CN107884361A - 一种云南地方鸡肌肉冻干粉粗蛋白质含量近红外检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种云南地方鸡肌肉冻干粉粗蛋白质含量近红外检测方法，属于畜禽产品化学成分检测技术领域。本发明的具体步骤为：1）将云南地方鸡腿肌或胸肌鲜样制备成冻干粉，装入厚度为6丝的聚乙烯自封袋中；2）扫描样品的近红外光谱，其中近红外光谱仪配备傅立叶变换分光系统及漫反射式光纤探头，光谱扫描的波数范围为5262~6951cm‑1，分辨率8cm‑1，光谱背景扫描时取6丝自封袋单层置于探头前去除背景影响，每个样品扫描3次，获得3条近红外光谱，取其平均值作为样本的光谱数据，每条光谱有439个吸光度值数据；3）将样品的吸光度数据代入模型公式进行计算，即可获得样品的粗蛋白质含量。采用本发明方法，预测速度快，对样品无损，适用于大批量样品检测。
Description
技术领域
本发明畜禽产品化学成分分析技术领域，具体地说，涉及一种云南地方鸡肌肉冻干粉粗蛋白质含量近红外检测方法。
背景技术
鸡肉历来被认为是一种健康肉类食品，富含蛋白质，脂肪含量较低，是优质的蛋白质来源，在世界各国人民的蛋白质食品中占有极重要的地位。云南省地处中国西南边境，位于北回归线附近，地势北高南低，海拔差异大，区域内多高山、河谷、丘陵，有热带气候、亚热带气候、温带气候、寒带气候，常年温差变化不大，日温变化较大，因其独特的地理环境、气候特点、26个民族不同的养殖习惯，使得云南地方鸡资源相当丰富，大、中、小型鸡各具特色，肉质差异较大，由于云南地方鸡大都具有耐粗饲、肉质鲜嫩可口等优点，近年来深受广大消费者的喜爱，养殖规模、养殖数量和养殖质量在不断的扩大和提升。
鸡肉蛋白质含量的检测是保障鸡肉产量和质量提升必不可少的环节。检测鸡肉粗蛋白质含量现在常采用凯氏定氮法，该方法存在耗时长，检测步骤繁琐，消耗大量化学试剂有些还是有毒有害试剂，对检测人员实验技能要求较高等缺点，难以实现大批量鸡肉粗蛋白质的快速测定。
目前近红外检测技术在鸡肉检测中也有一些报导，如Abeni等(2001)在7645-4188cm-1针对肉鸡胸肌建立粗蛋白质近红外定量预测模型。Windham等(2003)在11765-9524cm-1针对肉鸡胸肌建立粗蛋白质近红外定量预测模型。Berzaghi等(2005)在9091-4003cm-1针对产蛋鸡胸肌冻干样建立粗蛋白质近红外定量预测模型。Riovanto等(2012)在11765-9524cm-1针对肉鸡、土鸡和土杂鸡的胸肌肉糜建立粗蛋白质近红外定量预测模型。Kadim等(2005)以150只肉鸡的不同部位混合肉冻干粉为研究对象，在12500-3571cm-1波长范围上建立粗蛋白质近红外定量预测模型。燕昌江等(2012)以200只肉鸡胸肌肉糜为研究对象，在10000-3996cm-1波长范围上，建立粗蛋白质校正模型。刘炜等(2009)以9个鸡种148个腿胸肌肉糜样本为研究对象，在10000-3996cm-1波长范围上，建立粗蛋白质校正模型。Cozzolino等(1996)以48只公母各半肉鸡的腿胸肌肉糜为研究对象，在25000-4000cm-1波长范围上，建立粗蛋白质校正模型。刑素霞等(2015)以土鸡和肉鸡胸肌肉糜各30个样本为研究对象，在11765-9524cm-1波长范围上，分别建立土鸡和肉鸡胸肌肉糜的粗蛋白质校正模型。上述模型基本是用所有样本进行校正模型的建立，没有进行外部验证，模型的稳定性有待进一步研究。除此之外，模型的建模谱段基本为全谱段，没有消除全谱段中的冗余信息(此处所说的全谱段为近红外分析仪的全谱段，若近红外分析仪是短波谱段则建模采用短波近红外谱区如11765-9524cm-1进行建模，若红外分析仪是长波谱段则按长波建模)。
目前针对鸡肉的近红外研究相较猪肉和牛肉来说偏少，特别是针对优质地方鸡的研究就更少，云南优质地方鸡在近红外光谱方面的研究基本属于空白。云南省由于地理自然条件的优势，地方鸡多达20多个种类，涵盖了大、中、小体型鸡，鸡肉差异较大，使用肉鸡所建近红外模型进行分析往往得不到准确的结果，需就云南地方鸡进行专门的研究。在目前对鸡肉近红外分析的研究中，基本上是针对胸肌的研究，较少学者做了腿胸肌混合样品的研究，而在鸡肉的生产和消费中，腿肌也是鸡肉中很重要的构成部分，因此尚缺少腿肌的研究内容。
发明内容
为克服背景技术中的问题，本发明提供一种云南地方鸡肌肉冻干粉粗蛋白质含量近红外检测方法，构建了一种快速检测云南地方鸡腿肌和胸肌冻干粉中粗蛋白质的数据模型，用户只要按要求处理样品和进行近红外光谱扫描，将获得的样本光谱吸光度值代入公式，即可获得样本粗蛋白质含量，降低了样本检测的复杂性，适用于大批量的样品检测。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种云南地方鸡肌肉冻干粉粗蛋白质含量近红外检测方法，具体步骤如下：
1)取云南地方鸡腿肌或胸肌鲜样20～30g，剔除其表面筯膜，切成肉沫，冷冻干燥后打粉，全部过80目筛，冻干粉样品不少于5g，装入厚度为6丝的聚乙烯自封袋中，保持袋面的干净；
2)近红外光谱仪配备傅立叶变换分光系统及漫反射式光纤探头，光谱采集软件具有数据导出功能，光谱背景扫描时取6丝自封袋单层置于探头前去除背景影响，每个样品扫描3次，取其平均值作为样本的光谱数据，每条光谱有439个吸光度数据；
3)将样品的439个吸光度数据代入构建的模型公式进行计算：
式中：CP表示肌肉冻干粉样品的粗蛋白含量(％)；i表示1至439，ai表示系数，xi表示样品光谱的439个波数点对应的吸光度值。
其中，步骤2)中的光谱扫描的波数范围为5262～6951cm-1，分辨率8cm-1。
表1波数与系数对应表
本发明的有益效果：
(1)本发明是基于云南大型、中型和小型地方鸡腿肌和胸肌粗蛋白质近红外定量分析的研究结果上提出的云南地方鸡肌肉粗蛋白质含量预测模型，解决了云南地方鸡品种差异大所带来的肉鸡近红外模型不适用的问题。
(2)本发明给出的预测模型简单，用户只需按照要求扫描近红外光谱，将吸光度值代入模型即可获得预测结果，使用方便；针对目前鸡肉近红外分析方法只适用于胸肌的情况，本发明给出的模型同时适用于腿肌和胸肌，扩大了模型的适用范围。
附图说明
图1为五种云南地方鸡腿肌与胸肌冻干粉近红外原始光谱图；
图2为五种云南地方鸡腿肌与胸肌蛋白质提取物近红外原始光谱图；
图3为本发明实施例样品近红外原始光谱图。
具体实施方式
一种云南地方鸡肌肉冻干粉粗蛋白质含量近红外检测方法，具体步骤如下：
1、取云南地方鸡腿肌或胸肌鲜样20～30g，剔除其表面筯膜，切成肉沫，冷冻干燥后打粉，全部过80目筛，取筛下物，筛下物样品不少于5g，装入厚度为6丝的聚乙烯自封袋中，保持袋面的干净；
2、近红外光谱仪配备傅立叶变换分光系统及漫反射式光纤探头，光谱背景扫描时取6丝自封袋单层置于探头前去除背景影响，光谱扫描的波数范围为5262～6951cm-1，分辨率8cm-1，每个样品扫描3次，取其平均值作为样本的光谱数据，每条光谱有439个吸光度数据；
3、将样品的439个吸光度数据代入模型公式进行计算：
式中：CP表示肌肉冻干粉样品的粗蛋白含量(％)；i表示1至439，ai表示系数，xi表示样品光谱的439个波数点对应的吸光度值。
其中，模型的建立过程为：
(1)选取300日龄以上原产地放养的云南武定鸡47只、新平黎明鸡58只、剑川青花鸡58只、尼西鸡48只、无量山乌骨鸡52只，除武定鸡是18个公鸡和29个母鸡外，其余每种鸡公母各半，屠宰取其全部的腿肌和胸肌，剔除表面筋膜，切片，冻干，打粉，过80目筛，取筛下物进行化学分析和光谱扫描。
(2)参照《GB/T.9695.11-2008肉与肉制品氮含量测定》中半微量定氮法测定样品的粗蛋白含量，样品形态是冻干粉。
(3)制备肌肉冻干粉蛋白质提取物。从每个品种的鸡肉腿肌和胸肌冻干粉中各选取20个样本，其中公母各半，采用氯仿-甲醇超声波法，提取冻干粉中的脂肪，参照Visessanguan等(2004)和周雪松(2006)等蛋白提取方法，对脂肪提取后的剩余样品进行蛋白提取，具体方法如下：(a)将提取脂肪后的剩余样品，放入50ml的离心管中，加入10倍体积溶液A(15.6mmol/L Na2HPO4，3.5mmol/L KH2PO4，Ph7.5)，用组织捣碎机在10000rpm下匀质1min(可适当增减时间)后，在冷冻离心机中离心(5000rpm，15min，-4℃)，重复离心二次，每次取出上清液至50ml离心管中；(b)将取出的上清液加入50％三氯乙酸(TCA)使上清液最终TCA浓度达到10％，在冷冻离心机中以5000rpm离心15min，上清液为非蛋白氮，沉淀为水溶性蛋白；(c)将(a)中得到的沉淀加入10倍体积的溶液B(0.45mol/L KCl，15.6mmol/LNa2HPO4，3.5mmol/LKH2PO4，Ph7.5)，使用组织匀浆机10000rpm匀质1min(可适当增减时间)，匀浆液在冷冻离心机中5000rmp离心15min，重复离心二次，每次取出上清液置于另一50ml离心管中，上清液部分为盐溶性蛋白，沉淀部分为碱溶性蛋白和非碱溶性蛋白。(d)将(c)中得到的上清液放(含盐溶性蛋白)在40℃水浴锅中蒸干，再将蒸干后得到的沉淀与(b)中获得的上清液(含水溶性蛋白)和(c)中得到的沉淀(含碱溶性蛋白和非碱溶性蛋白)直接放入冻干机中冻干24h，冻干后的样品放入研钵中研成粉状，均匀混合后，再放入冻干机中冻干至恒重，制备成肌肉提取蛋白样品，简称蛋白提取物。
(4)使用岛津傅立叶变换红外光谱仪IRPrestige-21及其配套近红外附件FlexIRTM Near-Infrared Fiber Optics module扫描样品，光谱采集软件为岛津IRsolution 1.50，光谱室温度恒定为25±2℃，湿度为38±5％。光谱扫描的波数范围为3996-10002cm-1，分辨率8cm-1。使用背景扫描时，将预先剪好的1cm直径的6丝PE圆片放置于背景金箔面上，用于背景扫描时去除PE对样品光谱的影响。将腿肌和胸肌冻干粉和蛋白质提取物样品装入6丝厚聚乙烯(PE)自封袋中，光谱扫描时样品厚度不低于5mm。每个样品扫描3次，每次扫描50遍，每个样品获得3条近红外光谱。
(5)将近红外光谱数据从IRsolution 1.50软件中以文本形式导出，再导入EXCEL文件中保存，以每个样品的3条近红外光谱的平均值作为分析时使用的原始光谱数据，五种云南地方鸡的原始光谱图如图1所示，五种地方鸡的蛋白质提取物光谱图如图2所示。
(6)建模样本(样正集)与验证样本(验证集)的划分：在263个腿肌冻干粉样本中，从每种地方鸡中各取40个样品(除武定鸡公鸡18个，母鸡22个样品外，其余四种鸡公母各半)，共200个为建模样本，剩余63个为预测样本，样品划分时满足预测样品的全部化学成分检测值均包含在建模样品中的要求，胸肌冻干粉的样品数量和划分方法同腿肌冻干粉。将腿、胸肌冻干粉校正集的各200个样本合并在一起，组成由400个样本构成的腿胸肌冻干粉校正集；将腿、胸肌冻干粉验证集各63个样本合并，组成由126个样本构成的腿胸肌冻干粉验证集。样品粗蛋白质检测结果如表2所示。
表2建模集和验证集的样品粗蛋白质含量化学检测结果
(7)建模波数和光谱预处理方法的选择，根据蛋白质提取物和冻干粉的特征光谱形态，划分出11个建模谱区，采用4种不同的光谱预处理方法建模，建模方法为偏最小二乘法(PLS)和留一内部交互验证法，建模结果见表3。
评价校正模型即定量预测模型的质量采用校正决定系数校正标准偏差SECAL、留一法内部交互验证决定系数留一法内部交互验证标准偏差SECV四个指标，以最高的校正决定系数和最小的交互验证标准偏差SECV确定最优的校正模型。各评价参数计算公式如下：
其中：yi，actual为第i个样品化学检测值，yi，predicted为用所建模型对第i个样品的预测值，为建模集中所有样品化学检测值的平均值，n为建模集的样品数。的计算公式同SECV的计算公式同SECAL。
模型建立后，采用验证集对其进行外部验证。衡量模型预测效果的指标是预测决定系数预测标准偏差SEp，验证集标准偏差与预测标准偏差的的比值RPDp。和SEp的计算公式同校正集，只是将建模样本更换为验证样本，RPDp的计算公式如下：
其中：SDp为验证集所有样本化学检测值的标准偏差。
根据校正模型的评价指标、内部交互验证的评价指标和外部验证评价指标综合评定模型的优劣，根据模型的优劣筛选建模特征光谱区及光谱预处理方法。
根据表3中的建模结果，筛选出的最佳建模波数为：5262～6951cm-1，建模最佳光谱预处理方法为SNV+gapsegment(#，15，7)。
表3不同建模谱区与光谱预处理方法的冻干粉粗蛋白质建模结果
(8)异常样本的删除，采用蒙特卡洛交叉验证法计算残差均值和残差方差，删除残差均值2.0及方差0.9以上的样品69个，实际建模样本312个，验证样本98个。
(9)在所选的建模谱区和全光谱、光谱预处理方法和原始光谱的基础上，采用312个样本建模，98个样本验证，建模方法仍采用偏最小二乘法(PLS)和留一内部交互验证法，建模结果见表4，最佳模型的为0.95，SECAL为1.08，为0.94，SECV为1.18，验证结果为为0.95，SEp为1.04，RPDp为4.62，构建的最佳模型为
表4五种云南地方鸡肌肉冻干粉粗蛋白质优化建模结果
实施例
1)分别使用武定鸡、新平黎明鸡、尼西鸡、无量山乌骨鸡、剑川青花鸡的腿肌和胸肌样品各2个，绒毛鸡腿肌和胸肌样品各6个，按光谱扫描要求(光谱背景扫描时取6丝自封袋单层置于探头前去除背景影响)进行光谱扫描，扫描波数范围5262～6951cm-1，分辨率8cm-1，获得的原始光谱图如图2所示。
2)每个样品扫描3次，取其平均值作为样品的光谱数据，将各样品5262～6951cm-1波数对应的吸光度值代入公式进行计算，获得预测的粗蛋白质含量，样品粗蛋白质化学检测值和预测值的对应情况如表5所示，所述的公式为：
表5样品粗蛋白质化学检测值和模型预测值对照表
由表5可看出，本发明提供的检测方法，具有结果可靠、分析效率高、无污染、成本低、适用于大批量样本检测等优点，可为云南地方鸡肌肉粗蛋白质分析提供可靠依据。
本发明通过构建了一种快速检测云南地方鸡腿肌和胸肌冻干粉中粗蛋白质的数据模型，用户只要按要求处理样品和进行近红外光谱扫描，将获得的样本光谱吸光度值代入公式，即可获得样本粗蛋白质含量，降低了样本检测的复杂性，结果可靠、分析效率高，适用于大批量的样品检测，可为云南地方鸡腿肌和胸肌粗蛋白质分析提供可靠依据。
最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (2)
1.一种云南地方鸡肌肉冻干粉粗蛋白质含量近红外检测方法，其特征在于：具体步骤如下：
1)取云南地方鸡腿肌或胸肌鲜样20～30g，剔除其表面筯膜，切成肉沫，冷冻干燥后打粉，全部过80目筛，冻干粉样品不少于5g，装入厚度为6丝的聚乙烯自封袋中，保持袋面的干净；
2)近红外光谱仪配备傅立叶变换分光系统及漫反射式光纤探头，光谱背景扫描时取6丝自封袋单层置于探头前去除背景影响，每个样品扫描3次，取其平均值作为样本的光谱数据，每条光谱有439个吸光度数据；
3)将样品的439个吸光度数据代入构建的模型公式进行计算：
<mrow>
<mi>C</mi>
<mi>P</mi>
<mo>=</mo>
<mn>92.229271</mn>
<mo>+</mo>
<munderover>
<mo>&Sigma;</mo>
<mrow>
<mi>i</mi>
<mo>=</mo>
<mn>1</mn>
</mrow>
<mn>439</mn>
</munderover>
<msub>
<mi>a</mi>
<mi>i</mi>
</msub>
<msub>
<mi>x</mi>
<mi>i</mi>
</msub>
</mrow>
式中：CP表示肌肉冻干粉样品的粗蛋白含量(％)；i表示1至439，ai表示系数，xi表示样品光谱的439个波数点对应的吸光度值。
2.根据权利要求1所述的一种云南地方鸡肌肉冻干粉粗蛋白质含量近红外检测方法，其特征在于：步骤2)中，光谱扫描的波数范围为5262～6951cm-1，分辨率8cm-1。
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- 2017-11-03 CN CN201711069341.4A patent/CN107884361A/zh active Pending
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