CN105116000B - 用于检测胃癌相关代谢小分子的核磁共振模型及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于检测胃癌相关代谢小分子标志物的核磁共振模型及其制备方法。本发明采用核磁共振波谱仪测定胃癌患者和健康人血浆样本的代谢小分子，并将传统统计学与现代生物信息学方法相结合进行数据处理，筛选出9种相应的胃癌相关代谢小分子标志物，从而制备检测胃癌相关代谢小分子标志物的核磁共振模型，为寻找新的更理想的肿瘤标志物提供了基础和资源。

Description

用于检测胃癌相关代谢小分子的核磁共振模型及制备方法

技术领域

本发明涉及恶性肿瘤胃癌检测领域，利用一种核磁共振模型及其制备、应用方法，在体外对胃癌进行的发现和检测，其准确率为70.8％、敏感度为81.6％、特异度为60.0％。

背景技术

胃癌是我国发病率较高的癌症之一，胃癌病人多数无明显症状，少数人有恶心、呕吐或溃疡类似病症的上消化道疾病的症状。胃癌的发病具有地域性。研究发现，亚洲地区，如中国、日本、韩国等具有较高的发病率。其次，胃癌的发病原因较为复杂，目前，已经报道的研究发现，胃癌的诱因与日常饮食因素、胃溃疡疾病、胃息肉疾病以及幽门螺旋杆菌感染有关。根据最新的2012年的统计，我国胃癌发病率为3.314人/万人，死亡率为每万人2.434人/万人，远远高于世界上其他国家(发病率为2.309人/万人，死亡率为1.639人/万人)，位居恶性肿瘤第2位。通过不断的研究发现，提高胃癌诊断效果从而提高胃癌病人五年生存率的根本策略是对胃癌的诊断，达到早发现早治疗的目的。对于胃癌的诊断，开展较好的国家，如日本，其胃癌诊断的比例已经超过全部诊断胃癌病例的一半以上，而我国对于胃癌的诊断仅为全部胃癌诊断病例的5-15％。胃癌在诊断以后进行治疗，病患的五年生存率可以达到90％，原因超过进展期胃癌的治疗效果(五年生存率仅为16.6％)。目前，对于胃癌的诊断方法，主要集中在内窥镜手段、影像学诊断和分子生物学诊断。其中，影像学手段包括钡餐造影、螺旋CT成像；分子生物学手段即使对与癌症相关的基因、蛋白质的标志物进行筛查，例如，张力蛋白同源磷酸酶基因、survivin基因、Livin基因、CA72-4蛋白、CA19-9蛋白等。钡餐造影、内窥胃镜的方法，对于胃癌的诊断准确率较高，但是由于这些方法检测过程复杂，对病人的在生理上造成一定的伤害；对与基因和蛋白质标志物的筛查，检测过程复杂，需要大型的仪器，同时，诊断的准确率仍然处于较低的水平，在我国的普及率相对较低。

肿瘤标志物是由肿瘤细胞合成并且分泌到体液中的活性物质，存在与组织液、血液、唾液、尿液等体液中。1978年，在国立癌症研究所召开的“人类免疫及肿瘤免疫诊断会议”上，由美国学者Herberman首次提出肿瘤标志物(Tumor marker，TM)这一概念。肿瘤标志物是指在恶性肿瘤发生及增殖过程中，由肿瘤细胞自身的特殊性所表达并合成，最后分泌到细胞间及体液中的物质，或者，病人由于对肿瘤出现各种不同的生理或病理反应，从而自身正常细胞分泌到组织或体液中的物质，如某些蛋白质、小分子等等，统称为肿瘤标志物。使用肿瘤标志物，可以实现对对肿瘤的检测，并在诊断过程中起到辅助作用。依据其产生原理，肿瘤标志物分为两类，一类是有肿瘤自身分泌的；另一类是肿瘤与机体相互作用产生的。按其产生原理，我们把能反映恶性演变各个阶段中表型及基因型的特征或特性的物质，均称为肿瘤标志物。代谢组学是1999年英国帝国理工大学Jeremy Nicholson教授提出的，定性定量的分析生物体内代谢小分子物质的研究方法。对胃癌的代谢组学的研究，可以发现与胃癌有关的代谢小分子物质。通过胃癌的标志性小分子代谢物，有利于胃癌的早发现，早治疗，从而提高胃癌病人的生存质量。较早关于胃癌代谢组学的研究是2009年发表于Cancer Res的文章，而后又有多篇文章对胃癌的代谢组学进行阐述，通过对胃癌的研究，科学家发现了很多胃癌所导致的产生差异调节(包括上调和下调)的代谢小分子物质，例如：乳酸，苹果酸，尿酸，棕榈酸，丁酸，丙酸，嘧啶，甘油，丝氨酸，谷氨酸，鸟氨酸，脯氨酸等。

核磁共振波谱法(Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy，缩写为NMR)，是对各种有机和无机物的成分、结构进行定性分析的工具。其原理主要是：在强磁场中，某些元素的原子核和电子能量本身所具有的磁性，被分裂成两个或两个以上量子化的能级。吸收适当频率的电磁辐射，可在所产生的磁诱导能级之间发生跃迁。在磁场中，这种带核磁性的分子或原子核吸收从低能态向高能态跃迁的两个能级差的能量，会产生共振谱，可用于测定分子中某些原子的数目、类型和相对位置。尽管核磁共振波谱法在肿瘤代谢物检测中有所应用，但是迄今为止尚未见通过核磁共振波谱法构建的模型能够用于胃癌检测，且准确率达到85％以上的报道。

发明内容

本发明目的是为了克服已有对胃癌相关代谢小分子标志物检测技术的不足之处，提供一种用于检测胃癌相关代谢小分子标志物的核磁共振模型及其制备方法。

本发明的第一个发明目的是提供一种用于检测胃癌相关代谢小分子标志物的核磁共振模型，其特征在于利用核磁共振波谱仪测定胃癌患者和健康人血浆样本的代谢小分子，并筛选出相应的胃癌相关代谢小分子标志物，其中所述的胃癌相关代谢小分子标志物包括：beta-D-葡萄糖、乳酸、肌酸、肌酸酐、乙醇、亮氨酸、缬氨酸、组氨酸和脯氨酸。

本发明的第二个发明目的是提供一种上述用于检测胃癌相关代谢小分子标志物的核磁共振模型的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：收集多例II/III期胃癌患者血浆和健康人的血浆分别作为病例组和对照组血浆样本，进行低温冷冻备用；

步骤二：对所述血浆样本进行核磁共振波谱前预处理；

步骤三：对预处理过的两组血浆样本进行核磁共振波谱检测，并收集数据；

步骤四：对于核磁共振波谱检测到的代谢小分子，使用百分比差异度(PDV)进行评估，找出百分比差异度得分最大的代谢小分子；

步骤五：步骤五：以百分比差异度得分最大的代谢小分子的浓度作为聚类分割值，所述聚类分割值具体为利用正常血浆样本中该小分子浓度的均值，计算方法为将正常样本中该小分子的浓度加和，并除以正常样本的数目得到；因此，将全部样本分为2个子类，命名为M1子类和M2子类，并通过ROC曲线比较聚类前后的曲线线下面积；

步骤六：应用Mann-Whitney U test检验方法对所述M1子类和所述M2子类中的代谢小分子进行差异性检验，得到所述M1子类中，在病例组和对照组中存在明显差异的代谢小分子，以及得到所述M2子类中，在病例组和对照组中存在明显差异的代谢小分子，其中一部分代谢小分子在病例组中表达量过高，而另一部分代谢小分子的表达量在病例组中过低；

步骤七：将所述M1子类和所述M2子类中，在病例组和对照组中存在明显差异的所述代谢小分子作为胃癌相关代谢小分子标志物，建立用于胃癌相关代谢小分子标志物检测的核磁共振模型。

百分比差异度(PDV)评估，以及百分比差异度得分最大的代谢小分子的浓度的确定，详见参考文献8(Cheng,S.L.,B.F.Lian,J.Liang,T.Shi,L.Xie,and Y.L.Zhao,Siteselectivity for protein tyrosine nitration:insights from features ofstructure and topological network.Molecular Biosystems,2013.9(11):p.2860-2868.)。

在本发明的核磁共振模型中，步骤五中百分比差异度得分最大的代谢小分子是脯氨酸；步骤六中得到所述M1子类中，在病例组和对照组中存在明显差异的代谢小分子是beta-D-葡萄糖、肌酸酐、乙醇、组氨酸和脯氨酸；步骤六中得到所述M2子类中，在病例组和对照组中存在明显差异的代谢小分子是乳酸、肌酸、肌酸酐、亮氨酸、缬氨酸和组氨酸；其中乳酸、乙醇、亮氨酸、脯氨酸都在病例组中表达量过高，而beta-D-葡萄糖、肌酸、肌酸酐、缬氨酸、组氨酸的表达量在病例组中过低；作为胃癌相关代谢小分子标志物是beta-D-葡萄糖、乳酸、肌酸、肌酸酐、乙醇、亮氨酸、缬氨酸、组氨酸和脯氨酸。

进一步地，其中所述步骤一包括将从所述病例组和所述对照组取得的全血样本离心，去血细胞，保留血浆，得到血浆样本，进行低温冻存备用。

进一步地，其中所述步骤一还包括将得到的所述血浆样本以1倍到5倍体积的生理盐水稀释低温冻存备用。

进一步地，其中所述步骤二包括将所述血浆样本与Na+/K+缓冲液混匀后离心取上清液，以备核磁共振波谱检测用。

进一步地，其中所述步骤三进行核磁共振波谱检测时的检测条件是使用CPMG序列采集小分子信息，谱宽为15～25ppm，等待时间为1～3s，90°脉宽为10～12μs，采样点数为28～34K，FID累加次数为60～68次，回波演化时间为300～400us，回波循环为90～110，总回波时间为60～80ms。

在一个较佳的实施方案中，其中所述步骤三进行核磁共振波谱检测时的检测条件是使用CPMG序列采集小分子信息，谱宽为20ppm，等待时间为2s，90°脉宽为11.6μs，采样点数为32K，FID累加次数为64次,回波演化时间为350us，回波循环为100，总回波时间为70ms。

本发明的第三个发明目的是提供所述的代谢分子标志物组成的核磁共振模型，或者上述方法所制备的核磁共振模型，在检测胃癌中的应用。其中，所述的应用包括所述胃癌相关代谢小分子标志物组成的核磁共振模型，在胃癌诊断或监测中的应用。

在一种所述的核磁共振模型的应用中，使用最近邻算法，所述最近邻算法是对于每一个样本，使用血浆中代谢小分子的含量来对样本进行编码，每一个样本对于一个向量；利用向量之间的距离，来判断样本之间的相似性；二个样本向量之间的距离越大，相似性越大；二个样本向量之间的距离越小，相似性越小；向量之间距离的定义为：

距离(X,Y)＝X·Y/(‖X‖*‖Y‖)

其中，X·Y为点乘，‖X‖与‖Y‖分别为X与Y的模。

优选地，所述的核磁共振模型的应用，使用“刀切法”验证胃癌诊断的准确性，其方法是：

1)每次从样本集N中取出一个样本，用剩下的N-1个样本作为训练集来训练模型，然后用取出的那个样本来检验模型；

2)把刚才取出的样本放回，又取出另外一个样本；

3)重复检验N次，直到N个样本全部取遍；

4)统计模型应用最终的预测准确率。

有益效果

本发明与其它胃癌的检测方法相比，具有以下优点：

1)本发明方法使用血液作为检测的样本，与传统的内窥镜和钡餐诊断方法，对患者造成的伤害较小。

2)相较于癌症基因的筛查方法，本方法的成本较低，适于方法的大范围推广。

3)具有较高的敏感性和特异性，能够用于筛选抗肝癌的药物。

专业术语解释：

1)代谢小分子：是值在生命体中新陈代谢中存在的小分子，一般是指相对分子质量小于1000的小分子物质。

2)NMR：核磁共振波谱法(Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)，将核磁共振现象应用于测定分子结构的一种谱学技术。

3)百分比差异度(percentage-difference value，PDV)：是一种评价某个特征分布于特定集合的度量值。对于二分类，如果某个特征的PDV大于0，表明更多阳性集的样本具有该特征，反之，则表明更多阴性集的样本具有该特征。

4)Mann-Whitney U test：该方法用于检验这两个总体的均值是否有显著的差别。

5)代谢组学：是指研究代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式，研究对象大都是相对分子质量1000以内的小分子物质。

附图说明

图1是实施例一中25种代谢小分子的PDV的得分图。

图2是实施例一中聚类后M1与M2的ROC曲线。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施例对本发明做进一步的描述。

实施例一

一、核磁共振模型及其制备方法

步骤一：样本选择

根据2010年国际抗癌联盟/美国癌症联合委员会(UICC/AJCC)TNM分期标准，胃癌的分期则为：

●0期：肿瘤浸润至粘膜层，但未累及粘膜固有层，无局部淋巴结转移；

●IA期：凡肿瘤浸润至粘膜或粘膜下层者，无局部淋巴结转移；

●IB期：肿瘤浸润至粘膜或粘膜下层，伴有距原发灶3CM以内淋巴结转移；或肿瘤已浸润至肌层或浆膜下，但尚无局部淋巴结转移者；

●II期：肿瘤浸润至粘膜或粘膜下层，但已有距原发灶3CM以外局部淋巴结转移者；肿瘤已浸润肌层、浆膜下层，但仅有距原发灶3CM以内淋巴结转移；或肿瘤已穿透浆膜层，但尚无淋巴结转移；

●IIIA期：肿瘤浸润肌层或浆膜下，并有距原发灶3CM以外淋巴结转移；肿瘤已穿透浆膜外，但仅有3CM以内淋巴结转移；甚或肿瘤已侵及邻近组织、器官，但尚无淋巴结转移；

●IIIB期：肿瘤已穿透浆膜层并有3CM以外的淋巴结转移；或肿瘤已累及邻近组织器官，但有3CM以内淋巴结转移；

●IV期：肿瘤已累及邻近组织、器官，并有距原发灶3CM以外淋巴结转移；或已有远处转移的任何T、N。

实验样本来自于课题组前期973项目(2010CB933900)积累的胃癌血浆样本。根据2010年国际抗癌联盟/美国癌症联合委员会(UICC/AJCC)TNM分期标准，选择胃癌分期为II期的样本，共30例，同时，选择胃癌分期为III期的样本，共30例，合计60例胃癌样本，作为“病例组”。另外，选择30例健康样本最为“对照组”。其中，“病例组”分布为22～81岁，均值为55岁，男性42例，女性18例；“对照组”分布34～71岁，均值为55岁，男性26例，女性4例。“病例组”与“对照组”的年龄通过非参数检验，P＝0.939，性别通过卡方检验，P＝0.119(精确显著性，2端)。由此可知，抽样年龄、性别组间无差别，符合进行下一步分析的条件。

步骤二：样本处理

全血样本使用3000rpm的离心机进行5分钟的离心，而后在-80℃的冰箱进行保存。使用前，进行不超过20min的室温解冻，并混合生理盐水，一般为200uL样本：400uL生理盐水(在10％D₂O/90％H₂O中含有0.9％NaCl)，12000×g离心5min，吸取550uL进行-80℃冷藏，而后进行分析。

对于每一个血浆样本，抽取200uL作为检测对象，加入400uL Na+/K+缓冲液(45mM)(pH＝7.49，K₂HPO₄·3H₂O：0.830g；NaH₂PO₄·2H₂O：0.139g；D₂O：100ml；NaCl：0.9g)，涡旋震荡30s混匀后，离心(4℃，11180g，10min)得上清液。

步骤三：核磁共振波谱检测

取上述所得上清液550uL至5mm核磁管，混匀后进行核磁检测。其中，NMR的条件为：使用CPMG序列[RD-90°-(τ-180°-τ)n-ACQ]采集小分子信息。谱宽(SW)为20ppm，等待时间(RD)为2s，90°脉宽为11.6μs，采样点数为32K，FID累加次数为64次。回波演化时间(d20)为350us，回波循环(L4)为100，总回波时间(2nτ)为70ms。

共检测到25种代谢小分子，包括氨基酸、酸、醇、糖、胆碱等。具体为：

a)氨基酸：异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、甘氨酸、组氨酸和苯丙氨酸；

b)酸：3-羟基异丁酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、肌酸和甲酸；

c)醇：甲醇、乙醇和鲨肌醇；

d)肌酐：肌酸酐；

e)糖：alpha-D-葡萄糖和beta-D-葡萄糖；

f)其他：丙酮、胆碱和蛋白糖基。

步骤四：数据评估

对于NMR检测到的25种代谢小分子，使用百分比差异度(percentage-differencevalue，PDV)进行评估，发现脯氨酸的PDV得分最大(图1)，结果表明在病例组和对照组的样本中，癌症组的脯氨酸含量明显升高，在病例组和对照组中存在最大的差异。

步骤五：样本聚类

通过ROC曲线的比较聚类后的M1子类与M2子类曲线线下面积(图2)，发现以脯氨酸的浓度为聚类分割值，将全部样本分为2个子类以后，会得到更大的曲线线下面积，即得到更好的预测准确率。因此，将2个子类分别指定为M1和M2，其中，M1子类与M2子类中的样本比例为67:23。在M1子类中，病例组与对照组样本比例为52:15；在M2子类中，病例组与对照组的样本比例为8:15。

步骤六：差异性检验

对M1子类和M2子类中的25种代谢小分子进行差异性检验，检验的方法为Mann-Whitney U test，结果显示：

M1子类中，beta-D-葡萄糖(P＝0.007)、肌酸酐(P＝0.005)、乙醇(P＝0.026)、组氨酸(P＝0.000)和脯氨酸(P＝0.020)在癌症组和对照组中存在明显差异；

M2子类中，乳酸(P＝0.013)、肌酸(P＝0.000)、肌酸酐(P＝0.000)、亮氨酸(P＝0.019)、缬氨酸(P＝0.034)和组氨酸(P＝0.001)在癌症组和对照组中存在明显差异。

其中乳酸、乙醇、亮氨酸、脯氨酸都在病例组中表达量过高，而beta-D-葡萄糖、肌酸、肌酸酐、缬氨酸、组氨酸的表达量在病例组中过低。

步骤七：建立核磁共振模型

在M1子类中，使用beta-D-葡萄糖(P＝0.007)、乙醇(P＝0.026)、组氨酸(P＝0.000)和脯氨酸(P＝0.020)共4个代谢小分子作为标志物，在M2子类中，使用乳酸(P＝0.013)、肌酸(P＝0.000)、肌酸酐(P＝0.000)、亮氨酸(P＝0.019)、缬氨酸(P＝0.034)和组氨酸(P＝0.001)共6个代谢小分子作为标志物，合并后共为9种代谢小分子标志物，以此建立用于胃癌相关代谢小分子标志物检测的核磁共振模型。

二、应用

所述核磁共振模型的应用通过最近邻方法实现对胃癌进行筛查。首先，收集胃癌血液样本，使用3000rpm的离心机进行5分钟的离心，而后在-80℃的冰箱进行保存。使用前，进行不超过20min的室温解冻，并混合生理盐水，一般为200uL样本：400uL生理盐水(在10％D2O/90％H2O中含有0.9％NaCl)，12000×g离心5min，抽取200uL，加入400uL Na+/K+缓冲液(45mM)(pH＝7.49，K2HPO4·3H2O：0.830g；NaH2PO4·2H2O：0.139g；D2O：100ml；NaCl：0.9g)，涡旋震荡30s混匀后，离心(4℃，11180g，10min)得上清液，作为检测对象。其次，对血液样品进行核磁共振谱图的检测，取上述所得上清液550uL至5mm核磁管，混匀后进行核磁检测。其中，NMR的条件为：使用CPMG序列[RD-90°-(τ-180°-τ)n-ACQ]采集小分子信息。谱宽(SW)为20ppm，等待时间(RD)为2s，90°脉宽为11.6μs，采样点数为32K，FID累加次数为64次。回波演化时间(d20)为350us，回波循环(L4)为100，总回波时间(2nτ)为70ms，得到9种代谢小分子，beta-D-葡萄糖、乳酸、肌酸、肌酸酐、乙醇、亮氨酸、缬氨酸、组氨酸和脯氨酸的浓度。其次，应用于胃癌的预测模型，对样本进行聚类，并对每一个样本，使用血浆中代谢小分子的含量来对样本进行编码，每一个样本对应一个向量。利用向量之间的距离，来判断样本之间的相似性。二个样本向量之间的距离越大，相似性越大；二个样本向量之间的距离越小，相似性越小。向量之间距离的定义为：

距离(X,Y)＝X·Y/(‖X‖*‖Y‖)

其中，X·Y为点乘，‖X‖与‖Y‖分别为X与Y的模。

使用“刀切法”验证胃癌诊断的准确性，其方法是：

1)每次从样本集N中取出一个样本，用剩下的N-1个样本作为训练集来训练模型，然后用取出的那个样本来检验模型；

2)把刚才取出的样本放回，又取出另外一个样本；

3)重复检验N次，直到N个样本全部取遍；

4)统计模型应用最终的预测准确率。

将M1和M2综合分析，得到胃癌诊断的准确率为70.8％，敏感度为81.6％、特异度为60.0％。其中，在M1子类中，使用beta-D-葡萄糖、乙醇、组氨酸和脯氨酸共4个代谢小分子作为标志物，测试得到的胃癌诊断准确率为69.9％，其中，敏感度为86.5％，特异度为53.3％。在M2子类中，使用乳酸、肌酸、肌酸酐、亮氨酸、缬氨酸和组氨酸共6个代谢小分子作为标志物，测试得到的胃癌诊断准确率为67.0％，其中，敏感度为50.0％，特异度为66.7％。

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以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (6)

1.一种用于检测胃癌相关代谢小分子标志物的核磁共振模型的制备方法，所述用于检测胃癌相关代谢小分子标志物的核磁共振模型，利用核磁共振波谱仪测定胃癌患者和健康人血浆样本的代谢小分子，并筛选出相应的胃癌相关代谢小分子标志物，其中所述的胃癌相关代谢小分子标志物包括：beta-D-葡萄糖、乳酸、肌酸、肌酸酐、乙醇、亮氨酸、缬氨酸、组氨酸和脯氨酸；

包括以下步骤：

步骤一：收集多例II/III期胃癌患者血浆和健康人的血浆分别作为病例组和对照组血浆样本，进行低温冷冻备用；

步骤二：对所述血浆样本进行核磁共振波谱前预处理；

步骤三：对预处理过的两组血浆样本进行核磁共振波谱检测，并收集数据；

步骤四：对于核磁共振波谱检测到的代谢小分子，使用百分比差异度进行评估，找出百分比差异度得分最大的代谢小分子；

步骤五：以百分比差异度得分最大的代谢小分子的浓度作为聚类分割值，所述聚类分割值具体为利用正常血浆样本中该小分子浓度的均值，计算方法为将正常样本中该小分子的浓度加和，并除以正常样本的数目得到；因此，将全部样本分为2个子类，命名为M1子类和M2子类，并通过ROC曲线比较聚类前后的曲线线下面积；

步骤六：应用Mann-Whitney U test检验方法对所述M1子类和所述M2子类中的代谢小分子进行差异性检验，得到所述M1子类中，在病例组和对照组中存在明显差异的代谢小分子beta-D-葡萄糖、肌酸酐、乙醇、组氨酸和脯氨酸，以及得到所述M2子类中，在病例组和对照组中存在明显差异的代谢小分子乳酸、肌酸、肌酸酐、亮氨酸、缬氨酸和组氨酸，其中一部分代谢小分子在病例组中表达量过高，而另一部分代谢小分子的表达量在病例组中过低；

步骤七：将所述M1子类和所述M2子类中，在病例组和对照组中存在明显差异的所述代谢小分子作为胃癌相关代谢小分子标志物，建立用于胃癌相关代谢小分子标志物检测的核磁共振模型。

2.如权利要求1所述的制备方法，其中所述步骤一包括将从所述病例组和所述对照组取得的全血样本离心，去血细胞，保留血浆，得到血浆样本，进行低温冻存备用。

3.如权利要求2所述的制备方法，其中所述步骤一还包括将得到的所述血浆样本以1倍到5倍体积的生理盐水稀释低温冻存备用。

4.如权利要求1所述的制备方法，其中所述步骤二包括将所述血浆样本与Na+/K+缓冲液混匀后离心取上清液，以备核磁共振波谱检测用。

5.如权利要求2～4任一项所述的制备方法，其中所述步骤三进行核磁共振波谱检测时的检测条件是使用CPMG序列采集小分子信息，谱宽为15～25ppm，等待时间为1～3s，90°脉宽为10～12μs，采样点数为28～34K，FID累加次数为60～68次，回波演化时间为300～400us，回波循环为90～110，总回波时间为60～80ms。

6.如权利要求2～4任一项所述的制备方法，其中所述步骤三进行核磁共振波谱检测时的检测条件是使用CPMG序列采集小分子信息，谱宽为20ppm，等待时间为2s，90°脉宽为11.6μs，采样点数为32K，FID累加次数为64次,回波演化时间为350us，回波循环为100，总回波时间为70ms。