CN103823006A - 一种乳粉中低聚果糖的高效液相色谱串联质谱检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及本发明涉及乳粉中低聚果糖的定量检测，提出一种是乳粉中低聚果糖的高效液相色谱串联质谱检测方法，其包括步骤：（1）制备标准溶液并进行高效液相色谱串联质谱检测，得不同浓度的混合标准溶液的标准谱图；（2）将步骤1获得的标准谱图按低聚果糖品种分别制作浓度与色谱峰面积关系曲线图；（3）乳粉样品的预处理及高效液相色谱串联质谱检测；（4）样品中的各低聚果糖的含量的确定，将步骤3中获得的样品谱图的保留时间确定低聚果糖品种并将其色谱峰面积与步骤2中得到的标准曲线比对，用插入法确定低聚果糖含量。采用本发明具有前处理过程简单，检测速度快，检测结果准确、灵敏度高的特点。

Description

一种乳粉中低聚果糖的高效液相色谱串联质谱检测方法

技术领域

本发明涉及乳粉中低聚果糖的定量检测，尤其是乳粉中低聚果糖的高效液相色谱串联质谱检测方法。

背景技术

低聚果糖(fructo-oligosacchrides，FOS)又名蔗果低聚糖、寡果糖，是低聚糖的一种。它是由蔗糖和1～4个果糖基通过β-1,2糖苷键与蔗糖中的D-果糖基结合而成的蔗果三糖(GF2)，蔗果四糖(GF3)、蔗果五糖(GF4)和蔗果六糖（GF5）及其混合物的总称。低聚果糖是一种天然活性物质，甜度为蔗糖的0.3~0.6倍。近年研究发现，低聚果糖具有良好的生理功能，如调节肠道菌群、增殖双歧杆菌、促进钙吸收、抗龋齿、调血脂等。低聚果糖在中国已经被国家食品药品监督局批准为保健食品，添加在乳制品、乳酸菌饮料、固体饮料、糖果、饼干、面包、果冻、冷饮等多种食品中。

将低聚果糖添加到乳粉中是提升乳粉功能的有效方法之一。尤其是婴幼儿乳粉，低聚果糖可以促进婴幼儿肠蠕动，促进肠道中有益菌生长，加速肠内废物和有害菌排出，防止腹泻，减少便秘等。现在国内市场上销售的婴幼儿乳粉大多标注添加低聚果糖，而添加“益生元”（低聚果糖）的广告也成为各大生产企业的主要宣传内容。显然，低聚果糖的含量应该作为乳粉中重要的质量指标，然而目前国内并没有完善成熟的乳粉中低聚果糖的检测标准，这使得相关指标的监管缺失，不利于保障乳制品的质量安全。因此，开发乳粉中低聚果糖的检测方法，并使其具备准确、高灵敏度的特点显得意义重大。

目前国内已发布的国家标准GB/T 23528-2009《低聚果糖》，标准中涉及了低聚果糖的检测方法，检测乳粉中的低聚果糖也有一些文献报道。这些方法主要利用高效液相色谱配示差检测器或蒸发光散射检测器达到检测的目的，检出限一般在1 mg/kg的数量级。然而，示差检测器或蒸发光散射检测器本身不能对低聚果糖进行定性，容易因为杂质干扰造成误差，可能导致结果误判。高效液相色谱串联质谱法使用二级串联的质谱作为检测器，低聚果糖的检出限可以达到0.01 mg/kg的数量级，检测灵敏度可显著提高。此外，二级质谱通过同时扫描待测化合物母离子分子离子峰和子离子分子离子峰的方式，达到针对不同低聚果糖的定性检测，检测准确性也显著增强。利用高效液相色谱串联质谱法对乳粉中低聚果糖的检测将有效地克服现有标准和文献方法的缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种乳粉中低聚果糖的高效液相色谱串联质谱检测方法，其克服现有技术不足，使检测结果更准确、灵敏。

本发明的目的可通过如下技术方案来实现：

一种乳粉中低聚果糖的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征包括以下步骤：

（1）制备标准溶液并进行高效液相色谱串联质谱检测

称取各种低聚果糖标准品并将其配成混合标准储备液；再将混合标准储备液用蒸馏水逐级稀释，分别配成至少5种不同浓度的混合标准溶液，将不同浓度的混合标准溶液进行高效液相色谱串联质谱检测并得到标准谱图，标准谱图中保留时间确定低聚果糖品种，色谱峰面积与对应的低聚果糖浓度成函数关系。

（2）将步骤1获得的标准谱图按低聚果糖品种分别制作浓度与色谱峰面积关系曲线图。

（3）乳粉样品进行预处理及高效液相色谱串联质谱检测

称取一定量的乳粉样品，依次加入蒸馏水和乙醇，涡旋振荡后，超声溶解，离心，取上清液稀释后过滤膜过滤，取滤液进行高效液相色谱串联质谱检测，得样品谱图。

（4）样品中的各低聚果糖的含量的确定

将步骤3获得的样品谱图的保留时间确定低聚果糖品种并将其色谱峰面积与步骤2对应的低聚果糖品种的标准曲线进行比对，用插入法确定样品中的各低聚果糖的含量。

优化方案是：步骤1中的不同浓度的混合标准溶液浓度从0.5 mg/L至20 mg/L分为6级，级间间隔由小至大大致倍增，每浓度级中各低聚果糖标准品含量相同。

在步骤1和2中，高效液相色谱串联质谱的实验条件如下：

色谱条件：

a)      色谱柱：XBridge TM Amide，3.5μm，4.6×150mm；

b)      进样量：5~20 μL；

c)      柱温：30~50℃；

d)     流速：0.3~0.6 mL/min；

e)      流动相和洗脱时间：

流动相A：30/70乙腈/水溶液含0.10%氨水；

流动相B：80/20乙腈/水溶液含0.10%氨水；

洗脱时间0~30 min，流动相A从100%到60%，流动相B从0%到40%；

洗脱时间30~32 min，流动相A保持60%，流动相B保持40%；

洗脱时间32~34 min，流动相A从60%到0%，流动相B从40%到100%；

洗脱时间34~35 min，流动相A保持0%，流动相B保持100%。

质谱条件：

a） 电离模式：负离子（ESI-）；

b）气帘气压力344.5 kPa，碰撞气压力中档，离子喷雾电压4500V，离子源温度550℃，雾化气压力344.5 kPa，辅助加热气压力344.5 kPa，接口加热器为开；

c） 扫描模式：多反应检测（MRM）模式。

与现有技术对比，本发明具有如下突出的实质性特点和显著进步：

高效液相色谱串联质谱法技术灵敏度高，选择性和特异性好，不仅可对乳粉中含有的各种低聚果糖进行定性确认，克服样品基质干扰，而且能够有效排除假阳性，进行乳粉中各种低聚果糖准确的定量分析。本发明的方法前处理操作简单、准确度好、精度高、线性良好，可用于开展乳粉中低聚果糖的测定，为乳粉中低聚果糖的质量监测提供了有效的技术支撑。 

附图说明

图1为婴幼儿配方乳粉的高效液相色谱质谱图：1-蔗果三糖，2-蔗果四糖，3-蔗果五糖，4-蔗果六糖。

图2为各浓度为5 mg/L的低聚果糖混合标准溶液的高效液相色谱串联质谱图：1-蔗果三糖，2-蔗果四糖，3-蔗果五糖，4-蔗果六糖。

图3为蔗果三糖的浓度与色谱峰面积关系标准曲线图。

图4为蔗果四糖的浓度与色谱峰面积关系标准曲线图。

图5为蔗果五糖的浓度与色谱峰面积关系标准曲线图。

图6为蔗果六糖的浓度与色谱峰面积关系标准曲线图。

具体实施方式

下面通过实例对本发明做进一步的描述，这些描述并不是对本发明内容进一步的限定。本领域的技术人员应理解，对本发明内容所做的等同替换或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。

一种乳粉中低聚果糖的高效液相色谱串联质谱检测方法，具体实施步骤如下（以一种婴幼儿乳粉为例）。

（1）制备标准溶液并进行高效液相色谱串联质谱检测

等量分别精确称取蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖各10mg 共置于100mL容量瓶中，用蒸馏水超声溶解定容至刻度作为混合标准储备液；将此混合标准储备液用蒸馏水逐级稀释，分别配成低聚果糖标准品浓度为20 mg/L、10 mg/L、5 mg/L、2 mg/L、1 mg/L和0.5 mg/L的混合标准溶液，浓度为5mg/L的1L混合标准溶液中含有蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖各5g，其余类推。

将不同浓度的混合标准溶液进行高效液相色谱串联质谱检测并得到标准图谱，即分别得到低聚果糖标准品浓度为20 mg/L、10 mg/L、5 mg/L、2 mg/L、1 mg/L和0.5 mg/L的混合标准溶液的保留时间与响应值之间对应的标准曲线图，保留时间确定低聚果糖品种，由响应值确定的色谱峰面积与对应的低聚果糖浓度成函数关系，其中浓度为5 mg/L混合标准溶液的高效液相色谱串联质谱图如图2所示，其它未示。

（2）将步骤1获得的标准谱图按低聚果糖品种分别制作浓度与色谱峰面积关系曲线图，图3为蔗果三糖的浓度与色谱峰面积关系标准曲线图；图4为蔗果四糖的浓度与色谱峰面积关系标准曲线图；图5为蔗果五糖的浓度与色谱峰面积关系标准曲线图；图6为蔗果六糖的浓度与色谱峰面积关系标准曲线图，如图3~图6所示。

各种低聚果糖的保留时间、标准曲线的线性情况和方法检出限如表1所示：

表1 各种低聚糖的保留时间、标准曲线和检出限

 。

（3）乳粉样品进行预处理及高效液相色谱串联质谱检测

称取婴幼儿乳粉样品1 g（精确至0.01 g）于50 mL比色管中，加入15 mL蒸馏水溶解（充分振荡），再加入无水乙醇定容至50 mL，涡旋振荡，超声溶解20 min，移取约30 mL该溶液于50 mL离心管中，以8000 r/min离心5~10 min，，精密移取上清液1 mL于10 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，过0.22 μm滤膜后，取滤液进行高效液相色谱串联质谱检测；谱图如图1所示。

（4）乳粉样品中的各低聚果糖的含量的确定

将步骤3获得的样品谱图的保留时间确定低聚果糖品种并将其色谱峰面积与步骤2对应的低聚果糖品种的标准曲线（图3~图6）进行比对，用插入法或表1中的公式确定样品中各种低聚果糖的浓度；本实施例的乳粉样品的蔗果三糖1.23 mg/L（保留时间18.93，色谱峰面积154320），蔗果四糖3.59 mg/L（保留时间21.28，色谱峰面积380350），蔗果五糖4.58 mg/L（保留时间23.18，色谱峰面积152408），蔗果六糖2.68 mg/L（保留时间2479，色谱峰面积71110）。

代入公式（1）可以算出婴幼儿乳粉低聚果糖的含量为：蔗果三糖650 mg/kg，蔗果四糖1795 mg/kg，蔗果五糖2290 mg/kg，蔗果六糖1340 mg/kg。

式中：

X _i ——试样中低聚果糖（i）的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；

c_i——试样中低聚果糖（i）响应值对应的浓度，单位为毫克每升（mg/L）；

V——试样定容体积，单位为毫升（mL）；

m——试样的质量，单位为克（g）；

f——稀释倍数。

在步骤1和2中，高效液相色谱串联质谱的实验条件如下：

色谱条件：

a)      色谱柱：XBridge TM Amide，3.5μm，4.6×150 mm；

b)      进样量：5 μL；

c)      柱温：40℃；

d)     流速：0.4 mL/min；

e)      流动相和洗脱时间：

流动相A：30/70乙腈/水溶液含0.10% 氨水；

流动相B：80/20乙腈/水溶液含0.10% 氨水；

0~30min，流动相A从100%到60%，流动相B从0%到40%；

30~32min，流动相A保持60%，流动相B保持40%；

32~34min，流动相A从60%到0%，流动相B从40%到100%；

34~35min，流动相A保持0%，流动相B保持100%。

质谱条件：

a） 电离模式：负离子（ESI-）；

b）气帘气压力344.5 kPa，碰撞气压力中档，离子喷雾电压4500 V，离子源温度550℃，雾化气压力344.5 kPa，辅助加热气压力344.5 kPa，接口加热器为开；

c） 扫描模式：多反应检测（MRM）模式，各种低聚糖的质谱参数如表2所示。

表2 四种低聚果糖的定性离子对、定量离子对、去簇电压和碰撞气能量：

。

Claims (3)

1.一种乳粉中低聚果糖的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征包括以下步骤：

（1）制备标准溶液并进行高效液相色谱串联质谱检测

称取各种低聚果糖标准品并将其配成混合标准储备液，再将混合标准储备液用蒸馏水逐级稀释，分别配成至少5种不同浓度的混合标准溶液，将不同浓度的混合标准溶液进行高效液相色谱串联质谱检测并得到标准谱图，标准谱图中保留时间确定低聚果糖品种，色谱峰面积与对应的低聚果糖浓度成函数关系；

（2）将步骤1获得的标准谱图按低聚果糖品种分别制作浓度与色谱峰面积关系曲线图；

（3）乳粉样品的预处理及高效液相色谱串联质谱检测

称取一定量的乳粉样品，依次加入蒸馏水和乙醇，涡旋振荡后，超声溶解，离心，取上清液稀释后过滤膜过滤，取滤液进行高效液相色谱串联质谱检测，得样品谱图；

（4）样品中的各低聚果糖的含量的确定

将步骤3中获得的样品谱图的保留时间确定低聚果糖品种并将其色谱峰面积与步骤2对应的低聚果糖品种的标准曲线进行比对，用插入法确定样品中的各低聚果糖的含量。

2.根据权利要求1 所述的乳粉中低聚果糖的检测方法，其特征在于：步骤1中不同浓度的混合标准溶液浓度从0.5 mg/L至20 mg/L分为6级，级间间隔由小至大大致倍增，每浓度级中各低聚果糖标准品含量相同。

3.根据权利要求1或2 所述的乳粉中低聚果糖的检测方法，其特征在于，在步骤1和2中高效液相色谱串联质谱的检测条件是：

色谱条件：

a)色谱柱：XBridge TM Amide，3.5μm，4.6×150mm；

b)进样量：5~20 μL；

c)柱温：30~50℃；

d)流速：0.3~0.6 mL/min；

e)流动相和洗脱时间：

流动相A：30/70乙腈/水溶液含0.10%氨水；

流动相B：80/20乙腈/水溶液含0.10%氨水；

洗脱时间0~30 min，流动相A从100%到60%，流动相B从0%到40%；

洗脱时间30~32 min，流动相A保持60%，流动相B保持40%；

洗脱时间32~34min，流动相A从60%到0%，流动相B从40%到100%；

洗脱时间34~35min，流动相A保持0%，流动相B保持100%；

质谱条件：

a)电离模式：负离子（ESI-）；

b)气帘气压力344.5 kPa，碰撞气压力中档，离子喷雾电压4500V，离子源温度550℃，雾化气压力344.5 kPa，辅助加热气压力344.5 kPa，接口加热器为开；

c)扫描模式：多反应检测（MRM）模式。

Images