PT98193B - Estojo para a dosagem especifica de angiotensina ii - Google Patents

Description

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Uma publicação recente mostrou que a própria ftng III á d eg r ad ad a em dois peptideos CD. J. CAMBELL et al., J. Hypertens 19 0U , 8 , 165-172) « Por entre estes peptideos de degradaçãi pode-se citar em particular ucn hexapeptídea de fórmulas de aqui em diante denominado hexapeptídeo <XV) e um peptídeo Φ. fórmulas <V)

H-Tyr-I1e-His-Pro-Phe-OH de aqui em diante denominado pentapeptídeo CM),

Estes peptideos de degradação estão presentes no plasma humano» é verosímil que eles apareçam igualmente no plasma de outros mamíferos» A exploração hormonológica do sistema renina—angioten— sina é muito importante para o diagnóstico e o tratamento da hipertensão arterial» Actua1mente esta exploração efeetuada na clinica limita-se à medida da actividade enzimática da renina plasmática, da actividade da enzima de conversão e à medida da concentração ρ'ίasmática da renina activa» A dosagem directa da ftng II, que é o peptídeo activo do sistema, é difícil de realizar por várias razões; muito fraca concentração plasmática da ftng 11 <3 a 2Θ pg/mL no indivíduo normal, ou seja 3« 10“"*- a ^ — i 1 2*10 * ' R> que necessita da utilização de um anticorpo Anti—ftng II muito afim; H-Val-Tyr -His-Hr

D -Phe-OH < IV) estrutura da analogia de peptideos resultantes d

Ang II com diferentes clivagem do angiotensino- géneo e presentes no plasma, em particular a Ang I e sobretudo a Ang ΙΊ1 ou outros peptideos de degradação que podem interferir na dosagem,

Assim, «3. NUSSBERBER et al« desc rsveíTi uma dos agem radiaimu.nolégica que não permite di stinguir a s Ang II e III no plasma humano CHormon. Me ta b = Res„, 1984, 16 C ϊ ϊ ), 6Θ6-6 10 e J.

Hypertens., supl., 19S8, 6 <4>, 8424-84253„ Por outro lado, o Pedido de Patente Europeia N2 273 453 descreve vários anticorpos monoclonais anti-Ang II que apresentam todos uma reactividade cruzada com a Ang III; a mais fraca reactividade cruzada, observada para um de entre eles, é de 32 X. Assim a reacçSo da Ang II com estes anticorpos não é específica.

Além disso, este anticorpo monoclonal tem uma afinidade 9-1 fraca, da ordem de í<â M , que é insuficiente para permitir uma pp „ dosagem no plasma (Biochem, Biophys, Ffes. Commun. 1987, 143, 133-139). 0 anticorpo anti-Ang II, chamado 4DS e descrito nas actas do Congresso "The reniri Angiotensin System as a Therapeutic Target" - Bã1e, 29-31 de Outubro de 1989, comunicação SANOFI, i f _ -j possui uma forte afinidade da ordem de 10 Μ μ mas apresenta uma reactividade cruzada da ordem de 1Θ6 X com a Ang III e com o hexapsptídeo (IV); apresenta uma reactividade cruzada com o pentapeptídeo \V> de cerca de 50 %, Com efeito, ê muito difícil e não conhecido hoje em dia ter um anticorpo ao mesmo tempo com muita afinidade pela Ang II e sem reacçãc cruzada com a Ang III e os peptideos de degradação. t Λ

Por outro lado, a dosagem específica da Ang II apresenta hoje em dia uma dificuldade metodológica que é a necessidade de efectuar sucessivamente vários passos sobre o tipo sanguíneo íJ„ NUSSBERGER et al. , Hypertension, 1986, 8, 476-482): 1» uma esítracçSo das diferentes angiotensinas e dos peptídeos de degradação para preparar um ewtracto plasmático que os contenha?

uma separação por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC/ das diferentes angiotensinas resultantes do metabolismo do angiotensinogêneo e presentes no plasma; uma dosagem radioimunológica das fracçSes recolhidas depois da eluição. A e>;tracção das angiotensinas do plasma é um passo indispensável comum a todas as técnicas de dosagem da Ang II; ela é efectuada por cromatografia sobre uma coluna de sílica segundo O método descrito por J. NUSSBERSER et al. em Hypertension, 1985 <7>, supl. 1, Ι-Ι-ϊ-7*

Por causa do passo de separação por HPLC, esta técnica è pesada e longa na aplicação; é por isso que ela não pode ser utilizada para dosear um grande número de amostras plasmáticas em condições de rotina» sej a

Procurou-se pôr em estado de utilização uma dosagem específica da Ang II, permitindo medir com precisão a taxa de Ang 11 quaisquer que sejam as concentrações de Ang II, de Ang III e de peptídeos de degradação presentes no meio e que realizável num tempo compatível com uma utilização clínica de rotina. Uma tal dosagem específica apresenta. u.m grande interesses - seja para estudar a fisiologia do sistema renina-angio-tensina em diferentes espécies animais nas situações e κ per i mentais , - seja para diagnosticar situações patológicas no homem, seja para o diagnóstico e o prosseguimento dos tratamentos da hipertensão arterial.

BeraImente, a ftng II é doseada s partir do plasma. Pode—se,, de acordo com o presente invento, realizar a dosagem da Ang II, quer no plasma quer em qualquer outro líquido biológico em que ela esteja presente. ft dosagem de acordo com o presente invento pode ser efectuada para qualquer espécie animal na qual se deseja conhecer a medida específica da Ang II , e mais particularmente no homem.

De acordo com o presente invento, veríficou-se que se pode efectuar uma imunodosagem especifica da Ang II utilizando simultaneamente um anticorpo dirigido contra a Ang II destinada à dosagem propriamente dita e um anticorpo específico da Ang ΪΪ1 assim como, eventualmente, um ou vários anticorpos específicas cada um da Ang I ou de um peptídeo de degradação. Por anticorpo específico da Ang III e anticorpo específica da Ang I ou de um peptídeo de degradação, entendem—se os anticorpos que apresentam cada um uma reacção cruzada frente à Ang II, inferior a i® %,

Assim, a Ang III e eventualmente a Ang I e os peptídeos de degradação, captados cada um por um anticorpo específico, não estão praticamente mais disponivsis para dar reacções cruzadas com o anticorpo anti-Ang II» A dosagem da Ang II torna-se assim total mente especifica., quer dizer to tal mente isenta de toda a interferência devida à presença de peptideos aparentados no tipo»

De acordo com o presente inventa, a medida da Ang II comporta apenas .c passos» 1» a extracçlo das diferentes angiotensinas e dos pepti-deos de degradação para preparar o extracto de liquido biológico que as contém; 2. a dosagem imunológica propriamente dita da Ang II contida na referida extracta»

Desta maneira, evita-se a separação por HPLC das diferentes angiotensinas no extracto, sendo este passo o mais lento e o mais trabalhoso do protocolo de dosagem especifica da Ang II. A dosagem imunológica utilizada é uma dosagem por competiçãos a Ang II marcada, ligada ao anticorpo anti-Ang II é deslocada pela Ang II não marcada contida na amostra a dosear* A referência a uma curva de padronização, realizada com padrões que contêm quantidades conhecidas de Ang II, permite determinar a concentração em Ang II presente na amostra» ft Ang ΪΪ é marcada, quer por um radioelemento, tal como o trítio í '"'H) ou o iodo 125 quer por u.ma enzima tal como, por exemplo, a acatilcoiinesterase, a peroxidase, a fosfatase alcalina ou a fl-galactosidase, quer por um marcador fluorescente, quer por um marcador luminescente-

De acordo coo· o presente invento, junta-se no meio reaccional um anticorpo especifico da Ang I1I e, eventualmente, um ou vários anticorpos específicos cada um deles da Ang I ou de um peptídeo de degradação que mascaram a Ang 111 e, eventualmente, a Ang I e os peptídeos de degradação presentes na amostra por formação do (ou dos) complexo(s) sntígeno-anticorpo correspondeu— te(s>» Evita-se desta maneira o aparecimento de reacções cruzadas entre a Ang III e, eventualmente, da Ang 1 e dos peptídeos de degradação presentes na amostra, com α anticorpo anti.-Ang II. 0 presente invento tem também por objecto um estojo para a dosagem específica de angiotensina II que compreende: o anticorpo anti-Anç II, uma solução de Ang II marcada, soluções que contêm padrões de Ang Ϊ1 em concentrações conhecidas a crescentes, a ou as soluções de lavagem necessárias, uma solução de anticorpo anti.~Ang III, apresentando g referido anticorpo uma reacção cruzada com a Ang II inferior a 1© li, de preferência inferior a 5 %, e, eventualmente, uma solução de anticorpo anti- -Ang I e/ou uma t í d eo (IV) e/ou solução de anticorpo anti-heMapep-uma solução de anticorpo antipen- tapeptídeo <V>, apresentando os referidas anticorpos uma reacção cruzada com a Ang II inferior a 10 de preferência inferior

Quando a Ang II é marcada por uma enzima, o estojo compreende além dissos uma soluçêto que contém o substrato da referida enzima e, nesta circunstância, um ou vários reagentes necessários para revelar a actividade da enzima. uma solução destinada a parar a reacção enzimáti-ca„ 0 anticorpo anti-Ang II utilizado no estojo de dosagem pode ser policlonal ou inonoclonal ; ele pode ser utilizado em solução ou fixado sobre um suporte sólido. Como suportes sólidos podem-se citar tubos, -placas de mic ro ti tu 1 ação e partículas, magnéticas ou n^o.

De acordo com o presente invento, o anticorpo anti-Ang II preferido é inonoclonal; vantajosamente, é fixado sobre um suporte sólido, de acordo com os médtodos bem conhecidos pelos peritos na técnica. 0 anticorpo anti-Ang III pode ser um anticorpo policlonal ou um anticorpo inonoclonal. 0 mesmo para os anticorpos antx-Ang I, anti—hexapeptídeo (IV) e anti-p-entapept.ideo ÍV>«

Quando os anticorpos utilizados estão em solução, determina-se, previamante à dosagem, a diluição conveniente para que os peptideos presentes na. amostra a dosear sejam capturados cada um pelo anticorpo antipeptídao correspondente. 0 presente invento tem igualmente por ofajecto o processo que utiliza o estojo de dosagem de acordo com o invento, 0 - í i ··

referido processo é caracterizado por compreender os seguintes passos, segundo os quaiss a) ss prepara o meio reaccional que compreendes I - o exiracto de líquido biológico a dossar, - o anticorpo anti-Ang II, a Ang II marcada,

J a anticorpo anti-Ang III, e, even tua Intente, o anticorpo anti-Ang 1 e/cu o anticorpo anti-hexapeptideo <IV) e/ou o anticorpo antipen-tapeptídso í V)5 b) se prepara, simultaneamente, os meias reaccionais úteis para a padronização, compreendendo cada um deless um padrão de Ang II,

o anticorpo anti-Ang II, a Ang II marcada, o anticorpo anti-Ang III, e, eventualmente, o anticorpo anti-Ang I e/ou o anticorpo anti-hexapeptideo (IV) e/ou o anticorpo antipen-tapeptídeo (V)? * *.

c) se deixa i ncubar, a uma fc e a temper atura ambiente. d) se separa a Ang II ligada livre? e> finalmente5 se efectua a método apropriado. ?mperatura compreendida entre 4 °C durante 12 a 72 horas? ao anticorpo anti-Ang II da Ang II leitura dos resultados segundo um

PreferiveImante? o processo de acordo com o invento é utilizado para a dosagens específica da Ang II num extracto plasmático. F- assub

Quando o anticorpo anti—Ang II é utilizado em a) a b> são realizados misturandos solução. 25 a 5Θ® pL de extracto de líquido biológico a dosear, ou de padrão de Ang II, a um meia que contém» 25 a 50® μί_ de solução de anticorpo anti-Ang IX, 25 a 5®® μί_ de solução de anticorpo anti-Ang III,

eventual mente s 25 a 5®® μί_ de solução de anticorpo anti-Ang I e/ou 25 a 5Ô® μϊ_ de solução de anticorpo anti—hexapeptídeo (IV) e/ou 25 a 5®® uL de solução de anticorpo antipentapeptídeo ív5, e 25 a 5ΦΘ çt_ de solução de Anq 11 marcada. ca "v

Pode-se, eventual mente,, sfestuar uma horas antes de se juntar a solução de Ang pré-incubação ds II marcada,

0 passo d) ê realizado por um processo de uti I :l 7. ado c1ass i c amente s sepa raclo - quer por fixação imuno 1 óg ic a. utilizando anticorpos dirigidas contra as imunoglobulinas da espécie animal à qual pertence o anticorpo anti-Ang II utilizado, sendo estes anticorpos elas próprios insolubilizados sobre uma fase sólida ísuporte insolúvel tal como por exemplo tubosí; placas de microtitulação ou partículas, magnéticas ou não),

J complexo precipi- - seja por precipitação físico-química do antígeno-anticorpo com a ajuda de um agente de tação, tal como o polietilenoglicol, seja por separação do antígeno livre pelo complexo carvão-dextrano C J« NfJSSEERSER et al., J* Lab« Clin» Med., 1984, JJ3 (2), 304-312). modo de realização de acordo anti-Ang II está fixado sobre íTisíq reaccional Epassos a/ e

Quando, seguindo um outro com o presente invento, o anticorpo um suporte soiido, a preparação do

b)3 é realizada exsmpIo, uti 1 iza

na presença do referido suporte. Fade-se, tubas revestidos de anticorpo anti-Ang II por ΠΟ’λ quais se misturas 25 a 5tH-í y.L de extras to de líquido biológico a dosear. ou. de padrão de Ang 11, 25 a 5Φ0 μΐ. de solução de anticorpo anti-Ang III, solução de anticorpo solução de anticorpo eventual men te, 25 a 5ΘΘ p.L de anti-Ang I e/ou 25 a 5ΘΦ μΙ_ d* 14 anti-hetapeptídeo (IV) e/ou 25 a 5©é μί_ de solução de anticorpo antipentapeptídeo (V), e _ 25 a 50Θ μι. da solução de Ang II marcada»

Segundo este modo de realização do processo do invento, a separaçâQ Cpasso d)3 á realizada por aspiração da solução de incubação do meio reaecional apôs lavagem e nova aspiração para eliminar a Ang II que não está completada pelo anticorpo fitado sobre o suporte sólido.

Pode-se igualmente num tubo ou recipiente normal

preparar a mistura indicada acima e aí juntar o anticorpo anti-Ang II sob a iprííist de pa^ txcolas, fitado o anticorpo anti-Ang magnéticas ou não, sobre as quais está II. Neste caso, a separação Lpasso ci)3 è realizada segunda a mesmo princípio precedente, mas por aplicação de um processo que permite reter as partículas (centrifugação, filtração e utilização de um íman se se tratar de partículas magná?ticas),

Em todos o-s casos, realiza-se em seguida directemente o passo e) de leitura que se aplica à fase sólida na qual está incluso ou à qual está ligado o anticorpo anti-Ang II que complexa a Ang II a dosear.

De um modo geral, o passo de leitura depende do modo de marcação utilizado para a Ang II. Assim efectua-se: seja uma medida de radioactividade quando se utiliza uma ratíiomarcação, seja uma medida de absorção ou de emissão luminosa quando se utiliza uma marcação fluorescente ou

luminescente ou uma marcação enzimática . consoante a natureza da enzima a do substrato em causa·

Na descrição que se vai seguir e nas reivindicações =, os aminoácidos são denominados utilizando as abreviaturas recomenda- das pela IUP AC; além disso, são turas; BOPs heKafluorofosfato de ! fosfónxo J Boc s terc-butoκ i c a rfconi1o Mob; para-me to;··; i ben silo DCB s 2 ? 6~d ic1oroben z i1o Tas; tosilo AcHs anticorpo ntonoc 1 ona 1 SAB; sero-albumina bovina BBS; g ama—g1obu1ina bov ina J X pffl s impulso por minuto PEBs po 1 i e t i 1 en oq 1 i c o 1 LPH: hemocianina de Limulu

Bulfo HBSs sal de sódio de N—Í3—maleimidohenzoiloKi)sul-i uisbUi- t_xs j x m x d a 16 ·"

Bos concentração do complexo Ang ΣΙ marcada-anticorpo anti-Ang II, na ausência de Ang II, ou de Ang III, não marcada» concentração do complexo Ang II marcada-anticorpo para cada concentração de Ang II ou de Ang III não marcada» !-inaImente, um outro obj-ecto do presente invento é a preparação de anticorpos anti-Ang III»

preparado de maneira clássi-um imunogéneo» 0 referido vado peptídico fixado sobre 0 anticorpo anti-Ang III é ca por imunização de um animal com imunogéneo é constituído por um deri uma proteína modificada ou proteína vectora Bynec» 1972, 113, pp» 751-757). A título de que podem ser utilizados neste processo., pode (ver Am» exemplos-—se cita? 3» de

Ob· t animais cus1ha, a cabra, o carneiro, a ratazana e o rato»

Os anticorpos monoclanais são obtidos pelo método de Kohler e Heistein bem conhecido de um perito na técnica»

Da mesma maneira, podem-se preparar anticorpos anti-Ang I, anti-hexapeptídeo (IV) e antipentapeptídeo (V).

A utilização da proteína vectora na imunização frente a moléculas de fraco peso molecular (hepteína) permite introduzir a formação de anticorpos específicos anti-hepteinas no animal» formação de uma ligação covalente do

As proteínas vectoras mais utilizadas actua1mente são as albuminas de origem animal (comercialmente disponíveis, estáveis, muito imunogéneas)» A síntese da conjugado proteína--peptídeo é realizada pela tipo tio-éter entre o grupo tiol do peptídeo e o grupo maleimida da proteína introduzida previamente por reacção com o sulfo MBS.

De acordo com o presente invento, o derivada peptidica escolhido como imunogéneo para preparar o anticorpo anti-Ang III corres-ponde á formulas (VI) H-Arq—Va 1 -Tyr-11 e-His-K, —R,,—Cys-NH- na qual Rí.dss igna UífiS 1 ! J. .<· CjctÇãO .~t ~ c ta i compreende 1 ou d ! -£ãfFiÍ.nOáf' •W I dQ s na R ^ rep rsse nts -Pr D“ OU “ Pr O 1 xo- eido n atur al; R._, rep rsse d ta um grupo d B 1' Ò r mu I qual n V «£ Γ* !&. B n tr e 1 e 9 í u 5 p* * catpr* Assim, de acer do com o pr en te a ou um encadeamento que anti-Ang III preterido è o anti-soro obtido por imunização de um animal com o imunogéneo constituído pelo peptídeo (VI) finado sobre uma proteína vectora.

Maxs particularmente preferido é o anti-soro obtida peio imunogéneo constituída pelo peptídeo fórmulas H-Arg-VaI -Tyr-X 1 e-His-R' ^- Ah~Cys-NH.-, na qual R'j representa ácido natural e -Pro- ou -Pro- ligado a um outro amino-

I

- Ahx designa α resíduo do ácido amina-6·-heanóico, sendo o referido peptídeo transportado pela sero-albumina bovina sTiOdificada pelo sulfo HBS. Quando o animal é α coelho? o anti— ~soro assim obtido apresenta uma reacção cruzada com a angioten— sina II inferior a 1 ’<»

Do mesmo modo, de acordo com o presente invento? o derivado peptídico escolhido como imunogéneo para preparar o anticorpo antí-Ang I corresponde à fórmulas

J

H~Uy5-R.-"R*7~ftrg~VaI-Tyr-Iie~His~Pra~Phe“His“Leu-OH (VII na qual designa uma ligação directa ou i.tm encadeamento que compreende 1 ou. 2 aminoácidos naturais; preferivelmente R? representa Asp ou Asp ligado a. um outro aminoácido natural; R.-j tem o valor indicado anteriormente para (VI).

jC

De acordo com o presente invento? o derivado peptídico escolhido como imunogéneo para preparar d anticorpo anti-he;·;apep-tídeo corresponde á fórmulas (VIII) H-Val-Tyr-Ile-His~R,-R^-Cys-NH,, na qual R-, ím is significados indicados acima para (VI). u deriva anticorpo

Finalmenta? da acordo com o presente invento? do peptídico escolhido como imunogéneo para preparar o antipentapeptídao corresponde à fórmulas H-Ty f— 11e-His

RrR2-Cyí na qual

-NH, íVIII) R^ e R.-, ti?'m os significados indicados acima para (VI)

Mas definições de R, , R" „ e R.,, o outro “ X * 3. O * natural pode ser escolhido de entre os arninoácidos Ala, Vai, Leu, lie, Pro, Phe, Trp, Met, Ser, Thr, Cys, aminoéeido sequ i n tes 5 Jyr -

Assim, de acordo com o presente invento, os anticorpos sso obtidos por xmunxcaç-áo de um anxmax com um derivado peptxdico de fórmula VII ou um derivado peptídico de fórmulas H- X j -T y r-11 e-His-R 1 -R^-Cys-NH^, na qual R, designa JL compreende represen ta uma liyaçao directa ou um encadeamento que 1 ou 2 arninoácidos naturaisρ preferivelmente Rj -Pro- ou -Pro- ligado a um outro aminoácido natura1;

R.~. representa um grupo de fórmula varia entre í e 9 5 prefrivelmente -MH-CCH n é 5; -CG- na qual n e carsctsrizado par; quando representa uma ligação directa, o anticorpo é especifico do pentapeptideoç quando X ^ específico representa a resíduo da do hexapeptídeo? valina, o anticorpo é

- quando X, representa o resíduo da dipeptídeo Arg-Val., α anticorpo é específico da angiotensina III»

Os anticorpos de acordo coo o invento apresentam uma rsacçao cruzada com a Ang II inferior a 1Θ de preferencia inferior a 5 X»

Os derivados peptídicas obtenção dos anticorpos de acordo outro objecto do invento» anteriores aplicados para a com o invento constituem um

enemalos Q invento vai ser agora descrito mais em detalhe lustrativos que se seguem„ pelos

I

Exemplo 1

Preparação de anti-Anq III A) Preparação da Peptideo (VI) na qual P» = Pro e Pu = Ahx os- ρ roceí 0 composta VI foi sintetisado em fase sólida utilizando ísqs conhecidos na química dos peptídeos» A fase sólida utilizada é a resina metil-4~henzidri1- amina funcionalizsda a uma taxa de 6,4 mmol por grama» A condensação sucessiva dos aminoácidos é efectuada pelo reagente BOP, sendo as funçães alfa-aminadas protegidas de modo temporário por um grupo Soe e desprotegidas por uma solução de ácido trifluoro-acético/dicloroetano/etanoditiol <35/70/5? v/v/v)« As cadeias-laterais dos diferentes aminoácidos são protegidas por grupos convenientes: Moh para Cys, Boc para His, Dcb para Tyr e Tos para

Arg« Uma vez sintetisado, o peptideo é desprotegido e separada da resina pela acção do ácido fluoridrico contendo 10 % de anisole durante i hora a Φ °C« 0 peptideo é em seguida precipitada com éter, recuperado por uma solução de acetonitri-lo/áçua/ácido trifluoroacético (60/40/6,1? v/v/v) e liofilisado, A purificação é efectuada por cromatografia liquida sob pressão sobre uma coluna de inversão de fases»

Os diferentes, resultados analíticos estão em conformidade· com a estrutura esperada para o paptideo (VI)» Β) Preparação da Proteína modificada [Lsrnsr,_R». A» et____a.l ( 1781Proc » Mat . ficad» 8cxc USfii 78 B 5 4 05»—340 / 3 =.prn-s A proteína (escolhida para. fixar o peptídeo (VI) é a. -o-albumina bovina íSAB) modificada por reacção com o sulfo MBS n A uma solução de 4 mL de SAB Ca 1Θ mg/mL) no tampão fosfato de potássio C€?,©5 M; pH = S,@) são adicionados 22,4 mg de IBS (Pierce) ! sn te s MBS/SAB» ratura ambienti t dur ante 18 hos pB - 7,0)„ A determinai dí3 número de f è. cisteína ;nal junta-se 0 íuave e depois dialisa- A determinação da taxa de substituição ê realizada pela irupos malsimida introduzidos graças à '14 iiossarcada pelo ' C« A Θ54 mL de meio reaccional junta-se €' ? 6 mL de tampão fosfato C Φ, i M§ pH - 7, &) e 14 0,05 mL de cisteína 20 mM adicionada de cisteína C (concentração final de 3 KBq/umol de cisteína)» Após incubação durante 1 hora e 30 minutos a 3Θ °C seguida de filtração do meio rea.cc lona I sobre uma coluna de cromatografia nas condições convenientes;i a medida da radioactividade permite calcular a taxa. de modificação observada que è de 11 grupos maleimida por mole de SAB» C)

Acoplamento do Peptídeo (VI)

IS horas a 4 ':‘C 5 g do peptídeo (VI) preparado anteriormente sSq dissolvidos em 0,25 mL de água. destilada. Esta. solução é adicionada a 1 mL de solução de SAB modificado (10 mg/mL)» A mistura é incubada durante 3 horas è temperatura ambiente e e depais eíectusm—se várias diálises extensivas contra tampão fosfato (©,; 1 fl» pH = 7?θ>,= 0 teste à cisteína radiomarcada è realizada de nova sobre a proteína após corte do peptídeo» A determinação da número de grupos malsimida não modificados indica por diferença uma taxa de substituição de 7 moles de peptídeo Cvl) por mole de SAB«

Dois outros conjugados imunogêneos que utilizam hemo— cianina de Lymulus polyhemus ÍLPH) e a transferrina humana (SIGMA) como proteína portadora foram preparados nas mesmas condicSes» D)

do__Anticorpo \ou Anti-soro) anti-Ang III 0 animal utilizado é o coelho de raça neozelandsza. A primeira imunização consiste numa injseção de 1 mg de imunogéneo na presença de adjuvante completo de Freund por via intradérmica, □s reforças são efectuados com o intervalo de um m@'s com a mesma quantidade de imunogéneo na presença de adjuvante completo de Freund por via subcutânea»

E) Determinação do Título dos Soros anti-Ang III iiçã 7,4) III 74 o de soro de coelho em tampão *f· SAB 3. @,2 % são incub •i os * I que =ados na Π5 3, Γ* C 3 d 3. com tem uma TBq/mmol ( r-llTíÍ-3 Γ* H3:Tl } v, causando 100 pL de uma díl imidazole-HCl (Θ?1 H; pH = presença de 1ΘΘ μ!_ de Ang actividade especifica de κ 5Θ0β ipm 1ivre é A separação da Ang III alizada pela adição de ligada ao anticorpo da Ang í mL de polietilenoglicol III 6ΘΟ0

X

(PES) a 20 Ά e de 100 p.L de? solução de globulinas bovinas a 10 mg/mL» Após centrifugação5 a radioactividade do fundo correspondente à Ang III ligada ao anticorpo é medida. A técnica utilizada è a descrita por BREEÍ4W00D, F. C„ et sl. IBinchem· J,, 1963, 89 „ 114-118).

Anq III 0 soro da coelho marcada com o iodo 125, F) Γ.Α! acterizacão Imunológica do Anti-soro____ar : 4* ·ί ·

-Anq III

a)

Avaliação da imunoactividade do anti-soro preparado frente à Ang III Í00 uL de uma solução (correspondente a cerca de 5Θ % incubados na presença de 50 μί_ III iodada causando 5ΘΘΘ ipm du diluída do anti-soro anti- •Ang 11Ϊ de ligação à Ang III iodad ia) são de Ang III livre e 5Θ p.L de Ang ante 18 hor -as a 4 *C» A sep< livre fas-se por precipitação em Ang III iodada-anticorpo é deslo-ca--pg de Ang ΪΙΪ. 0 anticorpo rece ção Ang II ligada e Ang III polietilenoglicol, A Iigação da de 50 V. pela adição de 25© nhece portanto a Ang ιII,

bi

Reaccões cruzade e a Anq II do anticorpo anti

Ang III com a. Ang I A reacção cruzada de medida frente è Ang I e Ang II, para os dois peptídeos. anticorpos anti-Ang III foi A percentagem é inferior a 1 % pode

0 anticorpo anti-Ang III ser utilizado tal qual s ação sobre proteína obtido no anti-soro ou depois de pur A—tíepharose*

Exemplo 2

Capacidade de Captura da Anq III pelos Anticorpos anti-ftng III Descritos ftnteriormente na Presença de Anticorpo ilono-clonal anti-ftna II 4D8 e de Ana II Iodada 0 anticorpo 4D8 é uma imunoglobulina de rato? ele é descrito nas actas do congresso "The Renin Angiotensin System as a Therapeufcic Target” - BSle, 29-3í ds Outubro de 1989, comunica-cão SANOFI«

Prepa 1* cd. ’ΗΗ- e u ma soluç 'ê.D que CO n tem« 100 μ L de um a soluçS Q ds a nt icorpo de coe1ho anti — Ang III , obti dO no Exemp lo lp 50 μΙ_ de uma •J}w v··.CI„.· de Anq r 113 50 μ'ι_ de um a soluç ão -4 ... Ufef Λ-. f-íi i g II iodada Eactividade específica de 74 TBq/mmol (Amersham)3, causando 4006* i p«jp ISO iiL de uma solução de anticorpo anti-ftng II (4D8), diluída de tal modo que não ligue senão 3Θ % da Ang ΣΙ iodada» 0 volume de reacção é completado até 400 μ!_ com o tampão de incubação, ou seja imidazole-HCl (€5,1 Mp pH = 7,45 que contém 0,2 % de SAB.. A incubação é realizada durante 18 horas a + 4 *C» particu1as magnéti~ as imunoglohulinas

Junta—se uma suspensão de 500 μ-L de recobertas de anticorpos dirigidos contra

de rato (Ameriex MP comercializadas por Amersham)» A incubação é realizada durante 15 minutos,, depois,: utilizando um iman5 sspa-ram-ss as partículas magnéticas do meia reaccional e mede-se a radioactividade contida na fase magnética,,

Realizou—se uma gama de medidas fazendo variar a quantidade de Ang III de 0 até 4Θ pg/ensaio» Foram efectuados ensaios de controlo na ausência de anticorpo anti-Ang III» A medida da radioactividade permite exprimir os resultados pela relação das concentrações B/Bo do complexo Ang II iodada-anticorpò anti-Ang II para cada quantidade da Ang III»

Estes- resultados são referidas na Tabela i» TABELA 1 '1 B/Bo (em %) Ang 11.1 j i i na ausíínc ia na presença ipg/ensaio) 1 de antico rpo de anticorpo f ... ....1....... anti-Ang ΪΙΪ anti-Ang III 0 \ \ i ) Í00 100 5 67 100 10 i 1 1 .“j 100 2€i ie 100 40 t 1 cη* 96

da Ang do

Como mostram os resultados da Tabela 1, a Ang II iodada ao anticorpo 4Lstí a (j x iTi x n li x cl a *p£? I â ad X IIIξ esta ligação é restaurada i ntegra1mente pela p anticorpo anti-Ang III» ligação ção de : ί·"ίΓ3 c.0rj ç £3

verificou-se também que a anti-Ang III à concentraç a reacção da Ang ϊI com os . adição ao lo utilisa-anticorpos

Nesta tíϊ·ί per is> r.. xa. , meio reaccional do anticorpo da não tem influência sobre < anti-Ang II»

Exemplo 3

Dosagem Específica da Ang II na Presença de Anticorpo anti-Ang III

Segundo um dos modos de real estojo uti.lá.sedo neste exemplo zaçlo descritos mais compreende an tá.corpos fflonoc1onais an ti

Ang 11 fixados sobre um suporte sólido»

Mais precisamente, os anticorpos slo fixados de um tubo <3tartu.be’~ comercializado por NUNC). constituído pelos seguintes elementoss

Startube NUNC revestido por anticorpos monoclonais anti-Ang II 4DB de tal modo que 3® % da Ang II iodada seja ligada,

so b r e as 0 estojo paredes é então soluções de Ang II, para a padronização, calibradas em relação ao padrão internacional Ang II lote 86/533, fornecida pelo Medicai Research Council, uma solução de Ang II marcada com iodo 125, de activi-riade tal como definido no Exemplo 2, uma solução de anticorpo mo-naclonal de coelho anti-Ang III¥ preparado no Exemplo í anterior e diluído de tal modo que permita captar pelo menos 1& pg de Ang III por ensai o 3 A dosagem é realizada em tampão imidazole~HCi <Θ,1 M, % de SAfc;,. 0 volume final da mistura de pH - 7 „4) que contém rec cão é de 25Φ p.L»

a> Curva__de Padronização___na Presença de !€* gq de finq III

No tubo revestido de anticorpo monoclonal 4D8, 1 00 p.L de anticorpo policlonal de coelho anti-Ang III são incubados com 50 μί_ de uma solução de fing III (correspondente a 1Θ pq de Ang III) 5 50 μ!_ de uma solução de Ang II padrão e 5Θ pL de uma solução de Ang II iodada (4ΘΘ® ipm)» durante 18 horas a 4 °C, A radioactividade é medida nos tubos secos após aspiração do meio de incubação e lavagem com 1 mí_ de tampão imidazole--HC1 (0,1 M? pH = 7,4), A radioactividade é a do complexo anticorpo anti-Ang II-Ang II iodada.

Realizou-se uma gama de padronização fazenda variar as quantidades de Ang II de Θ a 4Θ pq/ensaio, A. medida d-a radioactividade permite exprimir os resultados pela relação de concentração B/Bo do complexo Ang II iodada-anticorpo anti-Ang II para cada quantidade de Απα II (coluna í). o a reacção cruzada do anticorpo

Junta—se 1Θ pg de Ang III em cada um dos ensaios correspondentes à curva de padronização (coluna 2) e observa-se o abaixamento da relação B/Bo devid anti-Ang II com a Ang III presente

Finalmente, numa terceira série de experiências (colune 3), junta-se lt? pg de Ang III e de anticorpo anti-Ang III em cada um dos ensaios correspondentes à curva de padronização.

Os resultados são apresentados na Tabela 2 seguinte.

TABELA

Ang 11 < pg/ensaio) coluna 1 B/Bo <%} Sobrecarga 10 pg Ang III B/Bo í%) coluna 2 na ausência de anticorpos anti-Ang III coluna 3 na presença de anticorpos anti-Ang III 0 1ΘΘ 23 100 I »25 84 21 86 2,5 81 22 83 5 67 22 66 íô 47 18 49 20 29 12 36 40 17 11 21

Observa-se que a presença de anticorpos anti-Ang 1.11 permite reencontrar os valoras da curva de padronização graças á captura especifica da Ang III no meio reaccional.

Tem-se por outra via verificado, como no Exemplo 2, que a adição de anticorpos anti-Ang 111 à concentração utilizada não tem influência sobre a curva de padronização da Ang II» b > BBMSm-Í&gey^to_jQ-AQgLÍi-.a_£MAÍJL^ A dosagem propriamente dita é efactuada sobre um extracto pl asmático humarso, entracto esse obtido segundo a técnica descrita por 3 „ NUSSBEEGEB et ai., sm Hypertension, 1985 (referência citada), e depois concentrado»

No tubo revestido por anticorpo monoclonal 4D8, 100 pL ds anticorpo poiiclonal da? coelho anti—Ang III são incubados com ou iΘΘ μί_ de solução de Ang II padrão ou de extracto plasmático a dosear e 50 pL de uma solução de Ang II iodada (4000 ipm).s durante 18 horas a 4 ,:,C* A radioactividads ê medida nos tubos secos após aspiração do meio de incubação, como no Exemplo -3 a),

Uma de 'ter m xn aç ao da Ping I x sTsctuada na ausancc%a de anticorpo an ti-Ang III, conduz á determinação de uma quantidade aparente de 81 pg no ensaio, enquanto na presença de anticorpo anti-Ang III apenas se mede 57 pg no ensaio» A diferença resulta* da eliminação da quantidade de Ang III imunocapturada pelos anticorpos anti-Ang III»

Deduz-se ai que a presença de Ang III conduz neste caso a um erro de: 81

5U ja„ 42 % sobre a determinação d:l·

da Anq II realizada com a ajuda de anticorpo anti-Ang II (4DS), devida à reacção cruzada entre este anticorpo e a Ang III» Este erro pode ser suprimido graças ao emprego simultâneo do anticorpo anti-Ang III que é um dos objectas do presente invento»

Exemplo 4

Preparação do Anticorpo anti-Ang I

Prepara-se o peptídeo (VII) no qual R.-,=Ahx e R-ç=Asp? depois prepara-se o a.nti—soro de coelho por imunização segundo o

Exemplo

Preparado do Anticorpo anti-Hexapeptideo

Prepara-se o peptideo (VIII) no qual R, = Pro e FL, ·-Ah;·;, utilizando o processo descrito no Exempla 1, passo A.

Prepara-se em seguida o anticorpo (anti—soro de coelho) utilizando o processo descrito no Exemplo 1, passos B, C e D, e depois caracteri za~se,

J

Exemplo è

Preparação do Anticorpo anti-Pentapeotideo

Procede-se como no exemplo precedente parai preparar o paptideo (IX) no qual “Pro e R0—Ahx e depois prepara—se o anti-soro de coelho por imunização, utilizando o método descrito no Exemplo 1 e depois caracteriza—se.

Exemplo 7

Capacidade de Captura do Fentapeptideo (V) Pelos Anticorpos anti-Pentapeotídeos Preparados no Exemplo 4, na Presença de anlj-Ang II 4D5 e de Ano II Iodada

Prepara-se uma solução que contém: - 100 pL de uma solução de anticorpo antipentapeptídeo, preparada no Exempla 5, pen t a pe ρt í d so, 100 pL de uma solução de * ι

5δ pL de uma sol: ução ds Aí sspecífica de 74 TBq/mmo 400Ô ipm e que SS coloca no segundo o Exem *1 r*í 3« iodada !actividade causando A diluição final do anticorpo anti pentapeptídeo é ds 1/25« A incubação è realizada durante 18 horas a 4 °C« A radioactividade é medida nos tubos secos após aspiração do meio de incubação e lavagem com í ml_ de tampão imidasole-HCl (0,1 F1? pH = 7,4).= A radioactividade é a do complexo anticorpo anti-ftng II-Ang II 1odada.

Procede-se em seguida como no sKsmplo r e meoem se os resultados, que são indicados na Tabela 3 seguintes

TABELA

Pentapeptídeo (pg/ensaio) B/Bo (em %> na aus@ncia de: anticorpo an t i pentapepiídeo na presença de anticorpo an t i pen i s. pe p t i d eo 0 100 1 00 1,25 95 1 00 2,5 92 100 5 ’7F* 100 10 69 1 00 20 1_ .. _ „ . j 48 97

Exemplo 9

Dosagem Específica da Ang II na Presença de Anticorpos anti-ânq II e de Anticorpos ftntipentapeptídeo CV)

Segundo um dos acima, o estojo utilizado monoclonais anti-Anq II fi modos de realização descritos mais neste exmplc compreende os anticorpos ados sobre um suporte sólido.

Mais precisamente, os a.n paredes dum tubo e Startu.be comerc então constituído pelos seguintes ticorpos ializado são fixados sobre as por MUNO. 0 estojo à

Startube NUMC revesti anti-Ang ΧΊ 4D8 de tal seja ligada. du pur antiLurpos imonoc lonais modo que 30 .4 da Ang ι X iodada soluções de Ang XI, para relação ao padrão intern fornecida pelo Medicai Re a padronização, calibradas em acionai ηπq il lote Qg/5o8, sea rc h Counc i1, uma solução de Ang II marcada com iodo 125, de dade tal como definido no Exemplo 2,

~\C uma solução de anticorpo monoclonal de coelho anti-Ang IXI, preparado no Exemplo 1 anterior a diluído de tal modo que permita captar pelo menos 10 pg de Ang III por ensaioq uma solução de anticorpo policlanai de coelho antipen- tapeptídeo <V) preparado no Exemplo 5 snter tal que permite captar pelo menos 1Θ pg de or de modo pentapeptí- deo por ensaio ph-

A dosagem é realizada em tampão imidazole-HCl <0,1 M que contém 0,2 % de BAB. ÍC1 <0,1 M, mistura de reaeção ê de 25© μί_.

Efectua-se a curva de padronização em presença de 4 pg de Ang III e 4 g ds pentapeptideo»

No tubo revestido as anticorpo monoclonal 408, 100 pL de anticorpo policlonal de coelho anti-Ang III © antipentapeptí--deo são incubados com 50 pL de uma solução de Ang III e de pentapeptideo íV? (correspondente a 1€? pg de cada um dos peptí-deos) 50 pL de uma solução de Ang II padrão e 50 pL de uma solução de Ang II iodada (4000 ipm), durante 18 horas a 4 C'C» medi da no iS tubos secos 3poS SSpXí*"Ô agem com 1 íiiíL de tampão imidazole- radi oacti V j LQ5.Cí#í e -5 do complexo -HC1 (0,1 Np pH = 7?4)» anticorpo anti-Ang I I-ftnçj II iodada

Realisou-se uma gama de padronização fazendo variar as quantidades de Ang II de 0 a 40 pg/ensaio» A medida da radioac-tividad© permite exprimir os resultados pela relação de concentração B/Bo do complexo Ang II iodada-anticorpo anti-Ang II para cada quantidade de Ang II icoluna 11»

Junta—se 4 pg de Ang III e 4 pg de pentapeptideo (V) em cada um dos ensaios correspondentes â curva de padronização (coluna 2) e observa-se o abaixamento da relação B/Ba devido à reacção cruzada do anticorpo anti—Ang II com a Ang III e o pentapeptideo (V) presentes» e os

Finalmente, numa terceira série ds experiências (coluna •3> ? junta-se 4 pg de Ang III, 4 pg de pentapeptideo s antipent.apept.ideo (V) em à curva de padronização. sSo apresentados na Tabela 4 an ticdrpos anti-Ang III ensaios correspondentes Os resultados TftBFLft 4 cada um das seguinte;

Ang 11 (pg/ensaio) coluna 1 B/Bo <%} Sobrecarga 4 pg Ang III 4 pq fina 4-8 B/Ba (%) coluna 2 n a ausfncia de anticorpos anti-Ang III e anti-Ang 4-8 coluna 3 na presença de anticorpos-anti-Ang III e anti-Ang 4-8 © 1 0© 53 3. €5© 2,5 85 K «** **/ 87 £~ *_· • U«M 44 73 i $ 5ó 34 55 2© 38 *"P"7 38 1 Aft f-ii-n· 1 Q *T*cr

Observa-se que a presença de antic antiperstapeptideo (V) permite reencontrar as padronização graças á captura específica da pepií-deo <V) no meio reaccional. rpos anti-Ang III e valores da curva de Ang III e do penta- iem-se por outra v ia vsi rificadc como no Exemplo 2, que a adição de anticorpos ariti. -Ana .r III e antipentapeptíáso (V) ã concentração utilizada não tem infIu®r icia sobre a curva, d® pad r an i. z aç ão da Ang IIa

REIVINDICASSES lã. - Estojo para a dosagem específica de angiotensina II, caracterisado por compreender; o anticorpo anti-ftnq II, uma solução de Ang II marcada, soluções que contêm padrões de Ang II em concen-trsçoss conhecidas e crescentes, a ou as soluções de lavagem necessárias. uma solução de anticorpo do o referido anticorpo Ang II inferior a 10 %, anti—Ang III, apresentan uma reacção cruzada com de preferência inferior » tal men t & .. Uifiâ 5u I Uíy fSO de anti corpo an ti- OLl uma s 01 Lição de ant icorpo an ti pen ta ρα~- OU uma 3 o1ução de ant icorpo an ti-hexape- ipr ta ndo os refer idos ant icorpos uma :ru zada c om a Ang II inferior a Ιό X, de :ia inf: Eíf" lar & 5 %. ís> acor da ‘ CDlTl â reivin dicação X j; C C*. Γ* C te- 2ã. - Estojí risada por a Ang II ser marcada por uma enzima. 3ã. - Estojo de acordo com qualquer uma das reivindicações i ou 2, caracterizado por compreender, além disso, solução que contêm o substrato nesta circunstância.

um OU V á rSclCfSTl t©; a 1 ém disso, Lima marca a Ang T T a J. % para revelar a

Claims (3)

1. > j

   activi.da.de da. enzima e uma solução destinada a parar a reacção enzimática» 4.ã. - Estojo de acordo com a reivindicação i, caracte-rizado por a Ang II ser marcada, quer por um composto fluorescente, quer por um composto 1uminescente, quer por um radioelemento. 5â« - Estojo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 4, caracterizado por o anticorpo anti-Ang II ser monoclonal ou polieianal» I&ã. çSes í até 5, solução» - Estojo oe acordo com qualquer uma das reivindica— caracterizado por o anticorpo anti-Ang II estar em 7ã« - Estojo de acordo com qualquer çSss 1 até è, caracterizado por o anticorpo fixado sobre um suporte sólido» uma das reivindica-anti-Ang II estar I* t£* Λ· I&ç Sã. - Estojo de acordo com a reivindicação .do por α suporte sólido ser um tubo, uma placa cie 'd ou partículas, magnéticas ou. não» caracte- microtitu—

   9ã» - Estojo de acordo com qualquer uma ções 1 ou 2, caracterizado por os anticorpos anti-Ang I, antipentapeptídeo e anti-hexapeptídec pos morioc lanais ou policlonais» das reivindica-anti-Ang III, serem anticor- ri zado proven i&ã.- -- Estojo de acordo com a reivind por os anticorpos serem policlonais e iente de um anti-soro de coelho» ic ação 9 caracte- cada um deles ser 1 lã =, - Anticorpo, caractsrizado por ser obtido por imunisação de um animal com um derivado peptídico de fórmulaq H-Xj-Tvr-I1e-His-Rj-R^-Cys-NH, na qual R.j designa uma ligação directa ou um encadeamento que compreende 1 ou 2 aminoácidos naturais, R,-, representa um agrupamento da fórmula; -NH-<CH.,,) -00-na qual n varia entre 1 e 9, Xj representa uma ligação directa, Arg ou Arg-Val, segundo a especificidade do snti-soro a preparar, sendo o referido derivado peptídico ficado sobre uma proteína vectora. cação 11 por apra a 1® %, 12â. - An ÍZÍ.CD rpo anf x -Ang T T T XXX , caracteri zado por ser SB DSfC i í* 1 sentar uma nsac ção cruz B ú B C :om a de preferfn C 13. inferior % = de acordo com a reivindico da angiotensina III e angiotensina II inferior 13ã.= - Anticorpo anti-Ang III de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o derivado peptídico ser de fórmula; H—Arg-Val—Tyr-I le—His—Cys—NH-, (VI) na qual um encadeamento que R| designa uma ligação directa ou compreende 1 ou 2 aminoácidos naturais, R.-j representa uns agrupamento de fórmulas ~NH~(Cf-U) —CO- αΐ» j.» I ! na qual ri varia entre 1 e 9, sendo o referido derivado peptídico finado sobre uma proteína vectora. 14ã» - Anticorpo anti-Ang III de acordo com a reivindicação 133 caracteriçado por o derivado peptidico corresponder à fórmulas 1-i-Arg-Va 1 -Tyr— 11 e—His—R' ^ ~fth;;—Cs “•..•.--.Si s-w íl na Ahx designa o resíduo do ácido afnino--ó“hexanóico? s - R' ^ representa Pro ou Pro ligado a uns outro aminoàc.ido natural e apresenta uma reacçlo cruzada com a Ang ΙΪ inferior a 10 7., de preferência inferior a 5 %, 15â* - Anticorpo anti-Ang 111 de acorda com a reivindicação 145 caracterisado por ser um anti-saro de coelho e por apresentar uma reacçlo cruzada com a Ang II inferior a 1 “A. íòã .Anticorpo antipentapeptídeo <V> de oordo com a rei vindicação deo íV> e por II inferior a II., caracterizado por ser específico do pentapeptí-apresentar uma reacção cruzada com a angiotensina 10 %« 1/â. nn t i c o r pc reivindicação 16, caractsr fórmulas ;n t i. pen tapeptideo ado por Ui rle e ac do c. Diu B. o derivado peptídico ser de na uua 1 Η IX) Rj designa uma ligação directa ou um encadeamento que compreende 1 ou. 2 aminoácidos naturais. R.~ representa, um agrupamento de fórmula na qual n varia entre 1 e 9, sendo o referido derivado peptídico f.1 κ NH~ < CH^) -C0-sobre uma proteí~ na vectora. 1 Ran -- Anticorpo antipent reivindicação 17, caracterizado por ponder è. fórmulas peptídeo (V> de acordo com a o derivada peptídico corres- H-íy r ~ I Iw His-R* na quax Ah?·: designa o resíduo do ácido amino—è—heKanóico, e R'.. representa Pro ou Pro ligada a um outro aminoácido reacção cruzada com a angiotensina natural e apresenta ume. II inferior a í %, 19ã - Anticorpo anii-hexapeptícieo (IV) de acordo com a :;t.ídeo (IV), caracterizado a angiotensina II inferior reivindicação 11, específico do hexape;: pc?r apresentar uma reacção cruzada com 41 rsivindic fórmula;
2. 2- Anticorpo çâo 19 ? caractsr anti-hexapeptídeo < ϊV) de acordo com a zado por o derivado peptídico ser de H-Va 1 -Tvr-11 s—His~R„ -R^-Cys-NI-i. ÍVIII) na uuaí uma íigaçao oirscta ou um encadeamento que 1 ou. 2 aminoácidos naturais, R, designa 1 compreende I ~ Ft, representa um agrupamento de fórmula; -ΜΗ--\Cí-u)_-Cu-- ·£. £. f! na qual n varia entre í e 9, sendo o referido derivado peptídico ficado sobre uma proteína vec tora 21.®« - Anticorpo anti-hexapepiídeo (IV) de acordo com < reivindicação 115 caracterizado por o derivado peptídico corres· oonder è. fórmulas U_.ll ·, _Tw*-_r 1 „ Λ!- ·.__ i— h 1LJ ií /-=í i .· v r xi Eíí.1 => n .“Mi ifcLys rin,

   na qual h! ' , repre s&fc?n ta Pro ou Pro ligado a tui ; outro aminoácido natura1 a •S O í © ‘-Η· cd: 1 .-:-1 '-Ài?s£l í*’ rf. CZ Ç! -¾ O 'C Τ' L.\ Z 3. 'd -.¾ com a Ang II infe- rior a 1® % ? de preferência inferiar a 3 n/ 22§. - Anticorpo anti-Ang I, especifico da Ang I caracterizado por apresentar uma reacçãcj cruzada com a Ang II inferior a 10 %» 23ã. ™ Anticorpo anti-Ang I de acordo com a reivindicação 22? caracterizado por ser obtido por imunização de um animal com um derivado peptídico de fórmulas H-Cy s-R^-R-j-A rg -Va 1 ~Ty r~ 11 e-His-Pr o--Phe-H is-Leu-OH <VII) na qual ou um encadeamento que K.,. designa uma ligação direc compreende 1 ou 2 aminoácidos naturais, — R.-j representa um agrupamento de fórmulas -NH— íCH.-t) — CO— *" jÍ. Γί na qual n varia entre i s 3„ sendo o referida derivado peptídico fixada sobre uma proteína vectora. 24ãr. - Anticorpo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por o derivado peptídico corresponder á fórmulas H—Cys-AhK—R' -,-Arq-vaI-Tyr— 11 e-His-Pro-Phe—His-Leu—OH O “ Π B. Cf U B. 1 AhK designa o resíduo do ácido am i π o—π© x sn c ,x c o« e fflinoácido - R'-,· representa Asp ou Asp ligado a u/n outro a natural e apresenta uma reacçao cr usada com a Ang ΪΪ inferior a 10 de preferência inferior a 5 %. 25d. - Processo para a. dosagem da angiotensina 11, que utiliza o estojo de dosagem de acordo com a reivindicação 1, caracierizado por compreender os seguintes passoss a) preparação do meio reaccional que compreendes o extracto de líquido biológico a dosear, o anticorpo anti-Ang XI, a Ang II marcada, o anticorpo anti-Ang III, e, eventualmente, o anticorpo anti-Ang I s/ou o anticorpo antipentapeptideo e/ou o anticorpo anti-hexape-ptídeop b) preparação, simultaneamente, dos meios reaccionais úteis para a padronização, compreendendo cada um deles; um padrão de Ang II, o anticorpo anti-Ang II, a Ang II marcada. o anticorpo anfci-Ang III, 44

   - s, eventualmente, o anticorpo anti-Ang I e/ou o anticorpo antipentapeptideo e/ou d anticorpo anti-hexape-ptídso? incubação, a um,a temperatura compreendida entre 4 *C e a. temperatura ambiente, durante 12 a. 72 horas| d) separação da Ang II 1igada ao anticorpo anti-Ang II da Ang ΣΙ livre? > e) finalmente, leitura dos resultados segundo um método apropriado» 26i* - Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por os passos a) e b) serem realizados misturando! í-JiC* cã 5ô0 μΐ de extrac to de OU de·; r pad ;r& o de Ang I I, a i <1Í.W a 500 μΐ de HO X LlÇ o de Ocrí ·£· W 500 μ 1 de so1uç S o de event ;uals nen '£’£5 tt 500 anti" •Ang I £*/qU Λ J-.*—· w. 500 anti-pentapeptideo e/ou 25 a 50© μΐ da solução dt anticorpo ant.i-hexapepl.ideo, e a wv i.íi de solução de Hng II marcaoa»
3. 271. - Processo de acordo com a reivindicação 2*6, acterizado por os passos a) e h> serem realizados misturandoϊ iS a) e b) I

   ou de padrão de Ang II, a um meio que contém5 25 a 500 μΐ de solução de anticorpo anti-Ang II, 25 a 5ΘΘ μΐ de solução de anticorpo anti-Ang III, e 25 a 50Θ μΐ de solução de Ang II marcada» 28ã» - Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizada por os passos a) e b) serem realizados utilizando tubos revestidos de anticorpo anti-Ang II no qual se misturas 25 a 50Θ μΐ de extracto de líquida biológico a dossar, ou de padrão de Ang II, a u.m meio que contém? 25 a 500 μΐ de solução de anticorpo anti-Ang ΠI, 25 a 500 μΐ de solução de Ang II marcada, e o passo d) ser realizado por aspiração da solução de incubação do meio reaccional após lavagem e nova aspiração para eliminar a Ang II que não está complexada pelo anticorpo fixado sobre o su po r te sé> lido» ?ga — Processo de Suurdu L·. bJÍIÍ a reivindi t- W. Ij. L.J jilJ 4 caracterizado por o antico rpo anti-Ang II estar sob a forma de partículas, msgné ticas ou não, sobre quais esta fixado o anticorpo anti-An! 3 II. 30ã» - P r OC BSBD de acordo com a reivindi cação .zO ti caracterizado por ser utilizado para a dosagens de um extracto piasmático» 46

   31ã« - Processa para peptidico de fórmulas a preparação de um derivada H-X1 -Tyr-He-His-R, -R„-NH. i. jL. S uma Iiqaçâo directa ou encadeamento que R, desiqna í compreende 1 qu 2 aminoácidos naturais? preferencialmente, R^ rapr natural um R^ representa -Pro- ou -Pro- ligada a um outro aminoácido R„ representa um acampamento de fórmula ”NH~ÍCH„) -CD- 2 - s:~. π na. qual n varia entre 1 e 9, sendo preferencialmente n e 1 representa, uma. ligação directa, o resíduo de valina ou o resíduo do dipepiideo Arq-vai 5 caracterizado por se levar a cabo uma síntese por passos sucessivos de acoplamento a partir do C terminal, sendo esta síntese realizada, de prefertncia, em fase sólida. 32â» - Processo para. pfcípf X U Xl_Q tifcí foi' Í!iU 1 a 5 preparação de um derivado H—Cys—R^-R?—Arg-Val-Tyr—1le—His—Pro—Phe—His~Leu~OH (VII> na qual R-? designa uma ligação directa ou um encadeamento que compreende 1 ou 2 aminoácidos naturais? preferencialmente, - 47 · R, representa Asp ou Asp ligada a um outra aminoácida natural, representa um agrupamento de fórmula —NH—(CH^) -C0— na qual n varia entre 1 e 9, sendo preferencialmente n ~ 5s i. s x π tese caracterisado por se levar a cabo uma sintese por passo vos de acoplamento a partir do C terminal, sendo est realizada, de prefertncia, em fase sólida» Lisbc 3 de Julho de 1991

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