CN114720704A - 一种测定血清中游离睾酮的试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于激素检测技术领域,涉及一种测定血清中游离睾酮的试剂盒及方法。针对血清样本中游离睾酮含量极低,现有技术中质谱法直接检测灵敏度不高的技术问题,本申请提供一种测定血清中游离睾酮的试剂盒,能快速简便准确的检测出血清中痕量的游离睾酮,定量下限可达0.25pg/mL,所述试剂盒中包含添加剂,用于配制流动相,便于操作和运输。本申请还提供了一种测定血清中游离睾酮的方法,采用超滤和液液萃取前处理,结合超高效液相色谱串联质谱,操作快速简便。
Description
技术领域
本发明属于激素检测技术领域,具体地,涉及一种测定血清中游离睾酮的试剂盒及方法。
背景技术
睾酮激素在人体血液中主要与性腺激素球蛋白或白蛋白以结合态的形式存在,游离的睾酮激素不到总睾酮含量的2%,游离的睾酮激素更具有临床意义上的生理活性。目前国内测定人体血清中的游离睾酮的含量主要为化学发光法免疫法,但由于免疫分析法中同一抗体可能与多种抗原发生反应使得这种方法特异性低,容易受干扰,导致准确度不足,而且该方法的灵敏度低,无法满足低浓度的游离睾酮的测定。运用质谱技术检测能显著提高游离睾酮检测的灵敏度和准确度。目前质谱测游离的睾酮的方法主要采用平衡透析法,如中国专利申请公布号CN113390978A,发明名称为“平衡透析合并LC-MS/MS技术测定人血清样本中游离睾酮含量的分析方法”,公开的方法通过将96孔板自行组装成96孔高通量平衡透析装置,实现高通量平衡透析装置的重复使用,从而降低透析成本;通过加热衍生化,实现平衡透析过程的质控和增强游离睾酮离子化效率;同时进一步优化了流动相和洗脱程序;使检测灵敏度显著提升至1pg/mL,实现更简单、低成本、高灵敏度、高准确性地检测游离睾酮,满足了临床对于女性低游离睾酮含量精准检测的需求。但该方法衍生化后以直接进样的方式,样品进入质谱前没有通过进一步的分离和提取来去除基质,且未完全衍生化的试剂可能带来的干扰,加大了对质谱检测过程污染的风险。另外,由于平衡透析耗时较长,无法满足临床样本快速检测的需求。平衡透析过程中容易发生体积迁移效应或Donnan效应,均会引起不均匀的带电荷使透析膜两侧的离子浓度不一致,影响平衡透析液的浓度,使最终的检测结果不准确。而女性血清中的游离睾酮的含量极低,参考区间在0.6-10.8pg/mL,而现有文献的质谱法测定游离睾酮的含量定量下限最低只能达到1pg/mL,无法满足临床样品的精准检测需求
中国专利申请公布号CN113049719A,发明名称为“一种检测游离睾酮的方法及试剂盒”,公开的方法将检测样品超滤、固相萃取再进行高效液相色谱串联质谱分析,用检测样品上清液、标准曲线样品上清液、质控样品上清液的色谱峰面积和内标的色谱峰面积比值对校正标样中分析物的浓度进行线性回归,计算游离睾酮含量,该方案所需样本体积小、无需衍生化处理、灵敏度高、检测限低。但是,血清样本中游离睾酮含量极低,化合物极性都较小,在质谱中ESI和APCI源中离子化效率不高,直接检测的灵敏度不高,该方案中0.01ng/mL的检测限依然有进一步改进的空间。
发明内容
1、要解决的问题
针对血清样本中游离睾酮含量极低,现有技术中质谱法直接检测灵敏度不高的技术问题,本申请提供一种测定血清中游离睾酮的试剂盒,能快速简便准确的检测出血清中痕量的游离睾酮,定量下限可达0.25pg/mL,所述试剂盒中包含添加剂,用于配制流动相,便于操作和运输。本申请还提供了一种测定血清中游离睾酮的方法,采用超滤和液液萃取前处理,结合超高效液相色谱串联质谱,操作快速简便。
2、技术方案
为达到上述目的,提供的技术方案为:
本发明的一种测定血清中游离睾酮的试剂盒,所述试剂盒包括以下组分:校准品、质控品、内标准品、活化液、缓冲液、萃取剂、复溶液和添加剂。
进一步的,所述添加剂为氟化铵、甲酸铵或乙酸铵中的一种或几种。
进一步的,所述萃取剂为甲基叔丁基醚、乙酸乙酯或二氯甲烷中的一种或几种。
进一步的,所述缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液或碳酸盐缓冲液中的一种或几种。
进一步的,所述校准品为睾酮;所述内标准品为睾酮-d3。
优选的,所述校准品为睾酮;所述内标准品为睾酮-d3;所述活化液为0.1mol/L的氢氧化钠溶液;所述复溶液为0~100%甲醇。
一种测定血清中游离睾酮的方法,使用所述的试剂盒,包括如下步骤:
用缓冲液将血清样品稀释的步骤,得稀释样品;
将所述稀释样品超滤的步骤,得超滤液;
用萃取剂将所述超滤液萃取的步骤,得萃取液;
将所述萃取液氮吹的步骤,得氮吹样品;
用复溶液将所述氮吹样品复溶的步骤,得上清液;
将所述上清液离心后,用高效液相色谱串联质谱检测的步骤。
优选的,取300μL血清样品加入900μL缓冲液,用移液枪吹打混匀后静置5min。
优选的,取1mL稀释后的血清样品加入超滤管中,在2000g、25℃条件下离心1h,取600μL样品超滤液和标准曲线样品和质控样品加入30μL内标工作液混合后,加入800μL萃取液,涡旋离心后,取650μL上层清液氮气吹干,100μL复溶液复溶后,取10μL上清直接进样。
优选的,用活化剂将未使用的超滤管进行活化,接着用纯水清洗一次的步骤,得活化后的超滤管。取100μL活化液于超滤管中在25℃,2000g条件下离心6min,接着向超滤管中加入100μL纯水在相同条件下离心6min。
进一步的,所述血清样品和缓冲液以1:3的比例稀释。
进一步的,所述高效液相色谱串联质谱检测的步骤中使用流动相;所述流动相包括流动相A和流动相B,所述流动相A为添加剂溶于纯水溶液中;所述添加剂为氟化铵溶液、甲酸铵或乙酸铵中的一种或几种。
优选的,添加剂的最终浓度为0~5mM,更优选的为0.5mM。
进一步的,
所述高效液相色谱条件为:进样器温度:8℃;柱温:40℃;运行时间:4min;
洗脱梯度:
优选的,所述流动相B:甲醇溶液。
所述质谱条件为:多反应监测参数表格:
扫描模式:多反应离子检测,正离子模式;毛细管电压:3kV;脱溶剂温度:550℃;脱溶剂气:800L/hr;锥孔气:150L/hr。
3、有益效果
采用本发明提供的技术方案,与已有的公知技术相比,具有如下有益效果:
(1)本发明的一种测定血清中游离睾酮的试剂盒,采用超滤法和液液萃取的方法对血清中游离的睾酮进行提取和富集,去除分析过程中的绝大多的基质干扰和杂质而降低了检测限的浓度,使得检测的定量下限能降至0.25pg/mL,能满足女性血清极低的游离睾酮浓度检测需求,运用该试剂盒可以用来检测病人的血液中游离睾酮的含量,来筛查雄激素过多以及雄激素缺乏等引起的相关疾病,特别是针对女性的多囊卵巢综合征,有更准确的临床参考和诊断价值。
(2)本发明的一种测定血清中游离睾酮的方法,采用超滤和液液萃取前处理,结合超高效液相色谱串联质谱法能快速简便准确的检测出血清中痕量的游离睾酮,方法的特异性强,减少了分析过程中的干扰。运用超滤法能够快速的分离出游离的睾酮,再对超滤液进行液液萃取进行提取富集来提高了检测的灵敏度,而避免了使用复杂的衍生化方法或固相萃取方法来提高信号响应,样品处理步骤更为简单便捷,更易于操作。还避免了现有技术中免疫法的灵敏度和准确度都不足,特异性低的缺陷。
运用超滤法能快速的分离出游离的睾酮,减少了样品处理的时间,运用液液萃取对超滤液进行提取和富集,无需衍生化,操作简单便捷,降低了实验成本,能将人体血清中游离睾酮的定量下限降至0.25pg/mL,比现有文献的报道的低了4倍以上。
附图说明
图1为实施例12的色谱图。
图2为实施例12的标准曲线图。
具体实施方式
为进一步了解本发明的内容,结合实施例对本发明作详细描述。
实施例1
本实施例的一种测定血清中游离睾酮的试剂盒,所述试剂盒包括以下组份:
表1一种测定血清中游离睾酮的试剂盒的组份
本实施例中:
组份1的校准品和组分2的质控品均为睾酮;
组分3的内标准品为睾酮-d3;
组分5的缓冲液的pH为7.4;
组分7的浓度为0.5mM。
本实施例的试剂盒,采用超滤法和液液萃取的方法对血清中游离的睾酮进行提取和富集,去除分析过程中的绝大多的基质干扰和杂质而降低了检测限的浓度,使得检测的定量下限能降至0.25pg/mL。使用前将添加剂溶于纯水中即得流动相A,便于操作、储存和运输。
实施例2
本实施例的一种测定血清中游离睾酮的试剂盒,基本同实施例1,不同的是,萃取剂为乙酸乙酯。
表2一种测定血清中游离睾酮的试剂盒的组份
本实施例中,组分5的缓冲液的pH为7.4。
实施例3
本实施例的一种测定血清中游离睾酮的试剂盒,基本同实施例1,不同的是,萃取剂为二氯甲烷。
表3一种测定血清中游离睾酮的试剂盒的组份
本实施例中,组分5的缓冲液的pH为7.4。
实施例1、2、3的萃取剂,均可以在样品超滤后,萃取出睾酮分析物,进行LC-MS/MS分析,通过比较睾酮的峰面积和信号强度,均可以满足检测要求,提取效率依次为甲基叔丁基醚≥乙酸乙酯>二氯甲烷,其中甲基叔丁基醚萃取的峰面积最大,可以使血清中游离睾酮的定量下限达到0.25pg/mL。同时,还测试了其他萃取液(三氯甲烷、正己烷),结果表明,其他萃取液萃取游离睾酮,其定量下限均高于0.6pg/mL,无法满足临床女性标本的检测要求。
实施例4
本实施例的一种测定血清中游离睾酮的试剂盒,基本同实施例1,不同的是,添加剂为甲酸铵。
表4一种测定血清中游离睾酮的试剂盒的组份
实施例5
本实施例的一种测定血清中游离睾酮的试剂盒,基本同实施例1,不同的是,添加剂为为乙酸铵。
表5一种测定血清中游离睾酮的试剂盒的组份
通过实施例1、4、5的添加剂,优化其浓度,均可以在样品上清液进行LC-MS/MS分析,得到很好地峰形和分离效果,通过比较睾酮的峰面积和信号强度,均可以满足检测要求,检测信号强度依次为氟化铵>甲酸铵>乙酸铵,其中氟化铵作为添加剂的峰面积最大,可以使血清中游离睾酮的定量下限达到0.25pg/mL。同时,还测试了其他添加剂(甲酸、乙酸、三氟乙酸、三乙胺),结果表明,其他添加剂检测游离睾酮,其定量下限均高于0.6pg/mL,无法满足临床女性标本的检测要求。
实施例6
本实施例的一种测定血清中游离睾酮的试剂盒,基本同实施例1,不同的是,萃取液为磷酸缓冲盐。
表6一种测定血清中游离睾酮的试剂盒的组份
本实施例中,组分5的缓冲液的pH为7.4。
实施例7
本实施例的一种测定血清中游离睾酮的试剂盒,基本同实施例1,不同的是,缓冲液为硼酸缓冲盐。
表7一种测定血清中游离睾酮的试剂盒的组份
本实施例中,组分5的缓冲液的pH为7.4。
实施例8
本实施例的一种测定血清中游离睾酮的试剂盒,基本同实施例1,不同的是,缓冲液为碳酸盐缓冲盐。
表8一种测定血清中游离睾酮的试剂盒的组份
本实施例中,组分5的缓冲液的pH为7.4。
通过实施例1、6、7、8的缓冲盐,优化其浓度,均可以在样品上清液进行LC-MS/MS分析,得到很好地峰形和分离效果,通过比较睾酮的峰面积和信号强度,均可以满足检测要求,其中4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液的峰面积略大于(≤20%)其他缓冲液,可以使血清中游离睾酮的定量下限达到0.25pg/mL。同时,还测试了其他缓冲体系(甲酸铵缓冲盐、乙酸铵缓冲盐),结果表明,其他缓冲盐检测游离睾酮,其定量下限均高于0.6pg/mL,无法满足临床女性标本的检测要求。
实施例9
本实施例的一种测定血清中游离睾酮的试剂盒,基本同实施例1,不同的是,复溶液为30%甲醇。
表9一种测定血清中游离睾酮的试剂盒的组份
实施例10
本实施例的一种测定血清中游离睾酮的试剂盒,基本同实施例1,不同的是,复溶液为50%甲醇。
表10一种测定血清中游离睾酮的试剂盒的组份
实施例11
本实施例的一种测定血清中游离睾酮的试剂盒,基本同实施例1,不同的是,复溶液为60%甲醇。
表11一种测定血清中游离睾酮的试剂盒的组份
通过实施例1、9、10、11的复溶液,优化其浓度,均可以在样品上清液进行LC-MS/MS分析,得到很好地峰形和分离效果,通过比较睾酮的峰面积和信号强度,均可以满足检测要求,其中40%甲醇的峰面积最大,可以使血清中游离睾酮的定量下限达到0.25pg/mL。同时,还测试了其他复溶液(纯水、纯甲醇、乙腈、异丙醇),结果表明,其他复溶液复溶游离睾酮,其定量下限均高于0.6pg/mL,无法满足临床女性标本的检测要求。
实施例12
本实施例的一种测定一种测定血清中游离睾酮的方法,包括如下步骤:
1.实验材料
如实施例1~11所示。
1.2主要仪器设备和耗材
LC-MS/MS:Waters UPLC-I Class超高效液相色谱和Xevo TQ-S质谱系统。
漩涡混合器(美国SI Vortex Genie 2)。
台式高速冷冻离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)。
MD200系列氮气吹扫仪(杭州奥盛仪器有限公司)。
2.流动相和其它溶液的配制
强洗溶液:90%乙腈溶液。
弱洗溶液:50%甲醇溶液。
流动相A:使用实施例中试剂盒的添加剂的水溶液,浓度为0.5mM。
流动相B:甲醇。
3.样品的制备
取100μL活化液于超滤管中在25℃,2000g条件下离心6min,接着向超滤管中加入100μL纯水在相同条件下离心6min。取300μL血清样品加入900μL缓冲液,用移液枪吹打混匀后静置5min。取1mL稀释后的血清样品加入超滤管中,在2000g、25℃条件下离心1h,取600μL样品超滤液和标准曲线样品和质控样品加入30μL内标工作液混合后,加入800μL萃取液,涡旋离心后,取650μL上层清液氮气吹干,100μL复溶液复溶后,取10μL上清直接进样。
6.仪器条件
6.1.液相条件的优化
本实验选用ACQUITYBEH C18(2.1×50mm 1.7μm)(Waters)色谱柱,分别使用甲醇和乙腈作为有机相对梯度和不同pH和缓冲盐流动相体系进行比较研究,结果发现同时在甲醇和水中加入0.5mM氟化铵在40%的有机相起始至2.0min时升至55%的有机相,3min时升至75%的有机相,3.1min时升至98%的有机相以0.4mL/min的流速进行梯度洗脱时,能够得到很好的分离和保留且峰形良好,有较高灵敏度,本方法在超高效液相系统下分析时间可以缩短到4min,能够快速、高效的分离出睾酮,减少基线干扰并达到很好的定量分析效果。具体液相条件如下:
进样器温度:8℃。
柱温:40℃。
运行时间:4min。
洗脱梯度:
扫描模式:多反应离子检测(正离子模式)
毛细管电压:3kV;锥孔电压:30V;脱溶剂温度:550℃;脱溶剂气:800L/hr;锥孔气:150L/hr
多反应监测参数表格:
7.数据处理
分析物和内标的保留时间,色谱图采集和色谱图的积分和数据统计由Masslynx软件和Microsoft Office Excel 2013进行处理。校正曲线以1/x2为加权系,用峰面积比值(分析物/内标)对校正标样中分析物的浓度进行线性回归。
8.方法验证
本方法在超滤后结合液液萃取的前处理条件下,在定量下限0.25pg/mL浓度样本中,S/N均大于10,色谱图见附图1,平行测定10个定量下限浓度的样品,检测结果如下详见表12,定量下限的准确度和精密度均在20%以内,结果符合要求;样品在0.25~50pg/mL浓度范围内有良好的线性关系,相关系数>0.998,相关线性回归方程详见附图2;该方法的精密度验证分别用女性血清样本,女性和男性8:2混合的血清样本,男性样本三个低中高浓度样品,经过超滤后通过测其本底的浓度来验证方法的精密度,要求CV%在15%以内,结果祥见表13,该方法的精密度符合要求;该方法的准确度通过加标回收试验来评估通过分别向上述三种样本的超滤液中加入一定量低中高浓度质控工作液,做加标回收实验,来验证方法的准确度,要求加标回收率均在可接受范围(85~115%)内,该方法的准确度结果可以接受,结果详见表14。
表12定量下限0.25pg/mL浓度的检测结果(n=10)
结论:定量下限的准确度的偏差在±20%以内,精密度在20%以内,均符合要求。
表13低中高浓度样品方法的精密度(n=6)
结论,变异系数在15%以内,精密度符合要求。
表14低中高浓度质控样品的准确度测试(n=6)
结论,加标回收率在85~115%之内,准确度的偏差在±15%以内,变异系数在15%以内,结果符合要求。
对比例13
本实施例的一种测定血清中游离睾酮的方法,基本同实施例12,不同的是流动相A缓冲盐的添加浓度,比较0、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10mM氟化铵的浓度对游离睾酮的峰面积和信号强度的影响,检测结果表明,不同的缓冲盐浓度对游离睾酮信号强度影响很大,当氟化铵浓度为0.5mM时,游离睾酮的检测限可达到0.25pg/mL。
对比例14
本实施例的一种测定血清中游离睾酮的方法,基本同实施例12,不同的是流动相B不同,比较甲醇、乙腈、异丙醇对游离睾酮的峰面积和信号强度的影响,检测结果表明,游离睾酮信号强度依次为甲醇>乙腈>异丙醇,当用甲醇做流动相时,游离睾酮的检测限为可达0.25pg/mL。
对比例15
本实施例的一种测定血清中游离睾酮的方法,基本同实施例12,不同的是流速不同,比较0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL/min的流速对游离睾酮的峰面积和信号强度的影响,检测结果表明,当流速为0.4mL/min时,游离睾酮的信号较高、干扰较少、洗脱时间较短,且检测限达0.25pg/mL。
综上所述,该方法分析方法运用超滤和液液萃取的前处理方法,能够快速的从血清中分离出游离的睾酮并从超滤液中进一步的快速提取和富集,液液萃取提取方法简单,运用此方法进行富集比固相萃取的操作更为简单,且成本更低,更容易实现;该方法的液相经过优化,在流动相中加入氟化铵缓冲盐,对仪器响应能显著的提高,提高了灵敏度,使得定量下限能低至0.25pg/mL,能完全满足临床样本的检测需求。
本申请建立了一种超高效液相色谱串联质谱结合超滤法来检测血清中游离睾酮的含量,能够快速实现血清中游离睾酮的分离,在1mL的上样量上只需要不到一小时就能收集超过600μL的超滤液,超滤液的体积越多经过提取富集就能提高检测的灵敏度。而且本方法无需经过衍生化,采取了简单易操作成本低的液液萃取提取方法。在300μL的血清样本用量上,就能将定量下限(LLOQ)降低至0.25pg/mL,完全满足临床样本特别是女性血清样本中极低的游离睾酮含量检测需求。
以上所述实施例仅表达了本发明的优选实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形、改进及替代,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (9)
1.一种测定血清中游离睾酮的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒包括以下组分:校准品、质控品、内标准品、活化液、缓冲液、萃取剂、复溶液和添加剂。
2.根据权利要求1所述的一种测定血清中游离睾酮的试剂盒,其特征在于:所述添加剂为氟化铵、甲酸铵或乙酸铵中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的一种测定血清中游离睾酮的试剂盒,其特征在于:所述萃取剂为甲基叔丁基醚、乙酸乙酯或二氯甲烷中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的一种测定血清中游离睾酮的试剂盒,其特征在于:所述缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液或碳酸盐缓冲液中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的一种测定血清中游离睾酮的试剂盒,其特征在于:所述校准品为睾酮;所述内标准品为睾酮-d3。
6.一种测定血清中游离睾酮的方法,其特征在于:使用权利要求1-5任一项所述的试剂盒,包括如下步骤:
用缓冲液将血清样品稀释的步骤,得稀释样品;
将所述稀释样品超滤的步骤,得超滤液;
用萃取剂将所述超滤液萃取的步骤,得萃取液;
将所述萃取液氮吹的步骤,得氮吹样品;
用复溶液将所述氮吹样品复溶的步骤,得上清液;
将所述上清液离心后,用高效液相色谱串联质谱检测的步骤。
7.根据权利要求1所述的一种测定血清中游离睾酮的方法,其特征在于:所述血清样品和缓冲液以1:3的比例稀释。
8.根据权利要求7所述的一种测定血清中游离睾酮的方法,其特征在于:所述高效液相色谱串联质谱检测的步骤中使用流动相;所述流动相包括流动相A和流动相B,所述流动相A为添加剂溶于纯水溶液中;所述添加剂为氟化铵溶液、甲酸铵或乙酸铵中的一种或几种。
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Cited By (2)
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CN115343402A (zh) * | 2022-07-28 | 2022-11-15 | 广州金域医学检验中心有限公司 | 游离睾酮的检测方法 |
CN117147741A (zh) * | 2023-10-31 | 2023-12-01 | 合肥歆智医疗器械有限公司 | 测定血中游离p和游离17-ohp的平衡透析-质谱法及试剂盒 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20120238027A1 (en) * | 2011-02-07 | 2012-09-20 | Laboratory Corporation Of America Holdings | Methods and Systems for Determining the Presence or Amount of Testosterone in a Sample |
US20140349885A1 (en) * | 2012-01-05 | 2014-11-27 | Dh Technologies Development Pte. Ltd. | Enhancement of sensitivity and specificity of ketosteroids and keto or aldehyde containing analytes |
CN110702831A (zh) * | 2019-11-18 | 2020-01-17 | 天津汉科生物科技有限公司 | 一种超高效液相色谱-串联质谱检测血清睾酮激素的试剂盒 |
CN113049719A (zh) * | 2021-03-24 | 2021-06-29 | 安徽歆智生物科技有限公司 | 一种检测游离睾酮的方法及试剂盒 |
CN113341027A (zh) * | 2021-07-05 | 2021-09-03 | 艾可泰科生物科技(江苏)有限公司 | 高效液相色谱串联质谱检测唾液中睾酮的方法及试剂盒 |
-
2022
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Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20120238027A1 (en) * | 2011-02-07 | 2012-09-20 | Laboratory Corporation Of America Holdings | Methods and Systems for Determining the Presence or Amount of Testosterone in a Sample |
US20140349885A1 (en) * | 2012-01-05 | 2014-11-27 | Dh Technologies Development Pte. Ltd. | Enhancement of sensitivity and specificity of ketosteroids and keto or aldehyde containing analytes |
CN110702831A (zh) * | 2019-11-18 | 2020-01-17 | 天津汉科生物科技有限公司 | 一种超高效液相色谱-串联质谱检测血清睾酮激素的试剂盒 |
CN113049719A (zh) * | 2021-03-24 | 2021-06-29 | 安徽歆智生物科技有限公司 | 一种检测游离睾酮的方法及试剂盒 |
CN113341027A (zh) * | 2021-07-05 | 2021-09-03 | 艾可泰科生物科技(江苏)有限公司 | 高效液相色谱串联质谱检测唾液中睾酮的方法及试剂盒 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
YU CHEN 等: "Direct measurement of serum free testosterone by ultrfiltration followed by liquid chromatography tandem mass spectrometry" * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115343402A (zh) * | 2022-07-28 | 2022-11-15 | 广州金域医学检验中心有限公司 | 游离睾酮的检测方法 |
CN117147741A (zh) * | 2023-10-31 | 2023-12-01 | 合肥歆智医疗器械有限公司 | 测定血中游离p和游离17-ohp的平衡透析-质谱法及试剂盒 |
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Publication number | Publication date |
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