CN114994214A - 一种定性检测母乳中中性低聚糖的方法 - Google Patents

一种定性检测母乳中中性低聚糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种定性检测母乳中中性低聚糖的方法，依次按下述步骤进行：(1)将母乳离心，去除上层脂肪和蛋白质，取离心产物的中间层；(2)加入乙醇，静置反应；(3)离心，取上清；(4)上样至第一层析柱吸附，用超纯水洗脱，收集洗脱液，氮吹干燥；(5)将干燥的洗脱产物复溶，上样至第二层析柱，用0.1‑0.5％TFA的超纯水溶液洗脱，收集洗脱液；(6)将步骤(5)收集的洗脱液通过液质联用进行分析，其中，在液相色谱的过程中进行柱后加液，所添加的试剂为甲酸的甲醇溶液。本发明提供的定性检测母乳中中性低聚糖的方法，通过对提取工艺以及液相色谱和质谱参数的特定选择，使该方法可以定性母乳中的17种中性低聚糖，并通过精确质谱碎片信息，准确定性测定其中的7种。

Description

一种定性检测母乳中中性低聚糖的方法
技术领域
本发明涉及检测领域，特别涉及一种定性检测母乳中中性低聚糖的方法。
背景技术：
在母乳中，母乳低聚糖(HMOs)是3-10个单糖由共价键连接组成的短链聚合物。HMOs由半乳糖(Galactose,Gal)，葡萄糖(Glucose,Glc)，N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine,GlcNAc)，岩藻糖(Fucose,Fuc)和唾液酸(Sialic acid,Sia)五种基础单糖聚合而成[17]。其中唾液酸在母乳中存在形式是N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)。HMOs通常根据其化学电荷可分为两类：不含电荷的单糖(Glu，Gal，GlcNAc，Fuc)组成的中性低聚糖和带有Neu5Ac负电荷残基的酸性低聚糖。中性低聚糖占HMOs总量的86-88％。母乳低聚糖具有促进大脑发育，调节肠道菌群，抗病毒，预防坏死性小肠结肠炎和调节上皮细胞和免疫细胞等功能。母乳中可能含有上千种低聚糖，但由于地理差异、泌乳阶段、分娩方式和遗传基因等因素的影响，会导致HMOs种类和含量发生变化。目前可以通过毛细管电泳、液相色谱、液相色谱-质谱和离子色谱等方法对HMOs进行定性定量的检测。HMOs种类繁多，且含量和种类变化复杂，用奶粉模拟母乳是特别复杂且困难的事情。建立对母乳中HMOs定性检测的方法，对母乳中不同种类的低聚糖进行含量变化的研究，总结出HMOs的种类和含量变化规律，这将以便于以后对婴幼儿配方奶粉中HMOs的添加提供依据，有利于配制出与中国母乳较为接近的婴幼儿配方奶粉。
因鉴于此，特提出此发明。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种定性检测母乳中中性低聚糖的方法，该方法可实现对母乳中中性低聚糖的分离提取和定性检测。
为了实现上述目的，本发明提供了一种定性检测母乳中中性低聚糖的方法，其特征在于，依次按下述步骤进行：
(1)将母乳离心，去除上层脂肪和蛋白质，取离心产物的中间层；
(2)加入乙醇，静置反应；
(3)离心，取上清；
(4)上样至第一层析柱吸附，用超纯水洗脱，收集洗脱液，氮吹干燥；
(5)将干燥的洗脱产物复溶，上样至第二层析柱，用0.1-0.5％TFA的超纯水溶液洗脱，收集洗脱液；
(6)将步骤(5)收集的洗脱液通过液质联用进行分析，其中，在液相色谱的过程中进行柱后加液，所添加的试剂为甲酸的甲醇溶液。
优选或可选地，步骤(1)中离心的具体条件为3-5℃下8000-10000rpm离心25-35min，优选的，离心条件为4℃下10000rpm离心30min。
优选或可选地，步骤(2)中，加入乙醇的体积与步骤(1)中获得的中间层产物的体积比为2-3:1，优选为2:1。
优选或可选地，步骤(2)中，静置反应的环境温度为零下17-零下23℃，反应时间为25-35min，优选的，环境温度为零下20℃，反应时间为30min。
优选或可选地，步骤(3)中，离心的具体条件为3-5℃下3000-5000g离心25-35min，优选的，离心条件为4℃下4000g离心30min。
优选或可选地，步骤(4)中，所使用的第一层析柱为Cleanert IC-A，且在吸附前经超纯水活化。
优选或可选地，步骤(5)中，所使用的第二层析柱为Sep-Pak C18，且在吸附前经甲醇平衡并用0.1-0.5％TFA的超纯水溶液冲洗。
优选或可选地，步骤(6)中，所述的甲酸的甲醇溶液的浓度为1-2％。
本发明提供的定性检测母乳中中性低聚糖的方法，通过对提取工艺以及液相色谱和质谱参数的特定选择，使该方法可以定性母乳中的17种中性低聚糖，并通过精确质谱碎片信息，准确定性测定其中的7种。适用于大规模的母乳样品的分析工作。
附图说明
图1为对比例2在正离子模式下的总离子流图；
图2为实施例1在正离子模式下的总离子流图；
图3为对比例3的总离子流图；
图4为实施例1的总离子流图；
图5位对比例4的总离子流图；
图6为编号为N1的中性低聚糖在碰撞能量为20V时的二级质谱图
图7为编号为N2的中性低聚糖在碰撞能量为20V时的二级质谱图；
图8为编号为N3的中性低聚糖在碰撞能量为20V时的二级质谱图；
图9为编号为N4的中性低聚糖在碰撞能量为20V时的二级质谱图；
图10为编号为N5的中性低聚糖在碰撞能量为25V时的二级质谱图；
图11为编号为N6的中性低聚糖在碰撞能量为25V时的二级质谱图；
图12为编号为N7的中性低聚糖在碰撞能量为25V时的二级质谱图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明中母乳样品来自于50位不同的足月分娩、自愿参加的健康母亲的母乳的等体积混合，均经各自属地医院伦理委员会批注，且均签署《知情同意书》。
在采集时，与上午9:00-11:00间采集，乳母对婴儿哺乳，并采用吸奶器西区一侧乳房的乳汁，置于冷冻管内，在-20℃下保存，各来源的样品均收集完毕后，解冻，等体积混合后，置于-80℃下保存备用。
实施例1
本发明实施例提供了一种定性检测母乳中中性低聚糖的方法。
取1mL母乳样品，在4℃下以10000rpm离心，以去除上层脂肪和少量蛋白质，取中心层，并转移到离心管中，加入两倍体积的无水乙醇，在-20℃下静置反应30min。
反应完成后，在4℃下以4000g离心30min，取上清液。
将上清液上样至经10mL超纯水活化后静置10min的Cleanert IC-A柱内，使用5mL超纯水洗脱，收集洗脱液，并将收集的洗脱液氮吹干燥，得到的固体用1mL 0.1％TFA的超纯水溶液复溶。
将复溶后的样品上样到先经5mL甲醇平衡，后用10mL0.1％TFA的超纯水溶液冲洗过的Sep-Pak C18柱内，收集洗脱液，并将洗脱液上样，重复该过程两次，以使样品中的中性低聚糖被柱充分的吸附。
最后使用3mL 0.1％TFA的超纯水溶液洗脱，收集洗脱液。
将收集到的洗脱液通过液质联用的方式进行分析。
其中，液相色谱的参数为：分析柱Dionex IonPacTMAS19(2×250mm)，保护柱DionexIonPacTMAG19(2×50mm)，电化学检测器，柱温：35℃。流动相A：超纯水，流动相D：200mmol/LNaOH溶液。抑制器电流：495mA，流速：2mL/min。洗脱条件：0-2min，95％A和5％D；25min时，80％A和20％D；45min时，70％A和30％D；45.1min时，95％A和5％D。且在柱后加入1％浓度的甲酸的甲醇溶液，流量为0.012mL/min。
质谱的参数为：采用Q Exactive检测器进行检测。使用电喷雾离子源，喷雾电压为3.5kV，鞘气压力为35arb，辅气压力为10arb，加热温度为350℃，毛细管温度为320℃，碰撞能量为20-25V，在正离子模式下对500-2000m/z的物质进行Full MS/dd-MS2模式扫描。
对比例1
取1mL母乳样品，在4℃下以10000rpm离心，以去除上层脂肪和少量蛋白质，取中心层，并转移到离心管中，加入两倍体积的无水乙醇，在-20℃下静置反应30min。
反应完成后，在4℃下以4000g离心30min，取上清液。
将上清液上样至经10mL超纯水活化后静置10min的Cleanert IC-A柱内，使用5mL超纯水洗脱，收集洗脱液，并将收集的洗脱液氮吹干燥，得到的固体用1mL 0.1％TFA的超纯水溶液复溶。
用10mL 50％乙腈活化Bond Elut NH2小柱，分别将前述步骤得到的上清液和复溶后的样品各1mL上样至柱床上，分别用3mL 90％乙腈洗脱后收集洗脱液，将各洗脱液氮吹吹干后用1mL的0.1％TFA的超纯水溶液复溶。
效果实施例1
分别测定实施例1和对比例1-2种所述方法的对于母乳样品中乳糖的去除率，结果如表1所示。
表1乳糖去除率结果表
Figure BDA0003723649900000041
Figure BDA0003723649900000051
对比例2
本对比例其余步骤均与实施例1相同，区别仅在于液相色谱洗脱条件不同。本对比例的洗脱条件为0-2min，95％A和5％D；2.1-40min时，85％A和15％D；40.1-45min时，95％A和5％D。
效果实施例2
分别测定实施例1和对比例2的总离子流图，如图1-2所示。由图1-2可以看出，对比例2中大部分的中性低聚糖在前17min内被洗脱，但是彼此间的分离效果并不明显，而实施例1中的技术方案，各中性低聚糖的分离效果则很明显。即，本申请通过对于液相色谱洗脱条件的特定选择，使各中性低聚糖的分离效果更加显著。
对比例3
本对比例其余步骤均与实施例1相同，区别仅在于质谱的扫描模式不同，本对比例的扫描模式为负离子模式。
效果实施例3
分别测定实施例1和对比例3的总离子流图，如图3-4所示。由图3-4可以看出，对比例3的成像清晰度和分离效果要原差于实施例1的技术方案。即，本申请通过对于质谱扫描模式的特定选择，使最终的中性低聚糖的分离效果更加显著。
对比例4
本对比例其余步骤均与实施例1相同，区别仅在于本对比例省略了柱后加液步骤。
效果实施例4
测定对比例4的总离子流图，如图5所示。由图5可以看出，在省略柱后加液步骤后，总离子流图中并无中性低聚糖的特征峰出现，仅有溶剂的特征峰。即，省略柱后加液步骤无法实现中性低聚糖的分离。
效果实施例5
采用实施例1中所述的方法对母乳样品进行测定，测定结果如表2和3所示。
表2样品中中性低聚糖质谱结果表
Figure BDA0003723649900000061
表3 7种中性低聚糖的定性信息
Figure BDA0003723649900000062
由表1可以看出，本发明实施例1中提供的方法可以实现对于母乳中的17种中性母乳低聚糖的分离。由表2可以看出，本发明实施例1中提供的方法可以实现上述17种中性母乳低聚糖中7种的定性分析。
进一步的，请参考图6-12。图5-11分别为编号N1-N7在碰撞能量20或25V时的二级质谱图，由上述的二级质谱图可知，本发明实施例1中所述的方法对于编号N1-N7的中性低聚糖均可通过产生的特征碎片离子对该种中性低聚糖进行定性分析。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (8)

1.一种定性检测母乳中中性低聚糖的方法，其特征在于，依次按下述步骤进行：
(1)将母乳离心，去除上层脂肪和蛋白质，取离心产物的中间层；
(2)加入乙醇，静置反应；
(3)离心，取上清；
(4)上样至第一层析柱吸附，用超纯水洗脱，收集洗脱液，氮吹干燥；
(5)将干燥的洗脱产物复溶，上样至第二层析柱，用0.1-0.5％TFA的超纯水溶液洗脱，收集洗脱液；
(6)将步骤(5)收集的洗脱液通过液质联用进行分析，其中，在液相色谱的过程中进行柱后加液，所添加的试剂为甲酸的甲醇溶液。
2.根据权利要求1所述的定性检测母乳中中性低聚糖的方法，其特征在于，步骤(1)中离心的具体条件为3-5℃下8000-10000rpm离心25-35min，优选的，离心条件为4℃下10000rpm离心30min。
3.根据权利要求1所述的定性检测母乳中中性低聚糖的方法，其特征在于，步骤(2)中，加入乙醇的体积与步骤(1)中获得的中间层产物的体积比为2-3:1，优选为2:1。
4.根据权利要求1所述的定性检测母乳中中性低聚糖的方法，其特征在于，步骤(2)中，静置反应的环境温度为零下17-零下23℃，反应时间为25-35min，优选的，环境温度为零下20℃，反应时间为30min。
5.根据权利要求1所述的定性检测母乳中中性低聚糖的方法，其特征在于，步骤(3)中，离心的具体条件为3-5℃下3000-5000g离心25-35min，优选的，离心条件为4℃下4000g离心30min。
6.根据权利要求1所述的定性检测母乳中中性低聚糖的方法，其特征在于，步骤(4)中，所使用的第一层析柱为Cleanert IC-A，且在吸附前经超纯水活化。
7.根据权利要求1所述的定性检测母乳中中性低聚糖的方法，其特征在于，步骤(5)中，所使用的第二层析柱为Sep-Pak C18，且在吸附前经甲醇平衡并用0.1-0.5％TFA的超纯水溶液冲洗。
8.根据权利要求1所述的定性检测母乳中中性低聚糖的方法，其特征在于，步骤(6)中，所述的甲酸的甲醇溶液的浓度为1-2％。
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