CN116008409A - 一种鹿角胶特征图谱的构建方法及其应用 - Google Patents
一种鹿角胶特征图谱的构建方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于中药质量控制领域，具体涉及一种鹿角胶特征图谱的构建方法及其应用。本发明通过以下方法实现：首先制备样品，然后通过分析后得到马鹿、梅花鹿、驼鹿、驯鹿、白尾鹿鹿角胶多肽质谱数据，将质谱数据转化为肽段序列，并进行统计学分析；选择相对专属的肽段作为特征多肽，采用超高效液相‑三重四级杆质谱联用的检测方法，靶向采集特征离子，验证特征多肽的专属性；选择在马鹿、梅花鹿鹿角胶中存在，其他易掺伪品种不存在的特征多肽，使用梅花鹿和马鹿的鹿角胶作为对照参照物建立鹿角胶特征图谱。本发明通过超高效液相‑三重四级杆质谱建立了鹿角胶特征图谱的策略，能够有效的评价鹿角胶的质量，且分析时间短，操作简单。
Description
技术领域
本发明属于中药质量控制领域，具体涉及一种鹿角胶特征图谱的构建方法及其应用。
背景技术
鹿角胶是传统中药，也是在亚洲广泛使用的保健食品。是使用梅花鹿或马鹿已骨化的鹿角经水熬煮，浓缩制成的固体胶。呈黄棕色或红棕色，半透明。鹿角胶入药历史有两千多年，始载于《神农本草经》中，古时称其为“鹿角仙胶”。已广泛应用于眩晕、心悸、血尿、失眠，作为年长者或产后妇女等体质较弱者的常用补品，或进一步加工成某些人群的健康补充剂，可以用来治疗顽固性贫血，对股骨头坏死与骨质疏松症也有一定疗效，可以作为优秀的抗氧化、抗炎剂和免疫调节剂。现代研究表明，使用鹿角胶可以预防阿尔兹海默症、帮助重建具有良好干细胞活性和表皮分化的皮肤等效物，鹿角胶中含有的鹿茸多肽也被证明对肺损伤、肝损伤有一定疗效。因此，鹿角胶作为保健食品与药品正在越来越被世界认可，规范鹿角胶的市场对其全球化发展至关重要。
梅花鹿、马鹿的雄鹿生有鹿角，一年脱落一次，用其制成的鹿角胶出胶率很低。较高市场需求与难得的原料使得鹿角胶的价格水涨船高，市场价约为530美元一公斤，是名贵中药阿胶的3倍。目前，使用其他更加便宜且容易获取的原料代替梅花鹿角或马鹿角投料的现象屡见不鲜，最常见的是猪、马、牛、驴的皮。近年来，已经有使用其他物种的皮掺伪或完全代替鹿角的研究，但是目前还没有针对近缘鹿种角类掺伪或完全替代问题的解决策略报道。驯鹿雌鹿和雄鹿均可以生角，而驼鹿作为世界上最大的鹿，则有一副向两侧平摊、宽度可接近2米的掌状角，此外，白尾鹿在北美洲广泛分布，且驯鹿、驼鹿、白尾鹿的原产地没有割取鹿茸的习俗，大量的鹿角比较容易取得。这种情况下，出现了以驯鹿角、驼鹿角、白尾鹿角掺伪甚至完全取代梅花鹿角和马鹿角制作鹿角胶的情况出现。鹿角胶是名贵的中药和营养补充剂，是使用马鹿或梅花鹿的鹿角为原料反复煎煮后浓缩而成的固体胶。由于外观和物理化学性质相似，并且遗传物质在复杂的制备过程中被破坏，使用遗传物质鉴定的方法将鹿角胶与使用其他来源掺伪或完全替代马鹿鹿角、梅花鹿鹿角所制成的明胶区分开来困难重重，现有方法无法整体评价鹿角胶的质量，急需一种专属性强、检测效率高的检验方法解决这一问题。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种鹿角胶特征图谱的构建方法。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种鹿角胶特征图谱的构建方法，包括以下步骤：
（1）样品制备：分别将马鹿、梅花鹿、驼鹿、驯鹿、白尾鹿的鹿角胶粉碎，取粉末，精密称定，精密加入碳酸氢胺溶液，超声，用微孔滤膜过滤，取续滤液，加牛胰蛋白酶溶液，酶解过夜，取出放冷至室温，离心，取上清液；
（2）将上清液通过纳升液相色谱-高分辨质谱分析后，得到马鹿、梅花鹿、驼鹿、驯鹿、白尾鹿鹿角胶多肽质谱数据；
（3）将质谱数据转化为肽段序列，并进行统计学分析；
（4）选择相对专属的肽段作为特征多肽，采用超高效液相-三重四级杆质谱联用的检测方法，靶向采集特征离子，验证特征多肽的专属性；
（5）将选择的特征肽段进行人工合成，合成后的肽段和鹿角胶样品分别进入超高效液相-三重四级杆质谱进行分析，验证出峰时间是否一致；同时，将合成的特征肽段加入鹿角胶样品中，进入超高效液相-三重四级杆质谱分析，验证出峰个数；当合成的特征肽段与鹿角胶样品出峰时间一致且加标的样品只出一个峰时，认为该特征肽段的序列与样品中序列一致；
（6）选择在马鹿、梅花鹿鹿角胶中存在，其他易掺伪品种不存在的特征多肽，选择响应较高的子离子作为定量离子与定性离子，使用梅花鹿和马鹿的鹿角胶作为对照参照物建立鹿角胶特征图谱；
（7）使用鹿角胶对照药材制备对照药材参照物溶液，将对照药材参照溶液与样品同时进入超高效液相-三重四级杆质谱分析使用特征图谱特征肽段离子定向采集，供试品色谱中应呈现与对照药材参照物色谱相对应的6个特征峰，且应分别与相应对照药材参照物峰的保留时间相对应。
进一步的，步骤（1）中，所述样品制备具体过程为：将鹿角胶粉碎，取粉末20 mg，精密称定，精密加入5 ml 25 mM碳酸氢胺溶液，超声30分钟，用微孔滤膜过滤，取续滤液95 μL，加浓度为10 mg/ml的牛胰蛋白酶溶液5 μL，37℃酶解过夜，取出放冷至室温，取上清液。
进一步的，步骤（2）中，所述纳升液相色谱-高分辨质谱的检测条件为：使用100 μm×3.5 cm，粒径5 μm的C18柱进行样品的脱盐富集，使用75 μm×15 cm，粒径为3 μm的C18柱进行样品分离，流动相的流速为300 nL/min，流动相A为2%乙腈的0.1%甲酸水溶液，流动相B为含98%乙腈的0.1%甲酸水溶液，进行梯度洗脱，进样量为1 μL；高分辨质谱条件：离子源为Nanospray Flex离子源，正离子模式进行分析，喷雾电压为1800 V，离子传输毛细管温度为275 ℃，S-Lens传输效率为60%；一级质谱采用Orbitrap作为质量分析器，分辨率为60000，采集范围为350～1550（m/z）；二级质谱采用Orbitrap作为质量分析器，采用Rapid Scan模式进行扫描，利用Top 20数据依赖模式进行母离子选择，采用HCD模式进行碎裂，碎裂能量NCE设置为40%。
上述梯度洗脱为：
0～1 min, 1% B→6% B;1～96 min, 6% B→22% B; 96～113 min, 22% B→30%B; 113～117 min, 30 %B→95 %B; 117～120 min, 95% B。
进一步的，步骤（4）中，所述特征多肽具体为：
上述特征多肽的正离子模式下的 MRM 参数为：
进一步的，步骤（4）和（7）中，所述超高效液相-三重四级杆质谱的参数为：色谱柱填料为 C18，2.1×100 mm，粒径1.8 μm，型号Agilent ZORBAX RRHD SB，柱温43℃，流速0.3mL/min，流动相A为含有0.1%甲酸的水溶液，B为含有0.1%甲酸的甲醇乙腈溶液，进行梯度洗脱，溶剂延迟为0～3 min和21～23 min；进样量5 uL，采用质谱检测器，电喷雾离子化（ESI），正离子模式下，进行多反应监测；鞘气流速46 L/hr；辅助气流速850 L/hr；喷雾电压3.5 kV；离子源温度150 ℃；辅助气温度400 ℃。锥孔电压30 V，碰撞电压35 V。
进一步的，步骤（4）和（7）中，所述梯度洗脱为：0～2 min, 3% B→7.5% B; 2～12min, 7.5% B→25% B; 12～17 min, 25% B→90% B; 17～19 min, 90% B; 19～19.5min, 90% B→97% B, 19.5～23 min, 97% B。
进一步的，所述特征图谱使用的特征肽段为Pep2、Pep3、Pep5、Pep11、Pep12、Pep13；所述特征图谱中应呈现6个特征峰，以Pep5参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内，规定值为：0.68（Pep12）、0.76（Pep11）、0.80（Pep13）、0.87（Pep2）、1.27（Pep3）。
本发明还提供了一种利用上述构建方法得到的特征图谱在鹿角胶药材质量控制中的应用。
本发明使用5种鹿科动物的14批自制鹿角胶样品，采用纳升液相色谱-高分辨质谱联合数据分析发现鹿角胶AHSG蛋白和胶原蛋白中具有专属性的特征多肽，通过超高效液相-三重四级杆质谱验证并建立了鹿角胶特征图谱策略。共找到16个特征多肽，分别具有不同的专属性，在此基础上，选择其中的6条建立了鹿角胶特征图谱策略，评价了20批来自市场的鹿角胶质量。
本发明的有益效果为：
（1）本发明通过纳升液相色谱-高分辨质谱联合数据分析软件发现胶原蛋白和AHSG蛋白中鹿角胶的特征多肽，专属性强；
（2）本发明通过超高效液相-三重四级杆质谱建立了鹿角胶特征图谱的策略，能够有效的评价鹿角胶的质量，且分析时间短，操作简单。
附图说明
图1为鹿角胶样品肽段鉴定结果的数据分析维恩图。
图2为特征多肽的专属性。
图3为用于建立特征图谱方法的相应序列分析图。
图4为鹿角胶特征图谱的方法建立。（A）拟合的鹿角胶特征图谱。（B）特征图谱和对照参照物的拟合结果。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
（一）试剂与材料
胰蛋白酶（Sigma公司生产，批号：SLBG6452V）碳酸氢铵。甲酸、乙腈均为色谱纯，水为超纯水。
从中国不同地区市场中采集了14批鹿角用来自制明胶。阿胶（驴皮明胶）、新阿胶（猪皮明胶）、黄明胶(牛皮明胶)来自中国食品药品检定研究院对照药材，鹿皮明胶、马皮明胶来自企业。商品化鹿角胶20批采购于中国市场(表1)。
表1
实施例1
（1）鹿角胶的制备方法为：将原料粉碎，取250 g，置1000 ml水中浸泡，12小时换水1次，共换4次。浸泡后的样品置锅中，加水1000 ml，加热110℃熬煮，保持水量稳定。每8小时取汁一次，煮至样品软烂，将所得胶汁合并过滤、浓缩，即得。
用于质谱分析的样品的制备方法为：将制得的明胶粉碎，取粉末20 mg，精密称定，精密加入5 ml 25 mM碳酸氢胺溶液，超声30分钟。用微孔滤膜过滤，取续滤液95 μL，加牛胰蛋白酶溶液5 μL（10 mg/ml），37℃酶解过夜，取出放冷至室温，即得。
（2）纳升液相-高分辨质谱测定条件
样品被进入纳升液相（EASY-nLC 1000，Thermo Scientific）联用高分辨质谱（Orbitrap-Fusion，Thermo Scientific）分析，条件：以Thermo Acclaim PepMap C18柱（100 μm×3.5 cm，5 μm）脱盐富集，Thermo Acclaim PepMap C18柱（75μm×15cm，3 μm）分离，流速300 nL/min，流动相A为2%乙腈的0.1%甲酸水溶液，流动相B为含98%乙腈的0.1%甲酸水溶液，进行梯度洗脱(0～1 min,1% B→6% B; 1～96 min, 6% B→22% B; 96～113min, 22% B→30% B; 113～117 min, 30% B→95% B; 117～120 min, 95% B）进样量为1μL。高分辨质谱条件：离子源为Nanospray Flex源。以正离子模式进行分析，喷雾电压为1800 V，离子传输毛细管温度为275 ℃，S-Lens传输效率设置为60%。一级质谱采用Orbitrap作为质量分析器，分辨率为60000，采集范围为350～1550 （m/z）；二级质谱采用Orbitrap作为质量分析器，采用Rapid Scan模式进行扫描，利用Top 20数据依赖模式进行母离子选择，采用HCD模式进行碎裂，碎裂能量NCE设置为40%。
（3）质谱数据分析并发现特征多肽
上清液通过纳升液相色谱-高分辨质谱分析后，使用将质谱数据导入PEAKS 8.5软件，设置条件如下：查询类型为同源匹配，可变修饰：氧化（M）：15.99，羟脯氨酸（P）:15.99，乙酰化（K）：42.01，开放搜索设为是，母离子质量误差容限：15.0 ppm，碎裂片段质量误差容限：0.02 Da，最大遗漏量：0.02 Da，最大漏切数：3，每条肽段的最大可翻译后修饰：6，肽段带电荷数：2-8。实验中发现鹿角胶中胶原蛋白与AHSG蛋白高度富集，故使用部分偶蹄类动物 “COL1A1、COL2A1、AHSG” 蛋白的数据库，下载自Uniport，进行全部肽段的从头测序及肽段匹配。
（4）鹿角胶特征图谱策略
发明人选择了相对专属的特征多肽（表2）来建立鹿角胶特征图谱策略，特征多肽的特异性验证如图2所示。为了使各峰的分离度更好，将超高效液相-三重四级杆质谱方法设置为：色谱柱为 C18 (2.1×100mm，1.8μm，Agilent ZORBAX RRHD SB )，柱温43℃，流速0.3mL/min，流动相A为含有0.1%甲酸的水溶液，B为含有0.1%甲酸的甲醇乙腈溶液，进行梯度洗脱（0~2 min, 3% B→7.5% B; 2~12 min, 7.5% B→25% B; 12~17 min, 25% B→90%B; 17~19 min, 90% B; 19~19.5 min, 90% B→97% B, 19.5~23 min,97% B），溶剂延迟（solvent delay）为0～3 min和21～23 min。进样量5 uL，采用质谱检测器，电喷雾离子化（ESI），正离子模式下，进行多反应监测；鞘气流速46 L/hr；辅助气流速850 L/hr；喷雾电压3.5KV；离子源温度150℃；辅助气温度400℃。锥孔电压30V，碰撞电压35V)。
表2
结果与分析
（一）纳升液相色谱-高分辨质谱数据分析
AHSG蛋白是非胶原蛋白的骨基质主要成分之一，在角中含量极高，并且AHSG蛋白耐热性好，高温状态下依然很稳定，所以发明人认为AHSG中的特征多肽会成为鹿角胶质量评价的关键。使用鹿角胶酶解消化后的肽段混合物进入纳升液相色谱-高分辨质谱，得到所有鹿角胶蛋白消化肽段的高分辨质谱数据，导入PEAKS软件分析，共匹配到20117条肽段，选择部分偶蹄类动物COL1A1、COL2A1与AHSG的数据库进行检索，共鉴定到9918条肽，对鉴定到的肽段专属性进行统计学分析（图1） ，并从中选择响应强、专属性好、长度7-20个氨基酸，翻译后修饰比较少的肽段进行下一步验证。
（二） 鹿角胶质量评价方法的建立
本发明使用超高效液相-三重四级杆质谱建立鹿角胶的MRM质量评价方法，因为与纳升液相色谱-高分辨质谱相比，它的分析时间更短，操作更加容易，仪器更加便宜。
（1）鹿角胶特征图谱策略
本发明选择梅花鹿角胶、马鹿鹿角胶中存在，但易掺伪明胶当中不存在的Pep2（驯鹿角胶、驴皮明胶、牛皮明胶、马皮明胶没有）、Pep3（驯鹿角胶、驴皮明胶、马皮明胶、猪皮明胶没有）、Pep5（仅马鹿角胶、梅花鹿角胶中有）、Pep11（驯鹿角胶、驼鹿角胶、驴皮明胶、牛皮明胶、马皮明胶、猪皮明胶没有）、Pep12（驼鹿角胶、驴皮明胶、马皮明胶、猪皮明胶没有）、Pep13（驯鹿角胶、白尾鹿角胶、牛皮明胶没有），使用6批梅花鹿和马鹿的鹿角胶作为对照参照物建立特征图谱，鹿角胶色谱中应呈现6个特征峰，以Pep5参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内，规定值为：0.68（Pep12）、0.76（Pep11）、0.80（Pep13）、0.87（Pep2）、1.27（Pep3）。
（三）市场上20批鹿角胶质量评价
根据我们所建立的鹿角胶特征图谱分析策略，对市场上20批市售的鹿角明胶的质量进行评价，发现6批不符合特征图谱方法规定，具体情况见表3。
表3
Claims (10)
1.一种鹿角胶特征图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）样品制备：分别将马鹿、梅花鹿、驼鹿、驯鹿、白尾鹿的鹿角胶粉碎，取粉末，精密称定，精密加入碳酸氢胺溶液，超声，用微孔滤膜过滤，取续滤液，加牛胰蛋白酶溶液，酶解过夜，取出放冷至室温，离心，取上清液；
（2）将上清液通过纳升液相色谱-高分辨质谱分析后，得到马鹿、梅花鹿、驼鹿、驯鹿、白尾鹿鹿角胶多肽质谱数据；
（3）将质谱数据转化为肽段序列，并进行统计学分析；
（4）选择相对专属的肽段作为特征多肽，采用超高效液相-三重四级杆质谱联用的检测方法，靶向采集特征离子，验证特征多肽的专属性；
（5）将选择的特征肽段进行人工合成，合成后的肽段和鹿角胶样品分别进入超高效液相-三重四级杆质谱进行分析，验证出峰时间是否一致；同时，将合成的特征肽段加入鹿角胶样品中，进入超高效液相-三重四级杆质谱分析，验证出峰个数；当合成的特征肽段与鹿角胶样品出峰时间一致且加标的样品只出一个峰时，认为该特征肽段的序列与样品中序列一致；（6）选择在马鹿、梅花鹿鹿角胶中存在，其他易掺伪品种不存在的特征多肽，选择响应较高的子离子作为定量离子与定性离子，使用梅花鹿和马鹿的鹿角胶作为对照参照物建立鹿角胶特征图谱；
（7）使用鹿角胶对照药材制备对照药材参照物溶液，将对照药材参照溶液与样品同时进入超高效液相-三重四级杆质谱分析使用特征图谱特征肽段离子定向采集，供试品色谱中应呈现与对照药材参照物色谱相对应的6个特征峰，且应分别与相应对照药材参照物峰的保留时间相对应。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）中，所述样品制备具体过程为：将鹿角胶粉碎，取粉末20 mg，精密称定，精密加入5 ml 25 mM碳酸氢胺溶液，超声30分钟，用微孔滤膜过滤，取续滤液95 μL，加浓度为10 mg/ml的牛胰蛋白酶溶液5 μL，37℃酶解过夜，取出放冷至室温，取上清液。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）中，所述纳升液相色谱-高分辨质谱的检测条件为：使用100 μm×3.5 cm，粒径5 μm的C18柱进行样品的脱盐富集，使用75 μm×15 cm，粒径为3 μm的C18柱进行样品分离，流动相的流速为300 nL/min，流动相A为2%乙腈的0.1%甲酸水溶液，流动相B为含98%乙腈的0.1%甲酸水溶液，进行梯度洗脱，进样量为1 μL；高分辨质谱条件：离子源为Nanospray Flex离子源，正离子模式进行分析，喷雾电压为1800 V，离子传输毛细管温度为275 ℃，S-Lens传输效率为60%；一级质谱采用Orbitrap作为质量分析器，分辨率为60000，采集范围为350～1550（m/z）；二级质谱采用Orbitrap作为质量分析器，采用Rapid Scan模式进行扫描，利用Top 20数据依赖模式进行母离子选择，采用HCD模式进行碎裂，碎裂能量NCE设置为40%。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述梯度洗脱为：
0～1 min, 1% B→6% B;1～96 min, 6% B→22% B; 96～113 min, 22% B→30% B;113～117 min, 30 %B→95 %B; 117～120 min, 95% B。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（4）中，所述特征多肽具体为：
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述特征多肽的正离子模式下的 MRM参数为：
7.根据权利要求1、5或6所述的构建方法，其特征在于，步骤（4）和（7）中，所述超高效液相-三重四级杆质谱的参数为：色谱柱填料为 C18，2.1×100 mm，粒径1.8 μm，型号AgilentZORBAX RRHD SB，柱温43℃，流速0.3 mL/min，流动相A为含有0.1%甲酸的水溶液，B为含有0.1%甲酸的甲醇乙腈溶液，进行梯度洗脱，溶剂延迟为0～3 min和21～23 min；进样量5uL，采用质谱检测器，电喷雾离子化（ESI），正离子模式下，进行多反应监测；鞘气流速46 L/hr；辅助气流速850 L/hr；喷雾电压3.5 kV；离子源温度150 ℃；辅助气温度400 ℃；锥孔电压30 V，碰撞电压35 V。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述梯度洗脱为：0～2 min, 3% B→7.5% B; 2～12 min, 7.5% B→25% B; 12～17 min, 25% B→90% B; 17～19 min, 90%B; 19～19.5 min, 90% B→97% B, 19.5～23 min, 97% B。
9.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述特征图谱使用的特征肽段为Pep2、Pep3、Pep5、Pep11、Pep12、Pep13；所述特征图谱中应呈现6个特征峰，以Pep5参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内，规定值为：0.68（Pep12）、0.76（Pep11）、0.80（Pep13）、0.87（Pep2）、1.27（Pep3）。
10.一种如权利要求1-9任一项所述的构建方法得到的特征图谱在鹿角胶药材质量控制中的应用。
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