CN102565318A

CN102565318A - 一种肝癌监测、分期以及预后风险评估的试剂及其方法

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Publication number: CN102565318A
Application number: CN2012100064894A
Authority: CN
Inventors: 陈翠英
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-01-11
Filing date: 2012-01-11
Publication date: 2012-07-11
Anticipated expiration: 2032-01-11
Also published as: CN102565318B

Abstract

本发明公开了一种监测患肝癌或肝纤维化风险的组合物，由选自下述的N-寡糖链组成：NA3F、NA2F、NA2FB、NA2G、NA2GF、NGA2F、NGA2FB以及NA3。上述组合物可用作制备试剂，用于肝癌早期诊断、肝癌分期检测或预后评估，还可以应用于肝纤维化早期诊断或预后评估。本发明还提供了一种监测患肝癌或肝纤维化风险的方法，可大大提高肝癌或肝纤维化诊断的灵敏性和稳定性，大大优于现有的AFP检测技术。

Description

一种肝癌监测、分期以及预后风险评估的试剂及其方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种监测患肝癌或肝纤维化风险的试剂或组合物

背景技术

原发性肝癌(primarylivecarcinoma，PLC)，简称肝癌，包括原发性肝细胞癌、胆管细胞癌、混合型癌、肝母细胞癌等，以原发性肝细胞癌为最常见。原发性肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是全球最常见的癌症之一，也是近年来发病率上升最快、病死率最高的肿瘤之一。每年在全球肝癌发病人群中，中国患者占将近一半，在中国的癌症死亡率中排名第二。当人们感染上乙型肝炎病毒((hepatitis virus B，HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)后常会导致慢性肝纤维化，并逐渐发展成肝硬化。统计数据显示，60-80％的肝硬化患者会发展成肝癌。中国是HBV感染的高发国家，也是肝癌的高发地区，近年发病率呈缓慢上升趋势，病死率也随之上升，每年死于晚期肝癌的病人约20万人。其发病率之高也与我国肝炎病人居多有关，85％的肝癌患者是由病毒性肝炎引起的。HCC的早期患者一般多无临床症状，或仅有肝炎的症状，很难早期发现。大约80％的肝癌患者一经发现就已到晚期，人出现了食欲不振、消瘦、腹水、肝区疼痛、右上腹肿块等典型症状，这些病人生存期大多在半年之内，而失去了进行根治性手术治疗的机会。因此，早期诊断对肝癌的治疗效果非常关键，对于患有慢性肝病和肝硬化的高危人群进行早期肝癌的筛查，从而进行根治性手术治疗，可以有效的降低死亡率。目前有各种成像技术用于诊断肝癌，例如超声波，CT扫描和核磁共振成像等。然而，这些技术不能区分肝癌和良性肝病变，如不典型增生结节和肝硬化微结节。超声检查通常难以发现、确认小于3cm的肿块。目前临床上最常用的肝癌标志物是甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)，但是有相当一部分肝癌患者的AFP不升高，也有很多慢性肝炎和肝硬化患者出现AFP的升高。因此，AFP的敏感性和特异性都无法让人满意。上述现状导致HCC难以实现早期发现和早期治疗，患者预后差、5年生存率低、病死率高。因此，寻找有效的早期HCC筛查及诊断指标来提高的HCC患者的诊断治疗水平迫在眉睫。

目前，诊断肝硬化患者是否患有HCC可通过无创检测，如影像对比、AFP检测等方法来进行。治疗后，医生通过常规AFP检测和影像检查来确定肿瘤是否复发。当影像学手段无法达到诊断目的时，还可以通过活检来诊断。由于肝活检对病人有一定的风险，因此肝活检是不适合纳入常规检查，一般每半年一次来监测评估肝脏疾病的进展以及治疗后肿瘤是否复发。由于AFP检测的特异性不高，可产生一定的假阴性和假阳性，可能漏诊一部分肝癌患者。因此，需要其他的血液标记方式来替代或辅助AFP检测。

糖蛋白分子由多肽链和糖两部分组成。血清中大多数的糖蛋白是由肝脏和B淋巴细胞合成的。血清糖蛋白中N-糖苷键连接的寡糖链(简称N-寡糖链)的任何变化，可以反映肝细胞或B淋巴细胞的生理改变。近年来，糖组学研究显示了N-寡糖链的改变与各种肿瘤的发生和发展有密切的相关性(参考文献1，Liu，X-E，Desmyter，L，Gao，C-F，Laroy，W，Dewaele，S，Vanhooren，V，Wang，L，Zhuang，H，Callewaert，N，Libert，C，Contreras，R，Chen， C.N-Glycomic changes in hepatocellular carcinoma patients with liver cirrhosisinduced by hepatitis B virus.Hepatology，46，1426-1435，2007.)。

鉴于肝癌早期预防和预后监测的不确定性，目前迫切需要一种有效地监测肝癌的试剂和监测评估方法。

发明内容

本发明涉及一种监测早期肝癌以及预后风险评估的组合物及其监测方法。在本发明中，我们确定了，血液糖蛋白的N-糖苷键连接的碳水化合物(N-寡糖)含量的改变，与早期肝癌患者的组织学的肝癌早期阶段(T1或T2)之间存在显著地相关性。在上述工作基础上，我们发现了评估肝癌早期阶段的临床监测方法，对没有任何临床表现的患有肝疾病患者，包括肝纤维化患者，肝硬化患者和肝癌早期阶段患者均可有效筛查，定期评估肝脏疾病的进展以及治疗后肿瘤的复发。

在本发明中，我们使用血清的N-寡糖链指纹技术(简称G-Test方法)作为诊断指标，对肝癌(HCC)患者进行了评估。研究表示，N-寡糖链指纹技术可作为诊断肝癌的肿瘤分期，同时这项检测方法可以检测出50％的AFP漏诊的HCC病例。因此，将N-寡糖链指纹和AFP监测联合使用，可以大大提高肝癌早期诊断的准确率。该方法可以让众多肝纤维化和肝硬化患者接受常规、无创检测，帮助医药工作者早期检测肝癌，并能够及时监测疾病进展。

本发明G-Test方法是基于检测血液糖蛋白中N-寡糖链的指纹图谱，创建的一种HCC的早期筛查及诊断的检测方法和检测系统。该方法主要步骤是，释放并荧光标记血清或血浆样品中的糖蛋白的N-寡糖链；分离测量样本中荧光标记的N-寡糖链的含量或指纹图谱(简称G-Test图谱)；分析比较N-寡糖指纹图谱，得到检测指标参数。该方法可以让众多肝纤维化肝硬化患者接受常规、无创检测，帮助医生早期检测肝癌，并能够及时监测疾病的发生和发病的进展。

一种监测患肝癌或肝纤维化风险的组合物，由选自下述的N-寡糖链组成：NA3F、NA2F、NA2FB、NGA2F、NGA2FB以及NA3。上述的组合物，可以由NA3F、NA2F和NA2FB组成；上述的组合物可用于制备肝癌早期诊断和肝癌分期检测试剂。我们可以利用NA3F/(NA2F+NA2FB)的比值来诊断早期肝癌诊断和肝癌分期检测。一种诊断试剂，包括组合物，所述组合物由NGA2F、NGA2FB和NA3组成；所述的组合物在制备肝纤维化早期诊断或预后评估试剂中的应用；所述的组合物，通过(NGA2F+NGA2FB)/NA3的比值来监测肝纤维化。本发明还可以是一种诊断试剂，其包括上述的组合物。

材料和方法

一、测试样本：

本实验共收集了471例患者的血清，血清收集来自北京(佑安医院，武警医院，地坛医院，北大医院)，南京(南京第二医院)和上海(瑞金医院)，其中包括173例肝纤维化患者，218例HCC患者和80例肝硬化患者。健康对照组130例的血清来自北京红十字会中心。

以上患者均接受临床实验室分析诊断和组织学检查(肝穿刺活检)并符合以下选择标准：(a)均为HBV感染的患者(b)排除人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)、丙型(hepatitis C virus，HCV)、丁型(hepatitis D virus，HDV)、戊型(hepatitisE virus HEV)肝炎病毒和梅毒(syphilis)等除乙型肝炎病毒感染之外的其他病毒感染；(c)排除自身免疫性肝病、酒精性肝病，药物性肝病和Wilson病；血清采集均在患者未接受任何治疗之前，临床血常规、生化、肿瘤标志物、乙肝肝炎病毒标志物、DNA载量等数据与血清同期收集。丙氨酸转氨酶(ALT)，谷草转氨酶(AST)，总胆红素，白蛋白，血清总蛋白和γ-谷氨酶(GGT)的测量数据用于评估病人的肝功能损害的程度。

二、设备和试剂：

设备主要是ABI3130 DNA测序仪(Applied Biosystems美国生物应用公司)，以及用于ABI3130 DNA测序仪的电泳毛细管(Capillary array36厘米，Applied Biosystems美国生物应用公司)，GeneMapper(ABI3130)分析软件(Applied Biosystems美国生物应用公司)。

试剂主要含有试剂A(变性缓冲液)：10mM的碳酸氢铵pH值8.35％SDS；试剂B(PNGaseF反应缓冲液)：PNGaseF终浓度2.2单位/μ在3.33％NP40；试剂C(APTS标记缓冲液)：混和同等体积的20mM APTS(容于1.2M柠檬酸)和1M NaCNBH3(容于DMSO)；试剂D(唾液酸酶反应液)：0.25μl 100mM NH₄AC，pH 5；0.2μl唾液酸酶(neuraminidase，2mU)，2.55μl双氧水。

三、检测血清样本中的G-Test图谱的操作步骤：

N-寡糖链分析(G-Test图谱分析)的操作程序保括四个步骤：(a)用专一性的N-糖苷键水解酶制备自由寡糖链：往稀释一倍的4ul血清加入2μl的试剂A，95℃加热5分钟变性；然后同等体积的(4ul)的试剂B，37℃反应3小时后干燥；(b)荧光标记自由寡糖链：加入2μl的试剂C，65℃加热3小时进行荧光标记，然后加入200μl的水终止标记反应；(c)去除末端唾液酸：取2μl荧光标记的(b)步骤的液体，然后加入2μl的试剂D，45℃加热3小时进行去末端唾液酸反应，然后加入200μl的水终止标记反应；(d)分离分析荧光标记的N-寡糖链：取10μl去末端唾液酸反应的(c)液体，用ABI3130测序仪进行N-寡糖链片分离，得到G-Test图谱.

四、检测分析

对测量得到的G-Test图谱中的每个峰均进行量化计算，以每个峰的相对含量来表示(％)：即用每个峰的峰高值除以所有峰的高度的总和来定量计算，计算得到G-HCC值和G-Fibrosis值。用统计学比较肝癌患者(HCC组)与健康对照组，纤维化组和肝硬化组的相对含量的差异。

附图说明

图1.G-Test系统方法应用于人血清的N-寡糖图谱的分离和检测。G-Test方法的操作大致分为四个步骤；(1)样品血清的收集和处理；(2)标记与分离N-寡糖链；(3)分析N-寡糖链指纹或G-Test图谱；(4)G-Test诊断参数对造.图谱中的寡糖缩写分别表示为：NGA2F，半乳糖缺失含核心岩藻糖(α1，6Fuc)两天线(agalacto，core-α-1，6-fucosylatedbiantennary)；NGA2FB，半乳糖缺失带有二等分乙酰葡糖胺(GlcNAc)修饰的核心岩藻糖(α1，6Fuc)两天线(agalacto，core-α-1，6-fucosylated bisecting biantennary)；NA2F，核心岩藻糖(α1，6Fuc)两天线(bigalacto，core-α-1，6-fucosylated biantennary)；NA2FB，带有二等分乙酰葡糖胺(GlcNAc)修饰的核心岩藻糖(α1，6Fuc)两天线(bigalacto，core-α-1，6-fucosylated bisecting biantennary)；NA3，三天线(trigalacto，triantennary)；NA3F，分支岩藻糖(α1，3/1，2Fuc)修饰的三天线(trigalacto，α1，3/1，2-fucosylated triantennary)。

图2.典型的人血清N-寡糖图谱或G-Test图谱。图谱中的寡糖缩写分别表示为：NGA2F，半乳糖缺失含核心岩藻糖(α1，6Fuc)的两天线；NGA2FB，半乳糖缺失带有二等分乙酰葡糖胺(G1cNAc)修饰的核心岩藻糖(α1，6Fuc)两天线；NG1A2F，半乳糖单一缺失的核心岩藻糖(α1，6Fuc)两天线(single agalacto，core-α-1，6-fucosylated biantennary)；NA2，两天线(bigalacto，biantennary)；NA2F，核心岩藻糖(α1，6Fuc)两天线；NA2FB，带有二等分乙酰葡糖胺(GlcNAc)修饰的核心岩藻糖(α1，6Fuc)两天线；NA3，三天线；NA3F，分支岩藻糖(α1，3/1，2Fuc)修饰的三天线。

图3.N-寡糖图谱与肝癌的相关性。与肝纤维化组和肝硬化组比较，图表显示肝癌患者(HCC组)寡糖的相对含量明显的改变并具有统计学意义的相关性(p＜0.0001)。纤维化(n＝173)；肝硬化组(n＝80)；HCC组(n＝227).纵轴代表寡糖的相对值(％)。

图4.G-HCC比值[NA3F/(NA2F+NA2FB)]与肝癌的相关性.与肝纤维化组和肝硬化组比较，G-HCC比值明显升高并具有统计学意义的相关性(p＜0.0001).纤维化(n＝173)；肝硬化组(n＝80)；HCC组(n＝227).纵轴代表寡糖的相对值(％)。

图5.G-HCC比值[NA3F/(NA2F+NA2FB)]和AFP含量用于鉴别诊断原发性肝细胞癌HCC的ROC曲线。G-HCC比值的AUC＝0.851，AFP的AUC＝0.764。

图6.G-HCC比值[NA3F/(NA2F+NA2FB)]和AFP含量(cutoff＜400ng/ml)与肝癌分级的相关性.图6A显示G-HCC比值与肝癌分级具有统计学意义，而图6表示AFP含量与肝癌分级无线性关系.TMN0：n＝76(肝硬化组)；TMN1-2：n＝22；TMN3-4：n＝27。

图7.用于鉴别诊断原早期肝细胞癌T1-T2(n＝34)与晚期肝细胞癌T3-T4(n＝64)的ROC曲线.G-HCC比值的AUC＝0.854，AFP的AUC＝0.778。

图8.N-寡糖图谱与肝纤维化的相关性。图表显示，寡糖的相对含量的改变与纤维化发展成正比.Control：健康对照组(n＝130)；纤维化分期F0(Ishak score)(n＝44)；纤维化分期F1-F2(n＝43)；纤维化分期F3-F4(n＝44)；纤维化分期F5-F6(n＝42)；肝硬化组(n＝80)；HCC组(n＝227).纵轴代表寡糖的相对值(％)。

图9.G-Fibrosis比值[(NGA2F+NGA2FB)/NA3]与肝纤维化的分级成正比。Control：健康对照组(n＝130)；纤维化分期F0(Ishak score)(n＝44)；纤维化分期F1-F2(n＝43)；纤维化分期F3-F4(n＝44)；纤维化分期F5-F6(n＝42)。

具体实施方式

以下将详细说明本发明，但是实施方式并不限于以下方式。

实施例1

肝癌G-Test方法可检测N-寡糖图谱在肝癌患者中的变化

我们对以上收集到的471例患者的血清进行了G-Test方法分析，其操作如图1所示大致分四个步骤：(1)样品血清的收集和处理；(2)标记与分离N-寡糖链；(3)分析N-寡糖链指纹或G-Test图谱；(4)G-Test各参数对照分析。如图2所示，人血清的G-Test图谱大概显示出近10个N-寡糖链峰，不同的寡糖链因分子大小的不同而表现出不同的迁移性，即表现在G-Test图谱上的不同的峰则代表了不同的寡糖链；寡糖链的相对浓度含量则表现在所测出的峰高。我们对测量得到的G-Test图谱中的每个峰均进行了量化计算，即以每个峰的相对含量来表示(％)：用每个峰的峰高值除以所有峰高值的总和。用统计学计算方法比较肝癌患者(HCC组)与健康对照组、纤维化组和肝硬化组的各N-寡糖链相对含量的差异。

经过与健康对照组比较，所测出的HCC组中的N-寡糖链的峰的数量与对照组相同，但寡糖的相对含量有明显的变化。与肝纤维化组和肝硬化组相比较，HCC组中含分支岩藻糖(α1，3/1，2Fuc)三天线(NA3F)所占比例显著升高(P＜0.0001)(见图3A)，而含核心岩藻糖(α1，6Fuc)的两天线(NA2F)所占比例降低(P＜0.0001)(见图3B)。尽管肝硬化患者的含核心岩藻糖(α1，6Fuc)和二等分乙酰葡糖胺(GlcNAc)修饰两天线(NA2FB)所占比例升高，但是HCC组与肝纤维化对照组没有显著差别(见图3C)。鉴于60-80％的肝硬化患者会发展成肝癌，本发明的G-HCC肝癌的比值[NA3F/(NA2F+NA2FB)]不仅显示肝纤维化的参数同时也包含了肝硬化的参数。如图4所示，HCC肝癌组的G-HCC肝癌的比值显著的升高(p＜0.0001)。ROC(Receiver Operating Characteristics)Curve分析显示(图5)，其受试者用AFP检测方法的AUC(Area Under the Curve)是0.764，若用G-HCC肝癌的比值参数来检测HCC，其AUC的临床检测值可达0.851，比用AFP检测方法的诊断效率提高了8.7％。同时，本发明G HCC肝癌的比值[NA3F/(NA2F+NA2FB)]较参考文献1(AUC的临床检测值为0.812)更加敏感稳定，可以大大提高诊断的精确性。

根据美国癌症联合会对肝癌的TMN分期法，HCC组分为T0无原发肿瘤；T1无血管侵犯的实体肿瘤；T2肿瘤侵犯血管或多发肿瘤但都小于5cm；T3多发肿瘤，大于5cm或肿瘤累及门脉或肝静脉的分支；T4肿瘤直接侵犯邻近器官(除了胆囊)或内脏浆膜穿孔。其中，T1和T2(TMN1-2)级视为早期阶段，而T3和T4(TMN3-4)则为肝癌的晚期。我们发现目前临床使用的AFP检测方法(AFP＜400ng/ml)与肝癌的发展没有线性关系(见图6B)，令人兴奋的是G-HCC肝癌的比值与肝癌的发展成线性关系(见图6A)，并具有统计学意义(p＜0.01)，ROC Curve分析显示(图7)，AFP检测方法区分HCC的早期T1-T2(n＝34)与晚期T3-T4(n＝64)的AUC值是0.778，而G-HCC肝癌的比值显示AUC＝0.854，参考文献1的AUC值是0.813，说明G-HCC肝癌比值的诊断效力比目前临床采用的AFP检测方法以及现有技术的寡糖分期法有显著性提高，该指标可用于更好的鉴别诊断HCC的分级。由此可见G-HCC肝癌的比值方法检测HCC的总体特异性和敏感性比AFP方法要好得多。

实施例2

G-Test分析方法可预测纤维化的发生和发展

如图表8所示，本发明的G-Test分析方法可用于检测跟踪肝疾病患者的纤维化发展。在纤维化患者中，半乳糖缺失的两天线N-寡糖链(NGA2F+NGA2FB)的含量伴随着肝纤维化的进展而呈线性升高(图表8A-B)，与此同时，三天线N-寡糖链(NA3)成线性降低趋势(图8C)。由此而产生检测跟踪纤维化发生发展的G-Fibrosis纤维化的比值[(NGA2F+NGA2FB)/NA3]，半乳糖缺失的两天线之总和与三天线的比值。G-Fibrosis纤维化的比值参数与纤维化发展成正比(图9)。肝纤维化是肝内纤维结缔组织的异常增生与沉积，是各种慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段。但是肝纤维化早期往往无明显的临床和影象学表现，目前，肝纤维化的诊断有赖于肝穿刺病理组织学检查和血清学检查。本发明用G-Fibrosis纤维化检测指标对肝纤维化的早期诊断，可有效的用于检测跟踪乙肝病毒携带者，从而可预测纤维化的发生和发展，在慢性肝病的早期治疗和预后判断中有重要意义。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims

1.一种监测患肝癌或肝纤维化风险的组合物，其特征在于，所述组合物由选自下述的N-寡糖链组成：NA3F、NA2F、NA2FB、NA2G、NA2GF、NGA2F、NGA2FB或NA3。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物由NA3F、NA2F和NA2FB组成。

3.权利要求2所述的组合物在制备肝癌早期诊断、肝癌分期或预后评估试剂中的应用。

4.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，通过NA3F/(NA2F+NA2FB)的比值来诊断早期肝癌和肝癌分期。

5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物由NGA2F、NGA2FB和NA3组成。

6.权利要求5所述的组合物在制备肝纤维化早期诊断、分期或预后评估试剂中的应用。

7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，通过(NGA2F+NGA2FB)/NA3的比值来监测肝纤维化。

8.一种诊断试剂，其包括权利要求1或2或4或6或8所述的组合物。

9.权利要求8所述的诊断试剂，其特征在于，所述试剂与AFP检测技术联合应用。