/min；柱温为35℃，示差折光检测器温度为30℃；进样体积为10μL，将上述样品瓶置于自动进样盘中进行分离检测。
6.一种异麦芽酮糖的检测方法，包括：
1)配置异麦芽酮糖标准溶液；
2)HPLC分析：使用HPLC确定异麦芽酮糖标准溶液浓度与峰面积之间的关系，绘制标准曲线；HPLC的条件为：酰胺键合色谱柱，流动相为乙腈/去离子水(V/V)为75:25；流速为1mL/min，柱温为35℃；
3)按权利要求1、2或5任一项所述的分离方法处理得到样品的微孔滤液；
4)将微孔滤液进行HPLC分析，确定异麦芽酮糖的含量。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述酰胺键合色谱柱为WatersXbridge Amide，5.0μm，4.6×250mm。
8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：HPLC分析中，使用示差折光检测器进行检测。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：所述示差折光检测器的温度为30℃。
10.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：HPLC分析时，进样体积为10μL。
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