JPS582660A - 免疫学的試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 一本発明は免疫沈降反応を応用し友生体液中の成分を定
量するための改良された免疫学的試薬に関する。

生体液中の成分の特異的な定量方法の一つとして、免疫
沈降反応を応用し先方法が広く利用されておシ、例えば
単純免疫拡散法（ａＲＩＤ法）や試験管内に形成され友
免疫沈降物に、レーザー光線やタングステンラングを光
源とする光線を照射して、その散乱光強度から被検物質
を定量する試験管内沈降反応法などがある。

試験管内沈降反応による免疫沈降物Ｏ形成は、一定量の
抗体存在下で、抗原の増加とともに増加する抗体過剰域
、はとんど変化のない等貴職、および抗原の増加ととも
に減少する抗原過剰域があ本試験管内沈降反応法による
被検物質の定量において杜、抗体過剰域か抗原過剰域が
用すられる。

本発明は試験管内沈降反応法ＫＩＦｆＪな、改嵐され友
免疫学的試薬に関し、４？に抗体過剰域および抗原過剰
域の散乱光強度を増強する仁とｋよシ、被検物質をよ）
幅広い濃度範囲で定量可能ならしめたものである。

試験管内沈降反応には、反応促進剤としてよくポリエチ
レングリ；−ル（以下ｒＰＩＧＪとする）が用いられて
いるが、これは同時に検体由来の濁夛も増加させ、その
結果検体プッンク値が上昇し、検体測定値の誤差の原因
となる欠点があ）、検体希釈倍率が高く検体由来の濁〕
が問題とならない場合中、あらかじめ淘多を除去した場
合などに主Ｋｆｌ用されてきえ。

一方、検体由来０ＩＩｊを低下させるためＫ、界面活性
剤中塩化ナト雫りム、塩化カリウム等が用いられている
が、これらは免疫沈降反応によって生じ九濁９も低下さ
せる欠点がある。

本発明者らは、これらの事情に―み更に検討を重ねた結
果、ある種の軸重合体を反応液中（添加を完成した。

本発明の目的は、検体由来の濁）による検体測定値への
影響を少なくし、免疫沈降反応による沈降物の生成反応
を促進する働きを有する免疫学的試薬を提供することで
ある。

本発明は免疫沈降反応に基づく試験管内沈降反応法に用
いる免疫比濁分析用試薬においてその成分中に分子量１
万乃至５０万の水可溶性軸重合体を含むことを特徴とす
る免疫学的試薬に関する。

本発明で用いられる軸重合体は、天然または人工的に作
られ圧水可溶性の分子量１万乃ＭｓＯ万の範囲の物で、
天然の物としては植物および動物の起源の多糖であるデ
キストラン。プルラン、！クールヒドリν等の重合促進
剤を用いて重合させて合成、した物が好適な例として挙
げられる。

これら軸重合体は市販の物を用いる仁とができ、□例え
ばデキストラン？　７　Ｇ　（Ｄ＠ｘｔｒａｎ　Ｔ　７
０　＃分子量７万、７アル！シア社製）、フィコール７
゜（Ｆｌｃ＠１１７　＠　、分子量７万、ファルマシア
社ＩＩ）、７４　：ｙ−ル４００　（Ｐｉｓｔｉｌ　４
００　、分子量４ｏ万。

ファルマシア社Ｓｔ）等がある。

本発明の試薬は後述０実験例に示す如く、例えば塩化す
Ｆリウム、アジ化ナトリウム、緩衝剤。

ＰＩＧ、軸重合体等を所定の成分含量Ｋ”−＆るよう水
に溶解する仁とＫよりて調製するが、通常軸重合体ａｌ
乃至１ＯＮ（”’／、ｙ）好ｔＬ＜は２乃至５Ｎ（”／
ｗ　）含有する。

を大、本発明の試薬中ＫＰＢＧと軸重合体が共に含有さ
れろ場合は、Ｐ　Ｉ　Ｇ　１重量部に対し軸重合体はｌ
乃至５重量部ぐらいを用いるのが適当である。

本発明Ｏ試薬中に會まれる軸重合体は、後述の１！Ｊ１
例１に明示する如く検体由来の淘夛を低下させる働きを
有する。まえ、実験例１ＫＩＮ示する如く、免疫沈降反
応に基づく沈降物による飯に光強度を増強させる働きを
有する。★九ＰＩＧと軸重合体を合わせて用いた場合は
、軸重合体を用いなかりた場合に比較し、更に高い飯乱
光強度を示した（実験例３．実験例４）、このことは筒
型合体を含有する本発明の試薬が前述した痩応促−刻と
して公知のＰＩＧとは別の働きによりて、更に該散１光
強度を増強させていることを示すものである。

上述の如く成分中に軸重合体を含む本発明の試薬は、検
体由来の濁夛を低下させると同時に試験管内沈降反応に
おける免疫沈降物の生成釡促進させ、これによって散乱
光強度が増強さ□れ本こと□から、試験管内沈降反応−
により被験物質Ｏ定量において、低濃度から高濃度まで
のよ）幅広いＳ度範囲での定量を可能とし、轡に１禮診
断上重要な被検物質の低濃度領域におａてｉ、従来の試
薬に比較し、更に低濃駿迄の定量を可能としえ、ま九□
、〇−反応性蛋白、礪−７エトプロティン、フィブリン
分郷物等の如き真中の極微量物質を定量する場合は、検
体の希釈倍率が低いために生じる検体由来Ｏ濁）を除去
するといり九予備操作を行なゎ□ ずして、低濃度の被検物質を定量することができる。

次に実験例に上うて本発明を説明する。

実験９４ｘ　　フィコ□−ル（Ｆｉｃ＠ｌｌ＋　７アル
マシア社製の蔗糖とエビタはルヒドリンから作られ先着
重合体の商品名、以下同じ）の廁清由来あ濁夛に対する
効果の検討。

〈検体Ｏ調製〉 検体Ｍ＆１乃膚γの人血清をそれぞれ検体希釈液〔塩化
ナトリク＾ａ９Ｆ、アジ化ナトリウムへＯ５Ｆ、ニラコ
ール〒Ｌ−１０（日光ケミカルズ株式会社製非イオ□ン
性界爾活性剤）（ＬＯ５Ｆを精製水に溶解し、全量をＺ
Ｇｏ−とし喪、〕で５倍に希釈し、α１ＩＩｊずつ２零
〇＊ＪＬペツ）Ｋ分注し検体とした。

く免疫学的試薬の調製〉 （１）対照試薬の調製 塩化ナトリウムα４ｔ、ＰＩＧ（分子量６０００）　Ｌ
５　？　、アジ化ナトリウム０．０５　ｆ　、　Ｎ　−
２−とドロキシエチルビベツジン−Ｎ′−２−エタンス
ルホン酸（ジグｉケ電カル社製緩衝剤、以下ｒＨ１！Ｐ
Ｉ８Ｊという）ｏ、２８８Ｆを精製水９０−に溶解し、
１規定水酸化す）９りムで−を７．４に調整した後、更
に精製水を加えて全量を１００−とじ九。

（２）本発明の試薬の調製 上記対照試薬の成分Ｋｌ！にフィコール７Ｇ（分子量７
万）３ｆを加え、以下（１）と同様にして調製した。

〈散乱光強度の測定〉 上記の如くして調製し九検体Ｐｈｌ乃至７迄Ｏ検体を２
本ずつ用意し、一方には対照試薬ａ４−と抗血清希釈液
（アジ化す）ｌラムをａｏｓｘ含むα９Ｘ塩化ナトリウ
ム水溶液）ａｌｓｓ＃を、他方には本発明の試薬（Ｌ４
ｄと前記抗血清希釈液αｌ−（トデｌＴ、日本分光工業
株式会社製レーザーネ７工四メーター、以下同じ）のＬ
Ａ−ＬＬ８チャンネル、感度３倍で測定し友、この結果
を次表に示す。

表−１から明らかな如く、本発明の試薬はｐｇＧの共存
下においても血清由来の濁りを抑制する効果が認められ
丸。

実験例２　画情中のハブトゲ−ビン定量における本発明
試薬の効果の検討。

〈検体の調製〉 ２５１Ｐ／ｄｌ、５０”Ｐ／＃、１００１ｑ／１１．３
０て、それぞれ１００倍に希釈し、Ｏｌｇｊずつ２本の
キエペッ）Ｋ分注し検体とした。

〈免疫学的試薬の調製〉 （１）対照試薬の調製 塩化ナトリウム０．４Ｆ、アジ化ナトリウムＱ、０５１
、ＨＮＰＢ８０．２３２ｆを精製水９０ｍＫ溶解し、次
いで１規定水酸化ナト呼ウムで−を７．４に調整した後
、更に精製水を加えて全量を１０　Ｇ１１１とした。

（２）本発明の試薬の！１ｉｌＩ！ 上記対照試薬の成分に更にフィコール７０（分子量７万
）３１を加え、以下上記（１）と同様にして調製した。

〈抗血清液の調製〉 倍に希釈した。

〈散乱光強度の測定〉 上記の如くして調製した各濃度の検体を各々２本ずつ用
意し、一方には対照試薬０４ａ＃とハブトゲルピン抗血
清液０．１ｄを、他方には本発明の試薬α４ｍと該ハブ
トゲルピン抗血清液０．１−を加Ｏ分間反応させた６次
いで それぞれの散乱光強度をアイピッ）（ｉ−ＰｉＴ；レー
ザーネフェ胃メーター）のＬＡ−ＬＬ８チャンネル、感
度３倍で測定した。この結果を第１ＷＪに示した。

第１図に示す如く、免疫沈降反応の反応系に積重合体（
本実算例ではフィコール７ｏを用い九）を含有する本発
明の試薬を加え九場合、当該反応に基づく免疫沈降物に
よる散乱光強度に増加がみられ、よ）低濃廖０抗原を試
験管内沈降反応法によって定量できえ。

実験例３　血清中の〇−反応性蛋白（０露Ｐ）定量にお
ける本発明試薬の効果の検討。

〈検体の調製〉 ０．５１１Ｆ＃１　、　ＩＩＩＰ／Ｊ　、　２１１９／
＃　、　４４７１゜８１１Ｆ／ｄＩｌの各濃度のＣ−反
応性蛋白溶液（血清）を実験例１と同様の検体希釈液を
用りてそれぞれ５倍に希釈し、０．１−ずつ２本のキ轟
ペットに分注し検体とした。

〈免疫学的試薬の調製〉 （１）対照試薬の調製 実験例１と同様にして調製した。

（２）本発明の試薬の調製 実験例１と同様にして１ＩＩｉｌ＃！シ丸、　−く抗血
清液の調製〉 ＯＲＰ抗血清（医学生物学研究所ｍ＞を実験例１と同様
の抗血清希釈液で２０倍に希釈しえ。

〈散乱光強度の測定〉 上記の如くして調製し九各濃度のＯＲＦを會６機体を各
々２本ずつ用意し、それらの一方には対照試薬０．４−
とＯＲＰ抗烏清液１１Ｌ１ｙｄを、他方には本発明の試
薬０．４ｍとＯＲＦ枕血清液α１ｍをそれぞれ加え、室
温で３０分間反応させた０次いでアイビット（１−ＰＩ
Ｔニレ−ず−ネフエロメーター）のＬＡ−ＬＬ８チャン
ネル、感度３倍で散乱光強度を測定した。その結果を第
２図に示し九。

＠２図から明らｂな如ぐ、本発明の試薬を用い九場合、
ＯＲＰ濃度の低い所（抗原過剰域）で散乱光強度の増加
がみられ、反応促進剤としてＰＲ明の試薬は、更に低濃
度の抗原の定量が可能でありた。

実験例４ｆｉｌ清中Ｏトツンス７！リン定量における本
発明試薬の効果０検討 く検体の調製〉 ２５ＩＩＰ／ｄｌ、５１１２／Ｊ、１００１１Ｆ／＃、
３０ｏｗｑ／ｍ、５ｏｏ７ＩＦ／ａｏ各濃度のトランス
７ヱ、瞼 リン溶液（血清）を夷溝例１と同様の検体希釈液を用い
てそれぞれ１００倍に希釈し、Ｏ，ｌ＋ｗｊずつ２本の
キ凰ベートに分注し検体としえ。

〈免疫学的試薬の調製〉 （２）本発明の試薬の調製 実験例１と同様にして調製した。

〈抗血清液の調製〉 トランスフェリン抗血清（カールシ凰タクト社１１）を
実験例１と同様の抗血清希釈液で２５倍に希釈した。

〈散乱光強度の測定〉 上記の如くして調製した各濃度のトランスフェリンを含
む検体を各々２本ずつ用意し、それらの一方には対照試
薬０．４　ｄとトランスフェリン抗血清液０．１−を、
他方には本発明の試ＩＸα４ｄとトランスフェリン抗血
清液Ｑ、ｌｄをそれぞれ加え九後、室温で６０分間反応
さぜた０次いでアイピッ）　（１−ＰｊＴ　；レーザー
ネ７！四メーター）のＬＡ−ＬＬＳチャンネル、感度３
倍で散乱光強度を測定し丸、その結果を第３図に示した
。

第３図から明らかな如く、トランスフェリンの低一度域
例えばトランスフェリン慢賓が５０１１９／１では対照
試薬を用いたときのアイビット（１−ＰｉＴ；レーず一
ネ７翼四メーター）測定による散乱光強度は０（零）で
あ−）九が、本発明の試薬（フィコール７０を３９ｇ　
（”’／ｖ）含有する）を用い虎場合の散乱光強度は１
１０であ夛、大幅な散乱光強例ではフィコール７０を用
い友）を含む本発明の試薬は、更に低濃度の抗原の定量
が可能であった実験例５ 実験例３と同様にして、積重合体としてフィコール７０
（分子量７万）、フィコノル４００（分子量４０万）、
デキスト？ンＴ７０（分子量７万）〔いづれもファルマ
シア社製〕を用いた３Ｎ類の本発明の試薬（各々３％（
”／Ｗ）の積重合体を含む）を、ｇｌｍｌｌし、それら
を用＾て散乱光強度を測定した。その結果を表−２に示
した。

表−２ む本発明の試薬は、いずれも抗体過嘴域にシ込て免疫沈
降反応に基づく散乱光強度を増加させてい

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の試薬と対照試薬を用いて検体（血清）
中のハプトグロビンを定量した際の各濃度における試験
管内沈降反応法による散乱光強度を示す、叶→は本発明
の試薬を用いた場合、←→は対照試薬を用い九場合であ
る。同様に第２図は〇−反応性蛋白、第３図はトランス
７スリンを定量し圧線の各濃度における散乱光強度を示
す。 出願人　　中外製薬株式会社 第　１　図 ハフ・ドア０ピン１１度　　　　　　（”’／ｄｉ）。 −ｍ−−０本脅鴫弓のシく嘴ｊ（フィコ−し７０；　３
に（プロ）１唯ｉ）、−４対叩訳薇 菓　２　図 ←−一　対照訓藁

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 免疫沈降反応に基づく試験管内沈降反応法に用する免疫
   比濁分析用試薬にお−て、その成分中に分子量１万乃至
   ５０万Ｏ水可溶性糖重合体を含むことを特徴とする免疫
   学的試薬。