CN107604041A - 一种麻类果胶中甲氧基含量的测定方法 - Google Patents

一种麻类果胶中甲氧基含量的测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种麻类果胶中甲氧基含量的测定方法，该方法采用麻类果胶酯酶水解果胶酯键，通过酸碱滴定测定得到其甲氧基的含量，具体包括：S1、将麻类果胶溶解于去离子水中，并加入第一碱性溶液中和其游离羧基，得到果胶溶液；S2、将麻类果胶酯酶加入到步骤S1中所得的果胶溶液中，控制水解温度为35‑45℃，水解时间为20‑40min，得到麻类果胶酶解液；S3、向步骤S2中所得的麻类果胶酶解液中加入第二碱性溶液，发生酸碱中和反应，通过第二碱性溶液的消耗量计算麻类果胶中甲氧基的含量，该测定方法采用酶解法替代传统的浓碱皂化反应水解果胶酯键，具有水解专一性强、效率高、作用条件温和、供试样品用量少等优点。

Description

一种麻类果胶中甲氧基含量的测定方法
技术领域
本发明涉及生物化学技术领域，更具体地，涉及一种麻类果胶中甲氧基含量的测定方法。
背景技术
果胶是存在于植物细胞壁中的一种结构复杂的聚合物。目前商品果胶的原料主要是柑橘皮、柠檬皮和苹果皮，而麻类果胶由于其独特的成分而含有较高药用价值与经济价值，未来具有潜在的发展前景。
果胶的结构主要以α-D-1和4-GalA为基本组成单元，且GalA的羧基有不同程度的甲酯化(-COOCH3)。酯化度(DE)是果胶理化性质分析的一项常规指标，不同的酯化度影响着果胶产品的溶解性、凝胶性、稳定性以及乳化性，是决定其凝胶机理的一个主要因素。依据酯化度差别，商品果胶可以分为低甲氧基果胶(低酯果胶)和高甲氧基果胶(高酯果胶)两种，酯化度高于50％(即甲氧基含量为7％-16.3％)的果胶为高酯果胶，反之，酯化度低于50％(即甲氧基含量DM小于7％)的果胶为低酯果胶。
目前果胶酯化度的测定方法包括：滴定法、分光光度法、气相色谱法、高效液相色谱法、红外光谱法、拉曼光谱法、核磁共振法、基质辅助激光解串联飞行时间质谱法等。其中，最常用的方法为皂化滴定法，其具有操作简便、重复性好、稳定性强等优点；而包括分光光度法、气相色谱法、高效液相色谱法等在内的其余方法都需要价格昂贵的仪器设备，测定成本高，应用推广难。然而，值得注意的是，皂化滴定法也存在一些诸如测试样品用量大和操作过程中涉及强酸和强碱的使用等的明显不足，从而极大制约了其在甲氧基含量的测定中的应用。
综上所述，在现有测试理论及研究成果的基础上，克服现有果胶酯化度的测定方法中所存在的缺陷，研究开发一种绿色、环保、高效、专一的麻类果胶中甲氧基含量的测定方法具有重要的理论和实际意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种麻类果胶中甲氧基含量的测定方法。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种麻类果胶中甲氧基含量的测定方法，包括，采用麻类果胶酯酶水解果胶酯键，通过酸碱滴定测定水解得到的羧基含量，推算其甲氧基的含量。生物法水解果胶酯键较化学法的皂化反应作用而言条件温和，反应效率高。
在上述技术方案中，所述测定方法包括如下步骤：
S1、将麻类果胶溶解于无CO2的去离子水中，并加入第一碱性溶液中和麻类果胶中的游离羧基，得到果胶溶液；
S2、将麻类果胶酯酶加入到步骤S1中所得的果胶溶液中，控制水解温度为35-45℃，水解时间为20-40min，得到麻类果胶酶解液；
S3、向步骤S2中所得的麻类果胶酶解液中加入第二碱性溶液，发生酸碱中和反应，通过第二碱性溶液的消耗量计算麻类果胶中甲氧基的含量。
进一步地，在上述技术方案中，步骤S1中，所述第一碱性溶液为0.05mol/L的NaOH溶液，所述果胶溶液的浓度为3-5mg/ml。
其中，果胶溶液的浓度过高，会导致溶液的黏度太大，不利于碱中和及后续的水解反应，测得的数据不准确；果胶溶液的浓度过低，碱的消耗量不够，降低滴定的灵敏度。
再进一步地，在上述技术方案中，步骤S1中，具体包括：称取80mg麻类果胶粉，加入无CO2的去离子水，搅拌溶解后用20mL容量瓶定容，随后滴加5滴酚酞，用0.05mol/L的NaOH溶液滴定至微红色，得到游离羧基已被完全中和的果胶溶液。
其中，采用适量的NaOH封闭麻类果胶中的游离-COOH，避免对酯基水解产生的-COOH测定造成干扰。
在上述技术方案中，步骤S2中，所述麻类果胶酯酶为麻类脱胶酯酶基因(GenBank登录号：KC422449)，并构建了基因工程菌株(pEASY-E1-243/BL21)，将其诱导表达生产的果胶酯酶。该果胶酯酶基因是从麻类脱胶高效菌种DCE-01中克隆的，其表达的果胶酯酶对麻类作物纤维原料的果胶底物酯键水解具有高效性。
进一步地，在上述技术方案中，步骤S2中，所述水解温度为38-42℃，水解时间为25-35min。其中，天然果胶酯酶的作用条件温和，有利于保护果胶的其他官能团。
再进一步地，在上述技术方案中，步骤S2中，具体包括：将步骤S1中所得的果胶溶液置于40℃的水浴中平衡5.0min，加入50U的麻类果胶酯酶，在40℃下水解30min后，煮沸灭活，得到麻类果胶酶解液。根据果胶溶液的量，添加一定的麻类果胶酯酶，水解合适的时间，保证果胶甲酯键水解完全。
在上述技术方案中，步骤S3中，所述第二碱性溶液为0.02mol/L的NaOH溶液。采用弱碱液滴定，能将碱液的消耗量控制在有效范围内。
进一步地，在上述技术方案中，步骤S3中，具体包括：向步骤S2中所得的麻类果胶酶解液中滴加5滴酚酞，用0.02mol/L的NaOH溶液滴定至微红色，记录NaOH溶液的滴定消耗量，计算麻类果胶中甲氧基的含量。步骤S3中滴定消耗的NaOH物质的量，等于甲酯键水解生成的羧酸的物质的量，就是生成甲氧基的物质的量。
再进一步地，在上述技术方案中，步骤S3中，甲氧基的含量为：
其中，v为NaOH溶液的滴定消耗量(ml)，m为麻类果胶酶解液中所含麻类果胶的质量(mg)，0.02为NaOH溶液的物质的量浓度，31为甲氧基的分子量。
本发明的优点：
(1)本发明通过采用麻类果胶酯酶催化麻类果胶酯键水解，具有专一性强、作用条件温和、水解效率高等优点。
(2)本发明的测定方法通过采用麻类果胶酯酶水解和酸碱滴定组合的方法，测定麻类果胶中甲氧基的含量，具有对仪器设备要求不高、操作简单、结果准确、重复性好等优点，具有重要的理论和实际意义。
附图说明
图1为本发明实施例所提供的一种麻类果胶中甲氧基含量的测定方法的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。
本发明所用原料均为硫酸铵沉淀法制备的麻类果胶。
一种麻类果胶中甲氧基含量的测定方法，包括以下步骤：
S1、称取80mg麻类果胶粉(工业大麻果胶、苎麻果胶、黄麻果胶、红麻果胶任意一种)，加入15ml无CO2的去离子水，置于40℃的水浴中，采用磁力搅拌器在400rpm下搅拌6h，用20mL的容量瓶定容，再滴加4-6滴酚酞指示剂，最后用0.05mol/L的NaOH溶液滴定至微红色，将游离的羧基完全中和，得到果胶溶液；
S2、将步骤S1中所得的果胶溶液置于40℃的水浴中平衡5.0min，加入50U的麻类果胶酯酶液，在40℃下水解30min后，煮沸灭活，终止水解反应，得到麻类果胶酶解液；
具体地，上述麻类果胶酯酶液的制备包括：移取100μL甘油管保存的基因工程菌株pEASY-E1-243/BL21接种至含有100μg/mL氨苄青霉素的5.0mL LB试管液中，置于37℃摇床220r/min培养15-18h；取0.5mL菌液接种至含有100μg/mL氨苄青霉素的50.0mL LB培养基中，置于37℃摇床220r/min培养，当其OD600达到0.6左右时，向菌液中添加IPTG至终浓度1.0mmol/L，置于25℃摇床120r/min诱导培养21h；取诱导培养后的菌液置于离心机5000r/min离心10min，上清液即为麻类果胶酯酶液；
S3、向步骤S2中所得的麻类果胶酶解液中滴加4-6滴酚酞指示剂，用0.02mol/L的NaOH溶液滴定至微红色，记录NaOH溶液的滴定消耗量，采用下式计算麻类果胶中甲氧基的含量：
其中，v为NaOH溶液的滴定消耗量(ml)，m为麻类果胶酶解液中所含麻类果胶的质量(mg)。
实施例一种麻类果胶中甲氧基含量的测定方法
本实施例采用上述测定方法，分别测定工业大麻果胶、苎麻果胶、黄麻果胶和红麻果胶中的甲氧基的含量，具体测试过程如上所述，在此不再赘述。
如下表1所示为实施例所测得的四种麻类果胶的甲氧基含量的测定结果。
表1本发明实验例所测得的四种麻类果胶的甲氧基含量的测定结果
对比例采用传统的皂化滴定法测量麻类果胶的酯化度
本对比例采用传统的皂化滴定法分别测定工业大麻果胶、苎麻果胶、黄麻果胶和红麻果胶的酯化度，具体测量过程如下：
分别称取0.2g待测果胶样品于250mL锥形瓶中，用少许乙醇润湿后，加入40mL 40℃新制无二氧化碳水，用瓶塞塞紧后振摇，使样品全部溶解；待样品全部溶解后，加入5滴酚酞指示剂，用0.1mol/L NaOH标准溶液进行滴定，记录所消耗的NaOH体积(空白和样品分别记为V0和V1)，即为初滴定度；向样液中加入8mL浓度为0.5mol/L的NaOH溶液，剧烈振摇15min后，加入8mL浓度为0.5mol/L的HCl溶液酸化，加入3滴酚酞指示剂，再次用0.1mol/L NaOH标准溶液进行滴定，样品消耗NaOH体积记为V2，由下列公式计算果胶酯化度：
表2本发明对比例例所测得的四种麻类果胶的酯化度的测定结果
结合表1和表2的数据表明：从四种麻类作物获得的果胶用酶解-滴定法测得的甲氧基含量和传统皂化-滴定法测得的酯化度结论一致，均属于高酯果胶。
为了验证两种酯化度测定方法的一致性，采用Sigma公司标准品进行测试。
表3本发明橘子果胶标准品(Sigma)酯化度的测定结果
表3结果表明：聚半乳糖醛酸钠的酯化度和甲氧基含量均为0；橘子果胶1和橘子果胶2测得的酯化度和甲氧基均为高酯果胶，符合实际酯化度。因此，标准的商业化果胶酯化度测定也验证了该方法的准确性。
最后，以上仅为本发明的较佳实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种麻类果胶中甲氧基含量的测定方法，其特征在于，包括，采用麻类果胶酯酶水解果胶酯键，通过酸碱滴定测定水解得到的羧基含量，推算其甲氧基的含量。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将麻类果胶溶解于无CO2的去离子水中，并加入第一碱性溶液中和麻类果胶中的游离羧基，得到果胶溶液；
S2、将麻类果胶酯酶加入到步骤S1中所得的果胶溶液中，控制水解温度为35-45℃，水解时间为20-40min，得到麻类果胶酶解液；
S3、向步骤S2中所得的麻类果胶酶解液中加入第二碱性溶液，发生酸碱中和反应，通过第二碱性溶液的消耗量计算麻类果胶中甲氧基的含量。
3.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于，步骤S1中，所述第一碱性溶液为0.05mol/L的NaOH溶液，所述果胶溶液的浓度为3-5mg/ml。
4.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于，步骤S1中，具体包括：称取80mg麻类果胶粉，加入无CO2的去离子水，搅拌溶解后用20mL容量瓶定容，随后滴加5滴酚酞，用0.05mol/L的NaOH溶液滴定至微红色，得到游离羧基已被完全中和的果胶溶液。
5.根据权利要求2-4任一项所述的测定方法，其特征在于，步骤S2中，所述麻类果胶酯酶为麻类脱胶酯酶基因(GenBank登录号：KC422449)，并构建了基因工程菌株(pEASY-E1-243/BL21)，将其诱导表达生产的果胶酯酶。
6.根据权利要求2-5任一项所述的测定方法，其特征在于，步骤S2中，所述水解温度为38-42℃，水解时间为25-35min。
7.根据权利要求2-6任一项所述的测定方法，其特征在于，步骤S2中，具体包括：将步骤S1中所得的果胶溶液置于40℃的水浴中平衡5.0min，加入50U的麻类果胶酯酶，在40℃下水解30min后，煮沸灭活，得到麻类果胶酶解液。
8.根据权利要求2-7任一项所述的测定方法，其特征在于，步骤S3中，所述第二碱性溶液为0.02mol/L的NaOH溶液。
9.根据权利要求8所述的测定方法，其特征在于，步骤S3中，具体包括：向步骤S2中所得的麻类果胶酶解液中滴加5滴酚酞，用0.02mol/L的NaOH溶液滴定至微红色，记录NaOH溶液的滴定消耗量，计算麻类果胶中甲氧基的含量。
10.根据权利要求9所述的测定方法，其特征在于，步骤S3中，甲氧基的含量为：
<mrow> <mfrac> <mrow> <mi>v</mi> <mo>&amp;times;</mo> <mn>0.02</mn> <mo>&amp;times;</mo> <mn>31</mn> </mrow> <mi>m</mi> </mfrac> <mo>&amp;times;</mo> <mn>100</mn> <mi>%</mi> <mo>,</mo> </mrow>
其中，v为NaOH溶液的滴定消耗量(ml)，m为麻类果胶酶解液中所含麻类果胶的质量(mg)。
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