CN109964131A - 用于测量血浆肾素活性的方法和系统 - Google Patents

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Abstract

公开了用于样品中定量AngI和/或测定血浆肾素活性的方法和系统。本文公开的方法和系统可以用于诊断高血压、醛甾酮增多症及肾素血管紧张素醛固酮系统(RAAS)的其它异常。

Description

用于测量血浆肾素活性的方法和系统
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年11月17日提交的美国临时申请No.62/423,550的权益，将其全部内容通过援引并入本文。
发明领域
本发明涉及用于测定血浆肾素活性的方法和系统。
背景技术
血浆肾素活性(PRA)衡量周围血液产生肽血管紧张素I(AngI)的能力，并且在诊断肾素血管紧张素醛固酮系统(RAAS)的病症方面很重要。在RAAS中，本质上由肝脏产生的血管紧张素原被肾素水解，形成AngI，肾素是一种由肾脏肾球旁小体产生的酶。AngI可以被血管紧张素转换酶(ACE)切割，产生血管紧张素II(AngII)，血管紧张素II是一种强有力的血管收缩剂和大量下游RAAS作用的调节剂(mediator)。测量肾素活性在鉴别诊断患有高血压的个体中是有用的。在患有由于肾动脉狭窄引起的高血压(即，肾血管性高血压)的患者中，肾素水平升高。测量肾素活性在诊断原发性醛甾酮增多症中也是有用的。患有继发性醛固酮症的患者往往具有低肾素水平。肾素活性也可以用于评价患有肾上腺功能不全的患者中类固醇替代的适当性。肾素活性在具有足够补充的患者中将是正常的，当类固醇替代不足时，其将会升高。
因此，存在测量血浆肾素活性的改进的实验室试验的需要。需要更经济有效的改进的实验室试验，从而允许更频繁地试验以及更快地提供给临床医师试验结果。
发明简述
本发明提供用于测定血浆肾素产生血管紧张素I(AngI)的活性的方法和系统，血管紧张素I在诊断肾素血管紧张素醛固酮系统的病症中很重要。在某些实施方案中，本发明包括一种通过质谱和/或液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测量AngI生成的方法。在某些实施方案中，本发明包括一种证实正确的样品类型为EDTA-血浆的方法。本发明可以以多种方式具体描述。
在一个实施方案中，本发明包括一种测定样品中AngI的量的方法。所述方法可以包括在适于允许血浆肾素从样品中存在的血管紧张素原产生具有序列NH2-DRVYIHPFHL-COOH(SEQ ID NO:1)的AngI肽的条件下培养样品；加入蛋白酶或化学水解试剂；在允许所述蛋白酶或化学水解试剂水解AngI产生所定义的AngI裂解产物的条件下培养样品；电离所述AngI裂解产物，产生一个或多个质谱可检测的离子；和通过质谱检测所述AngI裂解产物离子。
在某些实施方案中，所述方法可以包括使用内标准。例如，所述方法可以包括向样品中加入稳定的同位素-标记的AngI肽(SIL-AngI)作为内标准的步骤。如下述详细讨论的，内标准可选自多种合适的标准。在某些实施方案中，SIL-AngI为肽NH2-DRV^YIHP^F^HL-COOH(SEQ ID NO:3)，其中^指重同位素标记的氨基酸。例如，在一个实施方案中，V^为(13C)5H11(15N)O2，具有+6的质量偏移；P^为(13C)5H9(15N)O2，具有+6的质量偏移；和F^为(13C)9H11(15N)O2，具有+6的质量偏移。注意到，存在其他实施方案，其中SIL-AngI为肽NH2-DRVYIHPFHL-COOH(SEQ ID NO:1)其中许多氨基酸组合可以用重同位素标记，不限于本文研究的实施例中使用的内标准(SEQ ID NO:3)。
内标准提供一种定量每个步骤的AngI肽和/或AngI裂解产物的量的方式。在可替代的实施方案中，在血浆肾素介导的AngI生成之前或之后，但是在加入蛋白酶步骤之前，加入SIL-AngI肽。因此，在某些实施方案中，AngI裂解产物的量与蛋白酶产生的SIL-AngI裂解产物的量成正比。
所述方法也可包括外部校准(即，参考)标准，其提供了已知量的AngI与样品比较，以便定量样品AngI。因此，在某些实施方案中，所述方法可以包括产生多数校准标准的步骤，所述校准标准包括在合适的基质中已知量的AngI，其中所述参考标准为SEQ ID NO：1的AngI，其经历与样品AngI相同的步骤。在某些实施方案中，外部校准标准没有经历所有测定步骤，但是在最后的电离和质谱的步骤加入。因此，在某些实施方案中，通过比较样品中AngI的量与多数校准标准的至少一种中AngI的量来定量所述样品中AngI的量。校准标准通常应当包括涵盖样品中AngI的预期范围的浓度范围。例如，在某些实施方案中，校准标准包括范围0.25至100ng/mL的AngI。或者，可以使用更大或更窄的范围。
所述方法包括产生用于MS/MS测量的AngI衍生物。在某些实施方案中，所述衍生物是通过用蛋白酶培养样品AngI生成的。在某些实施方案中，蛋白酶为丝氨酸蛋白酶。例如，在一个实施方案中，蛋白酶为胰蛋白酶。例如，蛋白酶裂解产生具有序列NH2-VYIHPFHL-COOH(SEQ ID NO:2)的AngI裂解产物。在某些实施方案中，蛋白酶产生具有序列NH2-V^YIHP^F^HL-COOH(SEQ ID NO:4)的SIL-AngI裂解产物。
在某些实施方案中，所述AngI衍生物(即，裂解产物)是水解产生的。例如，在某些实施方案中，化学水解试剂为甲酸、乙酸、盐酸或能够水解AngI的任何其它试剂。
当AngI裂解产物为SEQ ID NO:2的AngI时，AngI离子选自具有质/荷比为513.3±2、269.2±2、392.7±2、257.1±2的离子。类似地，其中SIL-AngI裂解产物为SEQ ID NO:4的SIL-AngI，所述SIL-AngI离子选自具有质/荷比为524.3±2、779.5±269.2±2的离子。
所述方法中可以包括其它步骤。例如，在某些实施方案中，所述方法可以包括在蛋白酶消化的步骤之前终止血浆肾素活性的步骤。如下述更详细地讨论的，可以使用多种化学试剂和/或物理处理(例如，加热)终止血浆肾素活性。例如，在某些实施方案中，向样品中加入甲醇终止血浆肾素活性。当加入有机溶剂(例如，甲醇)时，所述方法可以进一步包括蒸发溶剂(例如，甲醇)，然后在蛋白酶消化步骤之前在缓冲液中重构样品的步骤。
可以在质谱之前，进一步纯化样品中的AngI裂解产物(和内标准)以及任选的校准标准。例如，在某些实施方案中，所述方法包括在质谱之前使AngI裂解产物进行液相色谱的步骤。
如本文详细讨论的，可以使用多种质谱方法。在一个实施方案中，电离室是具有选择反应监测(SRM)的正电喷雾电离。
可以使用多种样品，在某些实施方案中，样品为得自患者的生物流体。例如，在某些实施方案中，生物流体为血浆。在一个实施方案中，血浆包括作为抗凝血剂的乙二胺四乙酸(EDTA)。
在某些实施方案中，样品被证实为包含EDTA的血浆样品。因此，所述方法可以包括从样品移出等分试样，并且在培养步骤产生AngI之前检验EDTA的存在。在一个实施方案中，EDTA存在的检测包括加入比色试剂邻-甲酚酞络合酮，与样品中的钙离子反应，使得包括EDTA的样品保持颜色基本上不变，而不具有EDTA的样品由于钙与比色试剂反应引起颜色变化。
所述方法还是一种根据任一项前述实施方案的测量血浆肾素活性(PRA)的方法，其中基于样品中AngI肽的量计算PRA的水平。在一个实施方案中，血浆肾素活性定义为每单位时间产生AngI的量。例如，在某些实施方案中，血浆肾素活性表示为ng/mL/hr。在一个实施方案中，血浆肾素活性具有从约0.167-66.667ng/mL/hr的分析可测量的范围(AMR)。
测定的实施方案都是灵敏的和高度特异性的。在某些实施方案中，定量下限(LLOQ)为0.167ng/mL/hr，和定量上限(ULOQ)为66.667ng/mL/hr。
在其它实施方案中，本发明包括一种测定样品中AngI的水平和/或血浆肾素活性的系统。所述系统可以包括用于进行本文公开的方法的各步骤的各种操作台(station)和/或组成部分。例如，所述系统可以包括用于在从血管紧张素原产生AngI的条件下培养样品的操作台(或组成部分)。所述系统也可任选地包括用于向AngI肽加入内标准(例如，SIL-AngI)的操作台(或组成部分)。另外，所述系统也可任选地包括用于终止血浆肾素介导的AngI生成的操作台(或组成部分)。所述系统也可包括用于消化(或水解)AngI和任选加入的SIL-AngI以产生AngI和任选的SIL-AngI各自的裂解产物的操作台(或组成部分)。在某些实施方案中，用于培养样品、加入内标准、终止血浆肾素活性和/或进行蛋白酶消化(和/或水解)的组成部分都可用作相同操作台的一部分。
所述系统也可包括用于质谱的操作台。因此，所述系统可以包括用于电离AngI和任选的SIL-AngI酶裂解产物以产生AngI裂解产物和任选的SIL AngI裂解产物的多个带电荷气相离子的操作台。任选地，所述系统也可包括用于通过质谱分析所述多个带电荷气相离子以测定样品中AngI裂解产物和任选的SIL-AngI裂解产物的存在和/或数量的操作台，其中所述裂解产物的量反映样品中血浆肾素的活性。所述系统也可包括用于在质谱之前使用液相色谱(例如，HPLC)色谱分离裂解产物的操作台。
如上所述，所述方法可包括证实样品为包含足量凝血剂的血浆的步骤。因此，在某些实施方案中，所述系统可以包括用于测试样品中EDTA存在的操作台。
这些及其它实施方案为本文描述的。
附图简述
参照下述非限定性附图可以更好地理解本发明。
图1为本发明的方法的实施方案的流程图。
图2为本发明的系统的实施方案的示意图。
详细说明
下述说明列举了本发明的各个方面和实施方案。没有任何特定的实施方案旨在限定本发明的范围。相反，实施方案仅提供至少包括在本发明的范围之内的各种方法和系统的非限制性实例。所述说明是从本领域普通技术人员的观点来解读；因此，不必包括本领域技术人员熟知的信息。
缩写
在本申请中可以使用各种缩写。在大多数情况(如果不是所有情况)下，这类缩写的含义是本领域技术人员已知的。这些缩写包括提供其含义的下述缩写。其它缩写为本文中定义的。
AMR：分析可测量的范围
AngI:血管紧张素1
APCI:大气压化学电离
ARR:醛固酮-肾素-比
BSA:牛血清白蛋白
CE:毛细管电泳
CRR:临床可报告范围
CZE:毛细带电泳
DESI:电喷雾解吸电离
DMSO:二甲亚砜
EDTA:乙二胺四乙酸
ESI:电喷雾电离
FAB:快原子轰击
HPLC:高效液相层析
LAESI:激光烧蚀电喷雾电离
LC:液相色谱
LC-MS/MS:液相色谱-串联质谱
LLOQ:定量下限
LSI:激光喷雾电离
MALDESI:基质辅助激光电喷雾解吸电离
MALDI:基质辅助激光解吸电离
MRM:多重反应监测
MS:质谱
MS/MS:串联质谱
m/z:质荷比
PMSF:苯基甲烷磺酰氟
PRA:血浆肾素活性
PRM:平行反应监测
QCs:质量控制
Q-TOF:四极杆飞行时间
RAAS:肾素血管紧张素醛固酮系统
RIA:放射免疫分析
SIM:选择离子监测
SPH:圣保罗医院
SRM:选择反应监测
Tris:三(羟甲基)氨基甲烷
ULOQ:定量上限
定义
除非另有说明，否则下述术语应当理解为具有下述含义：
除非特别地另外指出，否则如本文使用的术语“一个/一种”和“所述(the)”可以指一个/一种或多个/多种。
在整个本申请中，术语“约”用于表示数值包括对于装置、用于测定数值使用的方法的固有误差变化或存在于研究对象间的变化。
如本文使用的术语“酶活性”或“酶的活性”指与参考标准或参考标准的校正曲线比较血浆肾素比活性的量度。在某些情况下，将血浆肾素活性与称为参考区间的正常个体群进行比较。该参考应当包括表面健康人群的血浆肾素活性的95％置信区间的下限和上限。该术语可以连同术语“数量”或“水平”一起使用。
如本文使用的术语“受试者”、“个体”和“患者”可互换地使用。使用这些术语并未暗示与医学专业人员比如医师有任何类型的关系。
如本文使用的短语“液相色谱”或“LC”用于指将样品中的一种或多种分子或分析物与该样品中的其它分析物分离的过程。LC涉及当流体匀速移动通过细分物质的柱时减缓该流体溶液的一种或多种分析物。所述减缓是混合物的组分在一个或多个固定相和流动相之间分配导致的。LC包括例如反相液相色谱(RPLC)和高压液相色谱(HPLC)。在某些情况下，LC指具有疏水性固定相与流动相组合的反相LC，所述流动相由水和/或水-可溶性有机溶剂比如甲醇或乙腈组成。在某些情形中，LC可以指离子交换色谱、亲和色谱、正常相液相色谱或亲水作用色谱。
如本文使用的术语“毛细管电泳”(CE)指一种基于当暴露于电场时它们在电解质溶液中的离子迁移率，分离样品中的一种或多种分子或分析物与该样品中的其它分析物的过程。CE包括例如毛细带电泳(CZE)。
如本文使用的术语“分离”或“纯化”等不一定是用于指必须从样品基质中除去不同于感兴趣的分析物的所有物质。相反，在某些实施方案中，该术语用于指一种相对于样品基质中存在的一种或多种其它组分而言富集其中存在的一种或多种感兴趣的分析物的量的方法。在某些实施方案中，“分离”或“纯化”可用于除去或降低可能干扰例如通过质谱检测分析物的样品中一种或多种组分的量。
如本文使用的术语“质谱”或“MS”指用于鉴定和/或定量样品中分子的技术。MS包括电离样品中的分子，形成气相的带电荷分子(离子)；根据它们的质荷比分离带电荷分子；和检测带电荷分子。MS允许定性和定量检测样品中的分子。分子可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法被电离和检测。短语“串联质谱”或“MS/MS”在本文中用于指鉴定和/或定量样品中分子的技术，其中同时使用多于一种质量分析仪或顺序使用单个质量分析仪进行多个选择质谱步骤。如本文使用的“质谱仪”是一种包括电离分子、选择分子和检测带电荷分子的工具的装置。
如本文使用的“电喷雾电离”或“ESI”指质谱中用于电离样品中的分子，同时避免分子片段化的技术。样品通过电雾化分散到细小气溶胶中。通常将样品与溶剂混合，所述溶剂通常是与水混合的挥发性有机化合物(例如，甲醇或乙腈)。然后，气溶胶穿过孔被转移到质谱仪，所述孔可以被加热以帮助从带电荷液滴进一步蒸发溶剂，并且最终形成样品分子的气相离子。
如本文使用的术语“稳定的同位素标记的(stable isotopically-labeled)”或“稳定的同位素标记的(stable isotope-labeled)”涵盖用给定原子的非放射性同位素富集分子，以便改变分子之内所述原子的平均质量，因而改变所述分子的平均质量的方法。通常，这是通过用较不常见的重同位素(例如，碳-13或氮-15)替代自然中或天然分子中更通常存在的轻同位素(例如，碳-12或氮-14)实现的。
如本文使用的“四极杆分析仪”是一种在MS中使用的质量分析仪类型。其由四根彼此高度平行设置的环形杆(两对)组成。所述四极杆可以是如本领域已知的三重四极杆形式。所述四极杆分析仪是可以基于其质荷比解析样品的带电荷分子的仪器部件。本领域技术人员应当理解四极杆分析器可以得到特异性提高的结果。一对杆设置为正电势，另一对杆设置为负电势。为了被检测到，离子必须穿过轨迹路线的中央，该轨迹路线以所述对齐的杆为界并平行于这些对齐的杆。当四极杆在给定的直流电幅值和射频电压下运行时，仅给定质荷比的离子共振，并具有稳定的轨迹以穿过所述四极杆且被检测到。如本文使用的“正离子模式”指其中带正电荷离子被质量分析仪检测的模式，“负离子模式”指其中带负电荷离子被质量分析仪检测的模式。对于“选择反应监测”或“SRM”，直流电幅值和射频电压设置为仅观察特定质量。
术语“离心”指一种涉及用离心机施用向心力沉淀非均匀混合物的方法。这提高了例如管中包含的样品的有效重力，更快且完全地引起沉淀物(颗粒状物)聚集在管底部。剩余溶液称为“上清液”。
术语“底物”或“酶底物”在本文中用于指酶作用于其的物质。
术语“外源性”或“外部”底物为来源于样品之外的底物。在某些实施方案中，外源性/外部底物为“合成的”底物。
术语“合成的”在此处用于指人造的分子，例如，在实验室或其它类似装置中生产的。这应当涵盖化学合成以及重组分子技术(即，从重组核酸构建物表达)。
术语“序列”可用于指多肽中氨基酸顺序，所述多肽也可以被称作“一级结构”或多肽分子，比如具有特定氨基酸顺序的多肽。
如本领域已知的，“蛋白”、“肽”和“多肽”为氨基酸(通常为，L-氨基酸)链，其α碳是通过由一个氨基酸的α碳的羧基与另一个氨基酸的α碳的氨基之间的缩合反应形成的肽键连接。典型地，组成蛋白质的氨基酸按顺序编号，从蛋白的氨基末端残基开始，向蛋白的羧基末端残基方向增加。除非上下文另外指出，否则术语“肽”用于指小于全长的蛋白或非常短的蛋白。
术语“氨基酸序列”可用于指定义肽序列的一个字母氨基酸编码。本文对于二十个基因编码的L-氨基酸使用的氨基酸符号是常规的，如下：
表1
在两个或多个氨基酸序列的上下文中的“序列同一性”或“序列相似性”指当在比较窗口或指定的区域上就最大一致性进行比较和比对时，两个或多个相同的或具有指定百分比的相同(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)氨基酸或在指定的区域上更高同一性的序列或子序列。用于测量序列相似性的各种工具都是可获得的，比如从National Center for BiotechnologyInformation,U.S.National Library of Medicine,Bethesda,Maryland,USA可获得的蛋白BLAST。对于序列比较，通常一个序列用作参考序列，将测试序列与参照序列相比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列都输入计算机，如果需要，设定子序列座标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认的程序参数，或者可以指定可选择参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
如本文使用的，当提及氨基酸或核苷酸序列时，术语“类似的”或“同系物”指与野生型氨基酸序列具有一定程度的同源性或同一性的多肽。同源性比较可以通过眼睛，或者更通常地借助于容易获得的序列比较程序进行。这些市售可获得的计算机程序可以计算两个或多个序列之间的同源性百分比(例如，Wilbur,W.J.and Lipman,D.J.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:726-730)。例如，同源序列可以理解为包括在可替代实施方案中彼此至少70％一致、75％一致、80％一致、85％一致、90％一致、95％一致、96％一致、97％一致、或98％一致的氨基酸序列。
如本文使用的，术语与其至少90％一致包括与指定的序列同一性在范围90至99.99％的序列且包括其中所有范围。因此，术语与其至少90％一致包括与指定序列91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％一致的序列。类似地，术语“至少70％一致”包括在70至99.99％范围内一致的序列，且包括其中所有范围。使用本文所述算法测定同一性百分比的测定。
术语“裂解”、“酶裂解”或“酶法裂解”在本文中用于指由于酶蛋白酶(肽酶或蛋白酶)引起的酶促水解多肽或化学水解产生所定义产品的过程或结果。
术语“裂解位点”在本文中用于指多肽中蛋白酶的裂解位点。术语“裂解位点”涵盖且可用于指“特定裂解位点”，意味着多肽中蛋白酶对其有特异性的裂解位点。
术语“裂解产物”或“酶裂解产物”在本文中用于指由蛋白酶进行酶裂解得到多肽。例如，AngI裂解产物可以为如本文讨论的从AngI产生的胰蛋白酶的肽。
用于测定血浆肾素活性的存在或数量的方法
本发明可以以多种方式具体描述。在某些实施方案中，本发明包括一种通过质谱测量AngI和/或血浆肾素活性的方法。在某些实施方案中，使用串联MS/MS。在某些实施方案中，通过LC-MS/MS测量血浆肾素活性。还包括用于测量血浆肾素活性的系统。
例如，参照图1，在一个实施方案中，本发明包括一种用于测定样品中AngI的量的方法(100)。所述方法可以包括在适于允许血浆肾素从样品中存在的血管紧张素原产生具有序列NH2-DRVYIHPFHL-COOH(SEQ ID NO:102)的AngI肽的条件下培养样品的步骤(102)。所述方法也可包括加入蛋白酶或化学水解试剂的步骤(106)。所述方法还可以包括在允许所述蛋白酶或化学水解试剂水解AngI产生所定义的AngI裂解产物的条件下培养样品的步骤(108)。所述方法也可包括电离AngI裂解产物以产生一种或多种质谱可检测离子的步骤(110)。所述方法可以进一步包括通过质谱检测AngI裂解产物的步骤(112)。如下更详细地讨论的，所述方法可以另外包括向样品中加入稳定的同位素-标记的AngI肽(SIL-AngI)作为内标准的步骤(104)。
在某些实施方案中，不必定量样品中血浆肾素酶活性的量。在某些实施方案中，所述方法可用于测定样品中存在或不存在血浆肾素酶活性。在其它实施方案中，所述方法用于测定样品中AngI的量。例如，在某些实施方案和/或方面中，本发明提供用于测定样品中AngI的量和/或血浆肾素活性的方法，包括下述步骤：培养样品产生AngI，任选地最优化样品化学，以消除来自样品酶的蛋白酶活性，任选地加入内标准(例如，SIL-AngI)，水解所述AngI和任选的内标准，任选地终止要培养的样品的水解，任选地使用液相色谱色谱分离AngI裂解产物和内标准裂解产物与样品的其它组分，并且电离所述AngI裂解产物和任选的内标准裂解产物产生多个带电荷离子，通过质谱分析所述多个带电荷离子以测定样品中AngI裂解产物和任选的SIL-AngI裂解产物的量，其中所述AngI裂解产物和所述AngI内标准裂解产物的测定量的比例反映样品中血浆肾素的活性量。而且，在某些实施方案中，例如，当样品为血清或血浆时，测试等分试样的样品，以确定EDTA(抗凝血剂)以足够螯合某些二价离子(例如，Ca2+和Mg2+)的量存在。
样品中的活性量可以通过与外部标准曲线比较来确定。例如，AngI肽的量可以与使用具有加入已知浓度的AngI的合适基质产生的校准标准的外部标准曲线进行比较。所述方法不限于特定量的校准水平。在某些实施方案中，产生校正曲线仅需要单个点。在某些实施方案中，可以将校准物加入到样品中。
本发明的一个示例性的实施方案是一种测定样品中血浆肾素活性的方法，其可以包括培养该样品从血管紧张素原产生AngI,NH2-DRVYIHPFHL-COOH(SEQ ID NO:1)的步骤。接着，任选地加入AngI NH2-DRV^YIHP^F^HL-COOH(SEQ ID NO:3)的合成的稳定的同位素标记的AngI肽类似物。由于在任何步骤AngI肽(或AngI裂解产物)的回收都小于100％，使用稳定的同位素标记的内标准进行校正。在一个实施方案中，V^为(13C)5H11(15N)O2，具有+6的质量偏移；P^为(13C)5H9(15N)O2，具有+6的质量偏移；和F^为(13C)9H11(15N)O2，具有+6的质量偏移。然后，样品可以接受使用甲醇或另一种有机试剂的任选地终止反应，蒸发所述溶剂，并将AngI和任选的内标准SIL-AngI在缓冲液中重构。此时，可以加入蛋白酶，生成AngI裂解产物肽和相应任选的内标准SIL-AngI裂解产物。在一个实施方案中，蛋白酶为丝氨酸蛋白酶。在一个实施方案中，蛋白酶为胰蛋白酶。例如，在一个实施方案中，胰蛋白酶裂解AngI生成肽NH2-VYIHPFHL-COOH(SEQ ID NO:2)，并且胰蛋白酶裂解SIL-AngI生成NH2-V^YIHP^F^HL-COOH(SEQ ID NO:4)。随后，所述方法可以包括任选地终止蛋白酶裂解步骤。所述方法可以进一步包括任选地使用液相色谱来色谱分离AngI裂解产物和任选的SIL-AngI裂解产物与样品中的其它组分；和通过质谱分析所述AngI和SIL-AngI裂解产物，以测定样品中裂解产物的存在或数量。样品中AngI裂解产物产品的存在或数量反映该样品中AngI的存在或数量。在一个实施方案中，在任何步骤，使用SIL-AngI裂解产物与测量的AngI裂解产物的比例来校准AngI的损失。在一个实施方案中，所述方法进一步包括产生多个包括在合适基质中已知量的AngI的校准标准。在一个实施方案中，通过比较样品中AngI的量与测定作为水解产物的多数校准标准的至少一种中AngI的量来定量所述样品中AngI的量。
在一个实施方案中，内标准为用如上所述重同位素标记的AngI。众所周知，可以使用其它类型的内标准。例如，内标准可以是未标记的，但是具有不同的氨基酸序列，或者所述肽中的其它氨基酸可以被标记。内标准以及校准标准可以通过化学合成或重组方法制备。在某些实施方案中，校准标准可以具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中显示的氨基酸序列，SIL-AngI可以具有SEQ ID NO:3中显示的氨基酸序列。另外和/或可选地，内标准可以包括包含不同标记的氨基酸的其他序列。在可替代的实施方案中，参考标准具有与SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2至少70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列相似性，并且内标准具有与SEQ ID NO：3至少70％、75％、80％、85％、90％、95％的序列相似性。
在一个实施方案中，血浆肾素活性与在培养期间产生的AngI产物的量成比例。所述AngI产物与AngI衍生物(例如，水解的裂解产物)成比例，其通过质谱测量。在某些实施方案中，丝氨酸蛋白酶培养(用于生成AngI衍生物)可以用酸和/或温度淬灭酶终止。而且，在某些实施方案中，包含AngI裂解产物和任选的SIL-AngI裂解产物的样品可以直接使用质谱分析。在某些实施方案中，通过液相色谱(LC)或另一种偶联串联质谱(MS/MS)的纯化技术(例如，毛细管电泳)分析AngI裂解产物和任选的SIL-AngI裂解产物，以测量AngI产物。
在一个实施方案中，可以在生成AngI之前或之后，但是在用甲醇或温度终止反应之前，加入内标准。在一个实施方案中，可以在加入甲醇之后，但是在蒸发甲醇和在缓冲液中重构样品之前，加入内标准。在一个实施方案中，所测量的分析物∶内标准的比例与形成的AngI的量成比例，从而与血浆肾素活性成正比。
电离步骤引起形成多个带电荷离子。在某些实施方案中，电离步骤包括使用电离技术比如电喷雾电离、大气压化学电离或大气压光电离来电离AngI酶裂解产物和任选的SIL-AngI裂解产物。
分析步骤允许表征和定量电离步骤中形成的多个带电荷离子。在某些实施方案中，分析步骤包括测定血浆肾素的特定活性。在某些实施方案中，分析步骤使用串联质谱。使用SEQ ID NO：1的底物产生SEQ ID NO：2的产物，并且使用SEQ ID NO：3的底物产生SEQID NO：4的产物，在某些实施方案中，分析步骤可以使用具有m/z选自513.3±2、269.2±2、392.7±2、257.1±2的离子。
根据的本发明的实施方案的方法可以包括提供样品。在这方面，术语“提供”应当广泛地解释。该术语不是旨在排他性地针对提供生物样品的对象。例如，场外临床实验室的技术人员可以被认为“提供”样品，例如通过萃取和/或色谱纯化制备样品。
本发明不限于任何特定的样品处理方式。在某些实施方案中，样品需要作为抗凝血剂的EDTA。例如，在某些实施方案中，样品为包括EDTA的血浆样品。样品中EDTA的量应当为足够螯合该样品中存在的二价离子(例如，Ca2+、Mg2+)的水平。例如，在某些实施方案中，加入到样品中的EDTA的量将导致EDTA的浓度为至少0.5-3mg/mL。
因此，在某些实施方案中，所述方法包括测试等分试样的样品中EDTA以适于螯合该样品中存在的二价离子的量存在于该样品中的步骤。所述EDTA测试可以使用多种方法进行。在某些实施方案中，所述EDTA测试可以包括检测二价离子存在的比色试剂。包含用于螯合二价离子的足够EDTA的血浆样品不能影响比色试剂产生比色信号。在一个实施方案中，比色试剂为邻-甲酚酞络合酮；该试剂与钙离子反应，产生紫色。因此，如果样品中存在的EDTA多于钙离子，则当加入比色试剂时样品不会变色。如果样品中不存在EDTA，或存在量不足以螯合游离钙离子，则样品将变成紫色。这样的样品通常不适于测定。
样品中培养的血浆肾素介导的AngI生成和/或蛋白酶介导的AngI和任选的SIL-AngI消化的终止不限于任何特定方法。在某些实施方案中，终止是通过在合适的培养期之后向样品中加入足够终止血浆肾素酶促反应的量的沉淀试剂实现的。沉淀试剂可以是甲醇、乙腈、丙酮、2-丙醇、硫酸铵、三氯乙酸或高氯酸。在某些实施方案中，可以使用温度有效地终止反应。样品可以被加热以便灭活血浆肾素，或者样品可以被冷却，可能地冷冻，以减缓反应至有效地中止。在某些实施方案中，可以通过调节样品pH不利于血浆肾素活性，例如低于约pH 3或高于约pH 9来停止反应。在其它实施方案中，可以通过加入血浆肾素(和/或丝氨酸蛋白酶)抑制剂比如Tekturna或其它蛋白酶抑制剂来停止反应。在某些实施方案中，可以不必终止所述酶促反应。例如，可以在培养步骤期间，经一定时期重复取样而不是在单个时间点测定来连续监测血浆肾素酶促反应。
可以使用样品的部分纯化提供部分纯化的样品。部分纯化可以在所述方法的各个阶段进行。例如，在某些实施方案中，部分纯化可以在培养样品和终止血浆肾素活性之后进行，得到包括AngI的样品。在某些其它实施方案中，部分纯化可以在培养步骤之前进行。在根据本发明的实施方案的方法中，可以使用多于一个部分纯化步骤。部分纯化不受部分纯化的方法或结果的限制。在某些实施方案中，除了感兴趣的组分之外，样品中各种组分中一种或多种的浓度已经降低了。例如，相对于部分纯化的样品中酶裂解产物的浓度，其它组分的浓度可能降低了。在另一个实例中，相对于部分纯化的样品中AngI的浓度，其它组分的浓度可能降低了。
因此，术语“除去”或“去除”不一定表明完全除去组分。一些量的除去的组分可仍然存在于部分纯化的样品中，尽管相对于感兴趣的组分而言其浓度比在提取前样品中的低。在某些实施方案中，在部分纯化的样品中所除去的组分对于酶裂解产物的相对浓度为在部分纯化步骤之前该样品中其对于酶裂解产物的相对浓度的不超过90％、或不超过75％、或不超过50％、或或不超过33％、或不超过25％、或不超过10％或不超过5％、或不超过1％。本发明不限于任何特定类型的除去的组分。在某些实施方案中，一种或多种除去的组分为可干扰质谱或液相色谱分析的化合物。一个部分纯化方法的实例是在通过加入有机溶剂终止反应之后离心。在离心期间，如此处理的样品的沉淀组分被除去，同时进一步纯化和/或分析上清液。
在本发明的某些实施方案中，在色谱分离之前，部分纯化的样品可以进行一个或多个处理步骤。例如，在某些实施方案中，部分纯化的样品进行蒸发。然后，将得到的残余物在溶剂体系中重构。可以使用任何合适的溶剂体系重构残余物。在某些实施方案中，溶剂体系为与色谱分离相容的溶剂体系。在某些实施方案中，用于重构的溶剂体系包括但不限于水、甲醇或其混合物。在某些其它实施方案中，部分纯化的样品可以进行化学或酶处理，以便修饰酶裂解产物。例如，裂解产物可以被化学衍生化或进一步水解。在某些实施方案中，裂解产物可以用其它酶进一步水解。
在某些实施方案中，所述方法包括(包含)例如使用液相色谱来色谱分离样品中的AngI和任选的SIL-AngI裂解产物与其它组分的步骤。本发明不限于进行液相色谱的任何特定方式。通常，色谱分离步骤包括使用至少一根液相色谱(LC)柱。在某些实施方案中，使用多个LC柱，比如两根以上、或三根以上、或四根以上的LC柱。在某些这样的实施方案中，使用两根、三根、四根、五根、六根、八根或十根LC柱。在某些这样的实施方案中，两根或多根这些LC柱彼此并联布置，并且与同一质谱仪内联连接。
本发明不限于任何特定类型的柱。可以使用适于分离酶裂解产物的任何柱。在某些实施方案中，使用一根或多根分析柱。在某些实施方案中，柱为C18柱，但是可以包括C12、C8、C4、苯基-己基、酰胺、胺或PFP。
进一步，本发明不限于任何特定的流动相。可以使用任何合适的流动相，只要流动相适用于特定LC柱和适用于色谱分离LC柱中的酶裂解产物。在某些实施方案中，流动相由乙腈(0-100％)组成。或者，流动相可以由甲醇(0-100％)组成。在某些这样的实施方案中，流动相使用梯度，使得两种或多种溶剂的相对比例随时间推移变化。在某些实施方案中，流动相由离子对试剂组成，所述离子对试剂为比如三氟乙酸、甲酸、铵、七氟丁酸和/或乙酸。
在某些实施方案中，两根或多根LC柱可以并联使用，并且与同一质谱仪内联连接，例如用于提高通量。在某些这样的实施方案中，在不同时间，将样品(其可以是部分纯化的样品)引入到两根或多根LC柱。在某些实施方案中，将测试样品引入到两个或多个LC柱是错开的，意味着存在预定的时间间隔将样品分开引入到两根或多根LC柱。可以基于各种因素选择合适的时间间隔，包括洗脱时间、柱化学和可能需要避免干扰对来自一根或多根其它LC柱洗脱的酶裂解产物的分析。
在本发明的某些实施方案中，LC柱可以与另外的柱串联放置。例如，在某些实施方案中，可以使用合适的保护柱。本领域技术人员能够选择用于本发明方法中的合适保护柱。在某些实施方案中，保护柱与另一个LC柱并联设置。也可以将这样的两根或多根柱系列并联布置，使得两个或多个柱系列并联运行，其中每个系列含有两根或多根柱。在其它实施方案中，可以使用联机提取柱(online extraction columns)。例如，在所述方法的某些实施方案中，可以使用联机固相提取柱分离水解的AngI和任选的SIL-AngI产物。
在本发明的某些实施方案中，可以通过电泳纯化AngI和任选的SIL-AngI酶裂解产物。例如，在某些实施方案中，使用毛细管电泳分离酶裂解产物与可能的干扰物质。
在某些实施方案中，所述方法包括通过质谱分析纯化或分离的酶裂解产物，以测定AngI和任选的SIL-AngI酶裂解产物的存在或数量。在某些实施方案中，将两根或多根LC柱装入同一质谱仪中。在某些进一步的实施方案，将三根或多根LC柱装入同一质谱仪中。在某些实施方案中，质谱仪是组合LC-MS系统的部分。
本发明不限于任何特定类型的质谱仪。可以使用任何合适的质谱仪。在某些实施方案中，所述方法使用串联质谱仪。在某些这样的实施方案，分析酶裂解产物可以包括电离酶裂解产物、分析所述电离的酶裂解产物、将所述酶裂解产物离子裂解成两个或多个碎片离子和分析所述碎片离子。
本发明不限于使用任何特定的电离方法。所述方法可以利用适于从酶裂解产物产生多个带电荷离子的电离技术。合适的电离方法包括，但不限于光电离、电喷雾电离、大气压化学电离和电子俘获电离。并且在使用裂解的实施方案中，可以使用任何合适的裂解技术。合适的技术包括，但不限于碰撞诱导解离、电子俘获解离、电子迁移解离、红外多光子解离、辐射解离、电子分离解离和表面诱导解离。
在某些实施方案中，串联质谱仪为Sciex API5500三重四极杆质谱仪。在某些实施方案中，串联质谱仪具有大气压电离源，并且分析步骤包括选自下述的电离方法：光电离、基质辅助激光解吸/电离(MALDI)、电喷雾电离(ESI)、大气压化学电离(APCI)、电子俘获电离、电子电离、快速原子轰击/液体次级电离(FAB/LSI)、场电离、场解吸、热喷雾/等离子体喷雾电离、粒子束电离、以及所谓的“杂化电离”技术，比如激光烧蚀电喷雾电离(LAESI)、电喷雾解吸电离(DESI)或基质辅助激光电喷雾解吸电离(MALDESI)。所述电离方法可以是正离子模式或负离子模式。分析步骤也可包括多反应监测(MRM，也称为选择反应监测或SRM)或选择离子监测(SIM)，同时或顺序分析两种或多种生物分子。在某些实施方案中，分析步骤使用四极杆分析仪。在某些实施方案中，质谱仪是三重四极杆质谱仪。在某些实施方案中，分析步骤可以在四极杆飞行时间(Q-TOF)或四极杆轨道离子阱(orbitrap)仪器比如平行反应监测(PRM)上扫描产物离子进行。
些实施方案中，所述方法不受任何定量下限(LLOQ)和/或定量上限(ULOQ)的限制。在某些实施方案中，LLOQ为0.167ng/mL/hr，和定量上限(ULOQ)为66.667ng/mL/hr。在某些实施方案中，校正曲线包含LLOQ为0.25ng/mL和ULOQ为100ng/mL的AngI肽。
生成报告的方法
在至少一个方面，本发明提供生成用于诊断受试者中与血浆肾素活性降低有关的疾病或病症的报告的方法。这样的疾病或病症的一个实例是高血压。这样的疾病或病症的另一个实例是醛甾酮增多症。这样的方法可以包括下述步骤：培养样品产生AngI，然后任选地加入作为内标准的SIL-AngI肽，之后终止反应，然后产生AngI肽裂解产物和任选的SIL-AngI裂解产物。所述方法可以进一步包括任选地使用液相色谱来色谱分离AngI裂解产物和任选的SIL-AngI裂解产物与该样品的其它组分，电离所述AngI裂解产物和任选的SIL-AngI裂解产物，产生多个带电荷离子，将其通过质谱分析来测定该样品中的AngI裂解产物和任选的SIL-AngI裂解产物的量。在其中使用SIL-AngI内标准的一个实施方案中，确定量的AngI裂解产物和SIL-AngI产物的比例反映该样品中血浆肾素活性的活性量。所述方法可以进一步包括生成记载样品中血浆肾素活性和/或AngI的活性量的报告。
基于样品中血浆肾素活性量的信息，可以评价受试者是否具有异常低量的这种活性。这样的信息可用于诊断可能与受试者中血浆肾素活性水平异常有关的一种或多种疾病或病症。除了生成报告的步骤之外，所有步骤的特征和实施方案都为就在上述(immediately above)描述的。如上所述，所述方法可以使用多于一根柱，例如与同一质谱仪内联连接的并联的两根或多根柱。
在某些实施方案中，血浆肾素活性测量可用于测定样品中血浆肾素抑制剂的存在和/或数量。通过以已知比例混合具有已知低活性的样品与具有已知正常活性的样品，可以测量得到的混合样品的活性。基于该混合物的已知比例和单个样品的已知活性，可以比较该混合物的测量活性与该混合物的预期活性，由此测量活性低于预期活性反映低活性样品中抑制剂的存在和数量。
系统
在另一个方面，本发明提供用于测定样品中血浆肾素活性的存在或数量的系统。这样的系统可以包括与上述根据本发明的实施方案的方法的那些类似的各种实施方案和子实施方案。这些系统包括各种操作台和/或组成部分。如本文使用的术语“操作台”是广泛定义的，并且包括适用于进行所述方法的任何合适的装置或装置集合(例如，组成部分)。所述操作台不必整体相连或者以任何特定方式相对于彼此定位。本发明包括操作台相对于彼此的任何合适的布置。例如，操作台甚至不必处于同一房间中。但是在某些实施方案中，操作台在整体单元中彼此连接。
例如，现在参照图2，系统(200)可以包括在生成AngI的条件下培养样品的操作台(202)。任选地，所述系统可以进一步包括向样品中加入作为内标准的稳定的同位素-标记的肽SIL-AngI的操作台(204)。所述系统可以进一步包括加入试剂(例如，溶剂比如甲醇)以终止血浆肾素活性的操作台(206)。该操作台可以包括蒸发溶剂和在蛋白酶消化缓冲液中重构样品的组成部分。所述系统可以包括加入蛋白酶(例如，胰蛋白酶)生成AngI裂解产物和任选的SIL-AngI裂解产物的操作台(208)。在某些实施方案中，用于培养样品、加入内标准、终止血浆肾素活性和加入蛋白酶的至少一些操作台可以组合为单个操作台(209)。
所述系统可以进一步包括允许操作台(210)多次充电(即，电离)，并且通过质谱分析AngI裂解产物和任选的SIL-AngI裂解产物，以测定样品中AngI裂解产物和任选的SIL-AngI裂解产物的量，其中所述AngI裂解产物的量反映该样品中血浆肾素的活性。任选地，所述系统也可包括操作台(212)，用于使用液相色谱或其它分离方法(例如，毛细管电泳)色谱分离AngI裂解产物和任选的SIL-AngI裂解产物。在一个实施方案中，用于液相色谱和质谱的操作台可以包括单个操作台(213)。
所述系统可以进一步包括用于数据分析的操作台或组成部分(214)。而且，所述系统也可包括用于测试样品中EDTA存在的操作台(216)。所述系统或系统的部分可以通过计算机(218)控制。
根据本发明的实施方案的方法和系统具有多种优点。在一个实施方案中，所述方法使用90分钟培养生成AngI，与使用3-18hr培养的其它实施方案相比，提供了一种更快的方法。在另一个实施方案中，所述方法使用比色试剂和缓冲液区分EDTA-血浆与其它样品类型，从而确保使用正确的样品类型。在另一个实施方案中，可以使用水解改变所述方法的选择性和/或灵敏性。
包括下述实施例，提供给本领域普通技术人员实施本发明公开主题的代表性实施方案的指导。根据本发明内容和本领域技术人员的一般水平，那些技术人员可以理解下述实施例仅仅意味着是示例性的，在不背离本发明公开主题的范围下，可以使用大量的变化、修饰和改变。
非限制性实施方案
非限制性实施方案包括∶
1.一种测定样品中AngI的量的方法，所述方法包括∶
(a)在适于允许血浆肾素从样品中存在的血管紧张素原产生具有序列NH2-DRVYIHPFHL-COOH(SEQ ID NO:1)的AngI肽的条件下培养样品；
(b)加入蛋白酶或化学水解试剂；
(c)在允许所述蛋白酶或化学水解试剂水解AngI产生所定义的AngI裂解产物的条件下培养样品；
(d)电离AngI裂解产物，产生一种或多种质谱可检测的离子；和(e)通过质谱检测AngI裂解产物离子。
2.段落1的方法，进一步包括向样品中加入作为内标准的稳定的同位素-标记的AngI肽(SIL-AngI)。
3.段落2的方法，其中所述SIL-AngI为肽NH2-DRV^YIHP^F^HL-COOH(SEQ ID NO:3)其中^指用重同位素标记的氨基酸。
4.段落3的方法，其中V^为(13C)5H11(15N)O2，具有+6的质量偏移；P^为(13C)5H9(15N)O2，具有+6的质量偏移；和F^为(13C)9H11(15N)O2，具有+6的质量偏移。
5.段落2的方法，其中所述SIL-AngI是使用用重同位素标记的其它氨基酸组合由肽NH2-DRVYIHPFHL-COOH(SEQ ID NO:1)生成的。
6.段落2的方法，其中在血浆肾素介导的AngI生成之前或之后，但在加入蛋白酶步骤之前，加入所述SIL-AngI肽。
7.段落2的方法，其中AngI裂解产物的量与蛋白酶产生的SIL-AngI裂解产物的量成正比。
8.段落1的方法，进一步包括产生多数校准标准的步骤，所述校准标准包括在合适的基质中已知量的AngI，其中所述参考标准为SEQ ID NO：1的AngI，其经历与样品AngI相同的步骤。
9.段落8的方法，其中通过比较样品中AngI的量与多数校准标准的至少一种中AngI的量来定量所述样品中AngI的量。
10.段落9的方法，其中所述校准标准包括范围为0.25至100ng/mL的AngI。
11.段落1的方法，其中所述蛋白酶为丝氨酸蛋白酶。
12.段落1的方法，其中所述蛋白酶为胰蛋白酶。
13.段落1的方法，其中所述化学水解试剂为甲酸、乙酸、盐酸或能够水解AngI的任何其它试剂。
14.段落1的方法，其中蛋白酶裂解产生具有序列NH2-VYIHPFHL-COOH(SEQ ID NO:2)的AngI裂解产物。
15.段落3的方法，其中所述蛋白酶产生具有序列NH2-V^YIHP^F^HL-COOH(SEQ IDNO:4)的SIL-AngI裂解产物。
16.段落1的方法，其中所述AngI离子选自具有质/荷比为513.3±2、269.2±2、392.7±2、257.1±2的离子。
17.段落2的方法，其中所述SIL-AngI离子选自具有质/荷比为524.3±2,779.5±269.2±2的离子。
18.段落1的方法，进一步包括在蛋白酶消化步骤之前终止血浆肾素活性。
19.段落18的方法，其中向样品中加入甲醇以终止血浆肾素活性。
20.段落19的方法，进一步包括蒸发甲醇，然后在蛋白酶消化步骤之前在缓冲液中重构所述样品。
21.段落1的方法，其中所述AngI裂解产物和任选的SIL-AngI裂解产物在进行质谱之前进行液相色谱。
22.段落1的方法，其中所述电离为具有选择反应监测(SRM)的正电喷雾电离。
23.段落1的方法，其中所述样品为得自患者的生物流体。
24.段落23的方法，其中所述生物流体为血浆。
25.段落24的方法，其中所述生物流体包括作为抗凝血剂的乙二胺四乙酸(EDTA)。
26.段落1的方法，进一步包括在培养步骤产生AngI之前，从样品中取出等分试样并测试EDTA的存在。
27.段落26的方法，其中测试EDTA的存在包括加入比色试剂邻-甲酚酞络合酮，以与样品中的钙离子反应，使得包括EDTA的样品保持颜色基本上未改变，而不具有EDTA的样品由于钙与比色试剂反应而颜色改变。
28.根据前述段落中任一项的测量血浆肾素活性(PRA)的方法，其中基于样品中AngI肽的量计算PRA的水平。
29.段落28的方法，其中所述血浆肾素活性定义为每单位时间生成的AngI的量。
30.段落28的方法，其中所述血浆肾素活性表示为ng/mL/hr。
31.段落28的方法，其中所述血浆肾素活性具有范围为约0.167-66.667ng/mL/hr的分析可测量的范围(AMR)。
32.段落28的方法，其中定量下限(LLOQ)为0.167ng/mL/hr，和定量上限(ULOQ)为66.667ng/mL/hr。
33.一种测定样品中AngI的水平和/或血浆肾素活性的系统，所述系统包括：
(a)用于在从血管紧张素原生成AngI的条件下培养样品的操作台；
(b)任选地，用于将SIL-AngI加入到所述AngI肽的操作台；
(c)任选地，用于终止血浆肾素介导的AngI生成的操作台；
(d)用于消化或化学水解所述AngI和所述任选加入的SIL-AngI以产生所述AngI和所述任选的SIL-AngI各自的裂解产物的操作台；
(e)用于电离所述AngI和所述任选的SIL-AngI裂解产物以产生所述AngI裂解产物和所述任选的SIL AngI裂解产物的多个带电荷气相离子的操作台；和
(f)用于通过质谱分析所述多个带电荷气相离子以测定所述样品中所述AngI裂解产物和所述任选的SIL-AngI裂解产物的存在和/或数量的操作台，其中所述裂解产物的量反映所述样品中血浆肾素的活性。
34.段落33的系统，进一步包括用于测试所述样品中EDTA存在的操作台。
35.段落33的系统，进一步包括用于使用液相色谱来色谱分离所述裂解产物的操作台。
实施例
实施例1-分析试剂和方法
通过LC-MS/MS，使用外部校准曲线确定血浆肾素活性(PRA)。分析包括产生血管紧张素1的1.5小时的生物测定、甲醇沉淀、蒸发和重构，以及产生对于AngI特异性的蛋白水解肽的胰蛋白酶消化。在甲醇沉淀之前加入稳定的同位素标记的肽(SIL-AngI)，以便SIL-AngI也进行沉淀、蒸发、重构和消化。在消化识别标记(signature)和内部标准肽之后，将样品注入到SCIEX 5500 Triple Quadrupole LC-MS/MS系统上，通过具有选择反应监测(SRM)的正电喷雾电离检测。由通过示踪(spiking)具有AngI参考标准物质0.25至100ng/mL的替代基质生成的相应校正曲线回算(back-calculated)每个样品中AngI的量。PRA定义为每单位时间AngI的量，表示为ng/mL/hr，使得该分析的分析可测量的范围(AMR)为0.167-66.667ng/mL/hr。
样品
推荐的样品为配制在EDTA中1mL的血浆。通常填充完成收集管，以确保合适的血液与抗凝血剂比例，并且立即轻轻倒置混合以确保充分混合。应当在静脉穿刺4小时之内分离血浆与细胞，并冷冻直到测试。如下所述，可以使用当螯合钙离子时将变成紫色的比色试剂(例如，邻-甲酚酞络合酮)测试样品中足够EDTA的存在。如果样品包含络合样品中钙离子的足够EDTA，则样品不会变色。如果样品不包括络合样品中钙离子的足够EDTA，则样品会变色。
比色缓冲液
测量19mL的2-氨基-2-甲基-1-丙醇试剂，并加入到75mL的蒸馏水或去离子水中。使用3.0-3.4mL的6N盐酸调节pH至10.7。使用去离子水或蒸馏水适量至125mL。贮存在琥珀瓶中。贮存在室温(15-30℃)下3周。
比色试剂
将15mL的6N盐酸加入到12.5mL的去离子水或蒸馏水中。将25mg的邻-甲酚酞络合酮转移到该溶液中。使用已经制备的比色缓冲液充分洗涤所称重的容器，以除去所有粉末。使用蒸馏水或去离子水适量至250mL。贮存在室温(15-30℃)下至多1个月。
液相色谱
对于HPLC，使用5％DMSO、0.1％甲酸水溶液作为A流动相，使用5％DMSO、0.1％甲酸的乙腈溶液作为B流动相。
血浆肾素和蛋白酶消化
在甲醇中制备PMSF(100mM)；加入PMSF抑制初始培养物中不是血浆肾素的蛋白酶类以生成AngI。使用在300mM的Tris-Cl、pH 8.0；0.001％(w/v)Zwittergent 3-16中的胰蛋白酶(在50mM乙酸中的40μg/mL胰蛋白酶)进行生成AngI和SIL-AngI裂解产物的蛋白酶消化。
内标准工作溶液(SIL-AngI)的制备
通过氨基酸分析(例如，100μg/小瓶)分配(assigned)可裂解的标记的肽(SIL-AngI)。使用1mL的载体基质(在100mM Tris-乙酸盐中的1％(w/v)BSA，pH 6)，通过涡旋30秒将一个小瓶重构，然后在室温下培养≥15分钟，得到0.1mg/mL的储备溶液。通过在干净的200mL容量瓶中混合0.75mL的内标准储备溶液与50mL的载体基质制备内标准工作溶液。使用载体基质适量至200mL。盖上盖，混合充分，立即等分贮存。在室温下贮存至多2小时，在使用之后丢弃任何残余物。序列：NH2-DRV^YIHP^F^HL-COOH(SEQ ID NO:3)
标记物∶V^＝(13C)5H11(15N)O2[质量偏移+6]
P^＝(13C)5H9(15N)O2[质量偏移+6]
F^＝(13C)9H11(15N)O2[质量偏移+6]
测定过程
1.在25℃下，使用循环式水浴将样品和校准物解冻。应当在即将开始步骤3时，将胰蛋白酶溶液解冻，使得当其在步骤13中使用时在从冰箱取出的1小时之内。
2.将水浴预热至37℃，用于后续步骤。
3.将200μL的空白、标准品、对照和样品移液至2mL、96深孔板(A板)中。然后，将20μL的空白、标准品、对照和样品移液到96孔微量滴定板(C板)中，用于比色筛选。
4.将100μL的在MeOH中100mM PMSF移液到10mL的生成缓冲液(275mM马来酸，pH1.8)中。涡旋5秒，并使用12-道移液管，立即将20μL的生成缓冲液转移到A板的每个孔中。
5.将A板短暂地离心，使用微量滴定板密封器密封，以1500rpm涡旋30秒，并在37℃下的水浴中培养1.5小时。
6.将50μL的比色缓冲液和试剂转移到C板。将出现紫色的样品在封面纸(coversheet)上标记为非EDTA-血浆。
7.在生成之后，将A板短暂地离心，然后向除了两个空白(其接受50μL的载体基质)的各孔中加入50μL的内标准工作溶液(在载体基质中300ng/mL的SIL-AngI)。
8.将A板以3500rpm离心10秒，使用微量滴定板密封器密封，并使用ThermoMixer，在25℃和1500rpm下涡旋1分钟。
9.向A板的每个孔中加入600μL的甲醇，使用箔密封将该板密封，并以1500rpm涡旋5分钟。
10.将A板以3500rpm离心10分钟。
11.将200μl的上清液从A板转移到新的2-mL、96深孔板(B板)中。
12.使用TurboVap蒸发B板的内容物至干燥(流量∶40Fh，温度:50℃)。
13.将150μL的消化缓冲液移液到B板中。
14.将50μL的胰蛋白酶溶液移液到B板的各孔中，并以3500rpm离心该板10秒。
15.使用微量滴定板密封器将B板密封，在ThermoMixer上，25℃和1500rpm下培养30分钟。
16.将20μL的淬灭溶液移液到B板的每个孔中。
17.将B板涡旋5分钟@1500rpm，并以3500rpm离心10秒。
前体离子/碎片离子
对于AngI裂解肽(SEQ ID NO：2)(AngIdesDR)，跃迁(transition)选自∶650.3±2、763.4±2、513.3±2、269.2±2、392.7±2、257.1±2。对于SIL-AngI裂解肽(SEQ ID NO：4)(IS)，跃迁选自∶524.3±2、779.5±2和269.2±2。
实施例2-测定的验证
为了证实预期用于临床诊断试验和常规临床试验的定量方法而测量PRA的LC-MS/MS方法如下概述那样来验证。所述验证包括评价基质效应、灵敏性、选择性、稳定性、不准确性、不精确性、线性、测定内比较、参考区间验证和自动化。
通过使用两个(6-和8-点)校准系列评价AngI和SIL-AngI的基质间干扰，评价所述测定在校准物基质(载体基质∶1％(v/v)BSA，100mM Tris-乙酸盐，pH 6.0)中的特异性。在校准物基质(载体基质∶1％(w/v)BSA，100mM Tris-乙酸盐，pH 6.0，表2，81)中没有观察到任何干扰，对于AngI的测定特异性不受SIL-AngI的影响。进一步，在ULOQ之后的移行(carryover)小于在LLOQ中观察到的。这些结果表明该测定对于分析校准物基质中的AngI是特异性的。
鉴于该测定的特异性，在测定内(20×1)和测定间(6×3，5×5或1×20)研究中评价校准物和质量对照准确性和精确性。结果表明该测定对于检测AngI和PRA是准确和精确的。例如，在所有研究中，在LLOQ下的回收(recovery)为≤±20％偏差且≤20％CV(对于额定浓度)，并且在ULOQ下的回收≤±15％偏差和≤15％CV。在5个单独分析运行间显示校准物可重现性。通过进行混合和示踪(spike)及回收研究，评价在载体基质和EDTA-血浆中该测定的相对精度。在混合3:1、1:1和1:3比例的高水平的校准物和EDTA-血浆之后准确的AngI测量结果表明100±5％的基质等效性。示踪和回收证实在三个产生的EDTA-血浆样品中，该测定回收5、10和50X LLOQ的AngI(表11)。这些结果表明该测定在载体基质和EDTA-血浆中是准确的。
在干扰物的存在下审查(interrogated)该测定的特异性和精确度。仅仅20mg/dL的结合胆红素影响AngI的分析测量，而10mg/dL的结合胆红素不会影响，20mg/dL的未结合胆红素、3000mg/dL的甘油三酯500mg/dL的血红素或12mg/dL的总蛋白也都不会影响。另外，总溶血、黄疸或脂血都不会影响PRA测定的精确度，如通过在产生之前与正常EDTA-血浆样品混合的样品所证实的；然而，匹配抽取正常和溶血样品证实了PRA测量的一些系统偏差。该不一致性或许是由于实验之间溶血度的差异以及在前述实验中使用外源性溶血产物引起的，所述外源性溶血产物可能不包含可干扰PRA测量的以患者依赖性方式从红细胞释放的其它细胞组分。因此，该测定在干扰物的存在下是准确的，除了结合胆红素水平处于或高于20mg/dL和中度的全溶血，其可被排除。
对于在生成之前(涵盖生物学)或在提取之后(仅包括分析测量)稀释的样品，评价测定精确度。结果证实优选地在生成之前没有使用载体基质稀释样品，但是可以在提取之后使用消化缓冲液稀释至多50倍。这些研究表明患者得到了高于ULOQ的PRA值(66.667ng/mL/hr)，可以在提取之后使用消化缓冲液稀释到一定范围。
PRA测定通常将样品分成两个样品，进行生成反应∶热(37℃)和冷(4℃)。以该形式，最终PRA测量结果包括从热样品的AngI测量结果减去冷样品的AngI测量结果，得到调整的AngI测定结果，其构成了PRA计算中内源性基础AngI。为了评价临床上解释PRA是否需要冷样品，比较106例患者的热测定结果和调整的测定结果。Passing-Bablok回归得到了1.000的斜率和0.998的相关系数，具有2.032％的平均偏差。这些结果表明为了精确测量PRA仅需要热样品。
评价样品和胰蛋白酶的稳定性。首先，审查(interrogated)在室温、冷藏、冷冻和通过冷冻-解冻循环下，校准物、质量对照和样品稳定性。所述校准物经两次冷冻-解冻循环是稳定的，在室温、冷藏、冷冻(-20℃)下稳定14天，并且在冷冻(＜-70℃)下稳定128天。质量对照(QCs)经两次冷冻-解冻循环也是稳定的，但是与校准物相反，其在室温下稳定4小时。但是与校准物类似，QCs在冷藏或冷冻下稳定14天。而且，在＜-70℃下，质量对照稳定35天。EDTA-血浆经三次冷冻-解冻循环是稳定的。与QCs相比，在解冻之后，在室温下，EDTA-血浆还稳定四小时，然而与QCs和校准物相反，其是冷藏不稳定的。EDTA-血浆冷冻(-20℃)稳定14天。最后，评价胰蛋白酶工作溶液(在50mM乙酸中40μg/mL)和胰蛋白酶储备溶液(在50mM乙酸中32mg/mL)的稳定性，观察到其分别冷冻稳定63天(＜-10℃)和244天(＜-70℃)。
鉴于EDTA-血浆在室温下的不稳定性，进行四名患者的冷冻时间稳定性研究，以提供样品处理采集场所(sites)的指导。简而言之，将样品立即处理(基准)，或者在室温(15-30℃)下培养1、2或4小时，之后冷冻。结果表明当在从患者采集之后4小时之内处理和冷冻时，EDTA-血浆是稳定的。因此，应当以最小间断处理采集场所并且在采集之后冷冻来自患者的EDTA-血浆样品。
进行校准物、对照和样品的过程中和提取后稳定性。在生成后(在湿冰上，1小时)、后沉淀(＜-10℃，55天)和消化后(在湿冰上，1小时)，观察到可接受的过程中稳定性。另外，在台面上(15-30℃)观察可接受的提取后稳定性达4小时，并且在自动采样器(10℃)中达10天。
为了评价PRA测定之间的协调性，将LC-MS/MS测定与Endocrine Sciences(RIA),Center for Esoteric Testing(RIA,Tables 57,58)和St.Paul’s Hospital(SPH,LC-MS/MS)(G.Van Der Gugten and D.Holmes,“Quantitation of Plasma Renin Activity inPlasma Using Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry(LC-MS/MS),”Clinical Applications of Mass Spectrometry in Biomolecular Analysis,2016,1378:243-253)的试验设计进行比较。所述LC-MS/MS测定与Endocrine Sciences(斜率∶1.123，平均偏差：19.6％)的相关性最差，与SPH(斜率∶1.030，平均偏差：1.64％)的相关性最好。为了检验SPH参考区间，根据醛固酮、血清钠、血清钾、病史和血压测量筛选(filtered)142个参考区间样品。由于>10％的样品处于SPH的RI下限，则SPH参考的验证失败(表61)。
因此，进行重新生成参考区间。首先，审查142个样品的正常醛固酮[0-30ng/dl]、钠[3.5-5.2mmol/L]、钾[134-144mmol/L]和高血压史。EP评价器用于生成0.167ng/mL/hr(在该测定中固定为LLOQ)至5.3804ng/mL/hr(4.6091-6.2448，90％CI)的转换参数参考区间和0.16的置信率。考虑到所述PRA测定是在醛固酮与肾素比(ARR)的环境中评价的，还使用142个筛选的样品检验ARR参考区间(ng/dL∶ng/mL/hr)。LC-MS/MS醛固酮和本文所述测定与SPH之间的PRA测定的分析相关性表明任何场所的审查ARR的患者样品都应当接受类似的护理。
审查人工测定和自动测定之间的一致性。简而言之，相对于两各自动化板评价包含QCs和患者样品的一个人工板。人工板相对于自动化板1的Passing-Bablok回归得到了斜率0.919(0.898-0.938 90％CI)、截距-0.0108(-0.0744-0.0596；90％CI)与相关系数0.9946。人工板相对于自动化板2的Passing-Bablok回归得到了斜率0.948(0.926-0.97290％CI)、截距-0.0406(-0.1058-0.0104，90％CI)和相关系数0.9921。这些数据表明对于该PRA测定的双板批次可以使用自动化。
虽然已经阐述和描述了本发明的优选的实施方案，但是应当理解在没有背离本发明的精神和范围下可以进行各种变化。将本申请中提及的所有印刷的专利和出版物的全部内容在此通过参考并入本文中。
序列表
<110> 美国控股实验室公司
<120> 用于测量血浆肾素活性的方法和系统
<130> 057618-1064866
<150> US 62/423,550
<151> 2016-11-17
<160> 4
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 1
Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe His Leu
1 5 10
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 2
Val Tyr Ile His Pro Phe His Leu
1 5
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<220>
<221> MISC_特征
<222> (3)..(3)
<223> 用重同位素标记
<220>
<221> MISC_特征
<222> (7)..(7)
<223> 用重同位素标记
<220>
<221> MISC_特征
<222> (8)..(8)
<223> 用重同位素标记
<400> 3
Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe His Leu
1 5 10
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(1)
<223> 用重同位素标记
<220>
<221> MISC_特征
<222> (5)..(5)
<223> 用重同位素标记
<220>
<221> MISC_特征
<222> (6)..(6)
<223> 用重同位素标记
<400> 4
Val Tyr Ile His Pro Phe His Leu
1 5

Claims (35)

1.一种测定样品中AngI的量的方法，所述方法包括∶
(a)在适于允许血浆肾素从样品中存在的血管紧张素原产生具有序列NH2-DRVYIHPFHL-COOH(SEQ ID NO:1)的AngI肽的条件下培养样品；
(b)加入蛋白酶或化学水解试剂；
(c)在允许所述蛋白酶或化学水解试剂水解AngI产生所定义的AngI裂解产物的条件下培养样品；
(d)电离AngI裂解产物，产生一种或多种质谱可检测的离子；和
(e)通过质谱检测AngI裂解产物离子。
2.权利要求1的方法，进一步包括向样品中加入作为内标准的稳定的同位素-标记的AngI肽(SIL-AngI)。
3.权利要求2的方法，其中所述SIL-AngI为肽NH2-DRV^YIHP^F^HL-COOH(SEQ ID NO:3)，其中^指用重同位素标记的氨基酸。
4.权利要求3的方法，其中V^为(13C)5H11(15N)O2，具有+6的质量偏移；P^为(13C)5H9(15N)O2，具有+6的质量偏移；和F^为(13C)9H11(15N)O2，具有+6的质量偏移。
5.权利要求2的方法，其中所述SIL-AngI是使用用重同位素标记的其它氨基酸组合由肽NH2-DRVYIHPFHL-COOH(SEQ ID NO:1)生成的。
6.权利要求2的方法，其中在血浆肾素介导的AngI生成之前或之后，但在加入蛋白酶步骤之前，加入所述SIL-AngI肽。
7.权利要求2的方法，其中AngI裂解产物的量与蛋白酶产生的SIL-AngI裂解产物的量成正比。
8.权利要求1的方法，进一步包括产生多数校准标准的步骤，所述校准标准包括在合适的基质中已知量的AngI，其中所述参考标准为SEQ ID NO：1的AngI，其经历与样品AngI相同的步骤。
9.权利要求8的方法，其中通过比较样品中AngI的量与多数校准标准的至少一种中AngI的量来定量所述样品中AngI的量。
10.权利要求9的方法，其中所述校准标准包括范围为0.25至100ng/mL的AngI。
11.权利要求1的方法，其中所述蛋白酶为丝氨酸蛋白酶。
12.权利要求1的方法，其中所述蛋白酶为胰蛋白酶。
13.权利要求1的方法，其中所述化学水解试剂为甲酸、乙酸、盐酸或能够水解AngI的任何其它试剂。
14.权利要求1的方法，其中蛋白酶裂解产生具有序列NH2-VYIHPFHL-COOH(SEQ ID NO:2)的AngI裂解产物。
15.权利要求3的方法，其中所述蛋白酶产生具有序列NH2-V^YIHP^F^HL-COOH(SEQ IDNO:4)的SIL-AngI裂解产物。
16.权利要求1的方法，其中所述AngI离子选自具有质/荷比为513.3±2、269.2±2、392.7±2、257.1±2的离子。
17.权利要求2的方法，其中所述SIL-AngI离子选自具有质/荷比为524.3±2、779.5±269.2±2的离子。
18.权利要求1的方法，进一步包括在蛋白酶消化步骤之前终止血浆肾素活性。
19.权利要求18的方法，其中向样品中加入甲醇以终止血浆肾素活性。
20.权利要求19的方法，进一步包括蒸发甲醇，然后在蛋白酶消化步骤之前在缓冲液中重构所述样品。
21.权利要求1的方法，其中所述AngI裂解产物和任选的SIL-AngI裂解产物在进行质谱之前进行液相色谱。
22.权利要求1的方法，其中电离为具有选择反应监测(SRM)的正电喷雾电离。
23.权利要求1的方法，其中所述样品为得自患者的生物流体。
24.权利要求23的方法，其中所述生物流体为血浆。
25.权利要求24的方法，其中所述生物流体包括作为抗凝血剂的乙二胺四乙酸(EDTA)。
26.权利要求1的方法，进一步包括在培养步骤产生AngI之前，从样品中取出等分试样并测试EDTA的存在。
27.权利要求26的方法，其中测试EDTA的存在包括加入比色试剂邻-甲酚酞络合酮，以与样品中的钙离子反应，使得包括EDTA的样品保持颜色基本上未改变，而不具有EDTA的样品由于钙与比色试剂反应而颜色改变。
28.根据前述权利要求中任一项的测量血浆肾素活性(PRA)的方法，其中基于样品中AngI肽的量计算PRA的水平。
29.权利要求28的方法，其中所述血浆肾素活性定义为每单位时间生成的AngI的量。
30.权利要求28的方法，其中所述血浆肾素活性表示为ng/mL/hr。
31.权利要求28的方法，其中所述血浆肾素活性具有范围为约0.167-66.667ng/mL/hr的分析可测量的范围(AMR)。
32.权利要求28的方法，其中定量下限(LLOQ)为0.167ng/mL/hr，和定量上限(ULOQ)为66.667ng/mL/hr。
33.一种测定样品中AngI的水平和/或血浆肾素活性的系统，所述系统包括：
(a)用于在从血管紧张素原生成AngI的条件下培养样品的操作台；
(b)任选地，用于将SIL-AngI加入到所述AngI肽的操作台；
(c)任选地，用于终止血浆肾素介导的AngI生成的操作台；
(d)用于消化或化学水解所述AngI和所述任选加入的SIL-AngI以产生所述AngI和所述任选的SIL-AngI各自的裂解产物的操作台；
(e)用于电离所述AngI和所述任选的SIL-AngI裂解产物以产生所述AngI裂解产物和所述任选的SIL-AngI裂解产物的多个带电荷气相离子的操作台；和
(f)用于通过质谱分析所述多个带电荷气相离子以测定所述样品中所述AngI裂解产物和所述任选的SIL-AngI裂解产物的存在和/或数量的操作台，其中所述裂解产物的量反映所述样品中血浆肾素的活性。
34.权利要求33的系统，进一步包括用于测试所述样品中EDTA存在的操作台。
35.权利要求33的系统，进一步包括用于使用液相色谱来色谱分离所述裂解产物的操作台。
CN201780071439.5A 2016-11-17 2017-11-17 用于测量血浆肾素活性的方法和系统 Active CN109964131B (zh)

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