JPS63150669A - ヒアルロン酸の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒアルロン酸は、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロ
ン酸を交互の単位とする直鎖の分岐のない鎖状多糖類か
ら成る構造の多糖類である。

ヒアルロン酸はいろいろの種類の生物学的物質内に遍在
し、細菌類や動物（を椎動物ならびに無を椎動物の両方
を含む）から採取できる。ヒトではヒアルロン酸は例え
ば屓帯、眼のガラス体液、軟骨、滑液の中に高濃度に存
在する。小量のヒアルロン酸が特に髄液、リン・ソ嵐尿
、血清中に証明されている。血液、血清、血漿中の濃度
は極めて低いが加齢、関節リウマチ、多くの肝疾患（肝
硬変）になるに伴なって高濃度を示す。後者の場合には
正常人の場合の２５倍になることが示されている。参考
文献としてＡ。

Ｅｎｇｓｔｒｏｅｍ　−Ｌａｕｒｅｎも氏の学位論文Ｔ
ｈｅｓｉｓ　１９８５　＋Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ
　Ｉｎもｅｒｎａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　、　Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉちｙＨｏｓｐｉもａｌ　、　ａｎｄ　Ｄｅｐａ
ｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　ａｎｄＰｈｙｓ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　、　ＢＭＣ
，Ｕｐｐｓａｌａ　ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　。

８ｗｅｄｅｎを参照されたい。

低濃度のヒアルロン酸の測定には種々の方法が用いうろ
ことが知られ、また種々の方法が提案もされている。ヒ
アルロン酸に対する抗体を用いる免疫学的方法を利用す
ることは困難なものと考えられていた。これはまず第一
にヒアルロン酸が本質的に非免疫原性（すなわちその生
物学的な遍在性による）であるためである。生体特異的
な親和性により選択的にヒアルロン酸に結合しうる蛋白
質が発見されたことによ２てはじめて低濃度のヒアルロ
ン酸の測定が大きく進歩した。今日（で至るまでその両
者が軟骨に由来するものである蛋白性グリカン（ｐｒｏ
　ｔｅｏｇＬｙｃａｎ）および／またはいわゆる連結蛋
白（ｌｉｎｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、または価山来のヒア
ルロン酸自身がヒアルロン酸に対する抗体の代替物とし
て用いられた。軟骨由来の蛋白性グリカンと連結蛋白は
ヒアルロン酸に対する結合部位を一ケしかもたないと考
えられているが、一方、ヒアルロン酸自身はその多くの
反復構造による複数の結合部位をもつと考えられている
。更に軟骨由来の蛋白性グリカンと連結蛋白は互いに結
合することができると信じられている。ヒアルロン酸を
結合する構造をもつ蛋白グリカンの部分は通常、ｒ　Ｈ
ＡＥ３ｒ　Ｊと称される。この用語ｒＨＡＢｒＪはこれ
以後、（ことわりがなければ）軟骨由来の蛋白性グリカ
ンそのもの、またはヒアルロン酸と結合する構造を形成
する軟骨由来の蛋白性グリカンのフラグメントに対して
用いることにする。

軟骨由来の蛋白質を利用した最初のヒアルロン酸定量法
ではμを単位のヒアルロン酸の測定が可能であった。そ
の方法は以下の現象に基づいていた。もし、前もって測
定された量の蛋白性グリカンとヒアルロン酸とを混合し
た両者の反応混合物をｒルクロマトグラフィーにかける
と、蛋白性グリカンと反応させるヒアルロン酸量な増加
させるに従ってカラムを素通りする流出液中のヒアルロ
ン酸に関連する量（ウロン酸として測定）が直線的に増
加することが認められる。

参考文献としてＥ（ａｒｄｉｎｇｈａｍ氏らによるｉ−
井−＝二北；亭＃共Ｂｉｏｃｈｓｍ　Ｊ　１５９　（１
９７３）ｐ、　１４３〜１４７を参照されたい。その後
公表されたもう一つの方法の場合ではｎ２単位程度にま
で到達が可能となった。この方法は不溶性相（いわゆる
固定相）に結合させたヒアルロン酸を用いて試料中に存
在するヒアルロン酸と以下のものすなわち、ＨＡＢｒを
有する蛋白性グリカンのヨウ素標識フラグメント、 ヨウ素標識した連結蛋白、 ヨウ素標識した反応混合物、 または非標識ヒアルロネクチン（ついで標識抗体で標識
する） とを（反応させて）拮抗させること（阻害を受けさせる
こと）で達成された。固定相に結合させる標識反応物量
が適切に選択される場合にはこの反応物量から試料中の
ヒアルロン酸量が示される。参考文献としてＤｅｌｐｅ
ｃｈ氏らによるＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ　１４９（１９
８５）　ｐ、　５５５〜６５、Ｅｎｇｓｔ＋ｒｏｅｍ　
−Ｌａｕｒｅｎｔ氏らによる５ｃａｎｄ　Ｊ、　Ｃ１１
ｎ　Ｌａｂ　Ｉｎｖｅｓｔ　４５（１９８５）　ｐ、　
４９７〜５０７、　Ｌａｕｒｅｎｔ氏によるＥｘｐ　Ｅ
ｙｅｓＲｓｓ　３３　（１９８１）ｐ−１４７〜５５、
Ｌａｕｒｅｎｔ氏らによるＡｎａｌ−Ｂｉｏｃｈｅｍ　
１０９（１９８０）　１）、３Ｂ＋Ｓ　〜９４、Ｔａｎ
ｇ　ｂｌａｄ氏によるＴｈｅｓｉｓ　１９８１　、Ｄｅ
ｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　ａｎｄＰｈ
ｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓ−ｔｒｙ、　Ｂ
ＭＣ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆＵｐｐｓａｌａ　、
　Ｓｗｅｄｅｎ　％Ｔｅｎｇｂｌａｄ氏によるＢｉｏｃ
ｈｅｍ　Ｊ　１９９（１９８１）　ｐ−２９７〜３０５
　、Ｔｅｎｇｂｌａｄ氏によるＢｉｏｃｈｅｍＪ　１８
５（１９８０）　ｐ、　１ｏ１〜５、およびＬａｃｙ氏
らによるＡｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　１５Ｂ　（１９８
３）　ｐ−４３６〜４２、を参照されたい。

ヒアルロン酸はまたヒアルロネクチンの使用によって免
疫組織化学的に検出されている。参考文献としてＧｉｒ
ａｒｄ氏らによるＪ　、　ＨｉｓｔｏｃｈｅｍＣｙｔｏ
ｃｈｅｍ　３４（１９ｓｇｐ、　５３９〜４１、を参照
されたい。

ＨＡＢ　ｒの抗原としての構造がヒアルロン酸との結合
によって変化する事実をかんがみて、Ｔｈｏｎａｒ氏ら
はこの現象をｎ？のレベルでヒアルロン酸の測定に利用
することを提案した。参考文献としてＴｂｏｎａｒ氏ら
によるＪ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２５７（１９８２）　
Ｔ）ｐＨ１４１７３〜１４１８０を参照されたい。

彼らの系は複数の反応物例えば二つの形態のＨＡＢｒ　
（溶解形態と固定相への結合形態）とＨＡＢｒの決定基
に対する抗体を用いることに基づいており、このＨＡＢ
ｒ決定基の露出がＨＡＢ　ｒにヒアルロン酸が結合する
かしないかに依存する。Ｐｏｏｌｅ氏らは独占的に分解
する酵素の助けをかりてヒアルロン酸を分解し、得られ
たフラグメントを免疫学的に定量する方法を提案した。

参考文献としてＰｏｏｌｅ氏らによるＪ　Ｂｉｏｌ　Ｃ
ｈｅｍ　２６０（１９８５）Ｔ）。

６０２０〜２５を参照されたい。

このようにして極めて低い導度のヒアルロン酸の定量に
用いうる多数の方法が存在する。同時に例えば血漿、リ
ンパ液、血清、尿中のヒアルロン酸についてナノグラム
のレベルで測定しようとする臨床上の興味は潜在的には
極めて高いものがある。このような状況にもかかわらず
、現在までのところ、商業的に利用可能な方法は存在し
ない。この主な理由はその方法の水準に関しての要求が
単なる一研究所のほんの小さな集団の人間によって用い
られた試験法の場合より高いためである。本特許出願人
はヒアルロン酸の市販用の試験法の開発に長年にわたり
、努力してきた。これらの努力を重ねる間に、ヒアルロ
ン酸と結合する蛋白質とヒアルロン酸との反応がこの領
域での科学的出版物から得られる事実より、かなり繊細
なものであることが判明した。全く驚くべきことに我々
は以下のことを見出した。

（１）　　同一のパッチの推奨されたＨＡＢｒと連結蛋
白のヨーｒで標識した混合物がある一つの試料に全く異
なった全く納得のいかない測定結果を与える。

（２）　　ＨＡＢｒとヒアルロン酸との間の反応が以前
の研究から推論しうるものより、−変化に対し、かなり
鋭敏である。

（３）　　温度への依存性があり、一定の値を越える温
度は避けるべきである。

本発明は水分を含有する生物学的な試料中のヒアルロン
酸測定に関し、既知の方法に固有の困難さを十分に留意
したものである。当該の先行の手法は全ていわゆる阻害
法であり、これらは以下の方法に基づいている。ヒアル
ロン酸構造をもつ少なくとも１つの反応物（ｒｅａｃ　
ｔａｎｔ）　（反応物（１）＝ヒアルロン酸の誘導物＝
ヒアルロン酸類縁体）とヒアルロン酸と結合する構造を
もつ第２の反応物（反応物（２））とを互に反応させ、
反応物（１）と反応物（２）とを互の生体特異性親和力
に基づき結合させて複合体を形成させる。

本発明の特徴的とするところは、 （１）　　用いた反応物（２）は軟骨由来の蛋白性グリ
カン（＝　ＨＡＢｒ　）に存在するヒアルロン酸と結合
する構造を有する反応物であり、 （ｉｉ）　　反応物（１）と（２）との互の反応は、（
ａ）５．５から１４までの一範囲（なおこの声は系外が
ら加えた緩衝剤成分（緩衝系の酸−塩基対）によって得
られるもので、反応混合物中の総濃度が）０．０４Ｍで
ある上記した声範凹円において緩衝能力を有するものと
する）および、（ｂｌ＋。

℃から２７℃までの範囲の温度において行なわれるとこ
ろにある。

本発明は特に血清試料の測定に適用される。

「系外より加える緩衝剤成分」という用語はその起源と
するものから試料が持ちこんだアルカリおよび／または
酸成分を中和するために加える成分を意味する。通常、
それらはそのｐＫａ値が５．０から７９までの範囲内に
ある酸−塩基対である。

阻害法の方法論は当該領域での熟練者には広く知られた
ものである。本発明によって使用される方法論と本質的
に同じものが免疫化学的な定量法の分野でも使用される
。従って、当該ヒアルロン酸測定法に関して現在明確に
なっている困難さを熟知している当該領域での熟練者に
とっては本発明を適用すべく、阻害系を構築することは
容易な作業である。本発明の場合、ヒアルロン酸（分析
対象物）は蛋白質上のヒアルロン酸と結合する構造に対
してヒアルロン酸と競合させられる。反応物（１）と（
２）の量は両者による複合体量と複合しなかった反応物
（１）または（２）が試料中のヒアルロン酸量のものさ
しに常になるように選択される。本発明で用いられる特
徴点は兎も角にも分析的に検出可能な基をもった少なく
とも１つの反応物を備えている点にある。

この反応物は必ずしもそうである必要はないが反応物（
１）であってもまたは反応物（２）であってもよい。或
いはまたこれに代わるものとしていわゆる標識抗体ある
いは標識抗−抗体を使用する検出系がある。この例とし
ては抗ヒアルロネクチン抗体を用いるＤｅＬｐｅｃｈ氏
らによるＡｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ１４９（１９８５）
ｐ、　５５５〜６５を参照されたい。

本発明の最も望ましい実施態様に従えば、試料は反応物
（１）を加える前に反応物（２）と前もってインキュベ
ートされる。

意図される方法は採用する標識系によって分類されうる
（すなわち、分析的に検出可能な基の型に基づく分類に
よる）。かくして酵素、螢光、化学発光、酵素−基質、
同位元素等の標識法がある。ある標識の場合にはその標
識が結合した反応物が、生体特異性をもつ、もう一方の
反応物と結合、すなわち複合体にとりこまれる場合に標
識の活性がかなり変化する。反応混合物中の標識の活性
は形成された複合体量の関数となり、分析対象物（本発
明の場合、ヒアルロン酸）の量と直接に関連しうる。前
もって、複合体とこれにとりこまれなかった標識反応物
を物理的に分離することなく標識の活性が反応混合物中
で直接測定される場合の測定法は通常「均−Ｊ　（ｈｏ
ｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）であると呼ばれる。この「均一」
法は分離が行なわれる「不均−Ｊ　（ｈｅ　ｂｅｒｏｇ
ｅｎｅｏｕｓ法とは対称的である。このようにして分類
はまた方法が均一か不均一かに基づくものでもありうる
。

不均一法には第一段階での均−相下の複合体形成と、つ
いで第二段階での適当な沈殿剤による複合体の沈殿形成
を含むいろいろな、いわゆる沈殿手法がある。この沈殿
剤は複合体にとりこまれた、ある非標識反応物に対する
沈殿性の不溶化されたまたは不溶化されうる抗体から成
るものでありうる。代替的にこの試薬は非免疫学的性質
のものであ２てもよい。他のタイプの不均一法では分析
対象物および分析対象物の類縁体に共通したエピトープ
に結合可能な分析対象物の類縁体又は生体特異性をもつ
もう一方の反応物のどちらかが固定相に結合せしめられ
る。

反応物　（１） ）　　　ＨＡＢｒと結合するヒアルロン酸フラグメント
は少なくとも１０ケの単糖類単位から成らねばならぬこ
とは先行する文献によってよく知られている。それ故に
、本特許出願と特許請求の範囲においては「ヒアルロン
酸構造」と用語は反応物（１）において少なくとも１０
ケの単糖類単位、望ましくは約２０ケよりも多い単糖類
単位のヒアルロン酸７ラグメントであるべきことを意味
する。反応物（１）はヒアルロン酸誘導体（ヒアルロン
酸類縁体）であってトリチウム化されるかまたはＣ１４
で標識されるか、または意図された反応媒体中で溶解し
ない高分子に共有結合、イオン結合又は生体特異的に結
合されたものでありうる。殊に種々の親和性を用いる関
連性において、特にヒアルロン酸の還元末端又はそのカ
ルボキシル基がアミノ基を有する吸着剤との共有結合に
よる結合のために用いられる。参考文献としてＴｅｎｇ
ｂｌａｄ氏によるＢｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａ
ｃｔａ５７８（１９７９）１）、　２８１〜９を参照さ
れたい。

これらの結合方法は本発明でも有利に用いうる。しかし
、我々は充分確立した手技であるブロムシアン法を使用
するのが最良の方法であることを見出した。参考文献と
してＡｘｏｎ氏らによるＵＳ−Ａ−３，６４５、８５２
およびＫｏｈｎ氏らによるＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙ
ｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ　ｉ　０７（１９８２）ｐ、
８７８〜を参照されたい。

反応物　（２） 本発明に好適するＨＡＢｒは連結蛋白を含んではならな
いものとし、そして公知の方法でｖ４製しうるものであ
る。参考文献としてＴｅｎｇｂｌａｄ氏によるＢｉｏｃ
ｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ　５７８（１９７９
）　ｐ、　２８１〜９を参照されたい。

現在迄に知られているところにかんがみて先行する方法
のようにコンドロイチンとケラチン硫酸に富んだ蛋白性
ベプタイドセグメントをトリプシン消化によるか、又は
他の適当な酵素の助けをかりて、除去し、ヒアルロン酸
と結合する構造には変化を与えることなく得られた軟骨
由来の蛋白性グリカンを用いることが最も望まシイ。こ
のことは場合によってコンドロイチンとケラチン硫酸鎖
とをそこから除去した損傷をうけていない蛋白性グリカ
ンの単量体をまた使用する可能性を排除するものではな
い。ＨＡＢｒは蛋白質の場合に普通に用いられる方法に
よって誘導体に導かれる。このようにして、ＨＡＢ　ｒ
　ハ反応媒体中に溶解しない相に吸着されうるか、共有
結合で結合されうるか、あるいはＨＡＢｒは多くの異な
った分析的に検出可能な基（標識）のどれかと結合しう
る。蛋白性グリカンの標識には連結蛋白が存在しない精
製した蛋白質に標識するのが有利である。

他の親和性反応物 いくつかの意図される阻害法の場合には反応物（１）も
また反応物（■も分析的に検出可能な基をもたないこと
がある。このような場合、複合体又は、複合体を形成し
ない、非標識の反応物は適当な反応体に対して向けられ
る抗体によって定量される。このようにしてもしも反応
物（２）が標識されておらずそして可溶性の場合には反
応物（２）に対する抗体を用いることができる。適切な
抗体の選択と調製は一般の抗体の場合と共通のやり方で
、すなわち反応体（２）つまりＥ（ＡＢｒに存在する抗
原構造からな−る免疫源を利用して行なう。

一依存性 我々はヒアルロン酸構造とＨＡＢｒとの間の反応は声が
５．８から７３の間で最も−の影響を受けないことを発
見した。生物由来の水分を含有する試料の場合、声がか
なり変動することをかんがみて系外から加える緩衝剤の
必要性は高い。この緩衝剤は充分な緩衝容量をもち、本
質的に意図されるどのようなタイプの試料でも、例えば
、尿、血液、血漿、血清の試料でも−４を５８から７３
の範囲にする緩衝効果を備えていなければならない。こ
れまでに血清試料に対しているいろ試みた緩衝剤の系で
唯一、真に良好なものば声を５．８から７３の範囲に設
定するＨ２ＰＯ４−／　ＨＰＯ４２−である。この−値
はＨ２ＰＯ４−のｐＫａより低く、添加される緩衝剤成
分の全濃度は例としてリン酸塩で例えば）０．０６Ｍま
たは〉０１１Ｍのような＞０．０４Ｍの濃度を有するも
のである。もちろん、このことは、この濃度域で先述の
範囲に緩衝効果を発揮する他の緩衝剤の系の使用の可能
性を排除するものでない。例えば酸性の試料の場合には
Ｈ２ＰＯａ−のｐＫａより少し上の…に設定したＨ２Ｐ
Ｏ４−ＡＰ０４２−系を使用することが望しいかもしれ
ない。全てのタイプの使用する添加物は希望する反応を
本質的に妨害するものであってはならないことは言うま
でもないことである。

温　　度 ＨＡＢｒとヒアルロン酸構造物との間の反応には非常に
温度依存性があるので２７℃以上では遂行してはならな
い。実際上の下限は千０℃である。望ましい範囲は＋４
℃から＋２５℃まで、例えば＋４℃から＋２２℃までで
ある。

本発明はまた先に説明したようなヒアルロン酸測定のた
め使用する試薬キットも包含しており、これには、ヒア
ルロン酸誘導体（反応物（１））、ヒアルロン酸と結合
する構造を有する軟骨由来の蛋白性グリカンである第２
の反応物（反応物（２）、５ＡＢｒ）、および反応物（
１）と反応物（２）と意図する試料とを定量のため混合
して得られる反応混合物に緩衝効果が発現できるような
緩衝剤の系が含まれる。この試薬キットにおいて反応物
（１）と（２）は別々の容器に入れられる。個々の成分
について詳しい説明は前述部分を参照のこと。

本発明はさらに本明細書に付属する請求範囲で定義され
るが、以下に実施例の形で例示される。

試薬 （百分率はことわり書きがなければｗ／ｖで示す）。カ
ーソン■は米国、フィラデルフィアのＲｏｈｍ　＆　Ｈ
ａａｓ社に製造される抗菌物質である。ヒアルロン酸（
以下ＨＡ）はスエーデン国、ウプサラのファルマシアＡ
Ｂ社製のヒーロン■を使用。

ＢＡＡはウシ血清アルブミンを示す。セファクリル■Ｓ
−２００はスエーデン国、ウプサラのファルマシアＡＢ
社製のゲルクロマトグラフィー用の充填剤の略称である
。ツイーン■はスイス国、チューリッヒのへフテイ社の
界面活性剤である。

標］１２＋質：ヒアルロン酸、ヒーロン■を０．０５Ｍ
、ｐＨ７，４のリン酸緩衝液（６％ＢＳＡ、０．１チツ
イーン■２０．０．１５％カーソン■とｏ、　９　Ｔｏ
　ＮａＣ１を含有）で稀釈しｉ、ｏｏｏ、５００．２０
０．７５．２５．１０μｆ／ｌの濃度のものを調製。上
述の緩衝液をゼロスタンダーＰとして使用する。ＨＡ−
アガロースニア０〜７５叩のヒアルロン酸（ヒーロン■
）ヲファルマシアＡＢ社製の粒子サイ−ｅ５μ倶以下の
１０２のアガロース粒子に共有結合させる。結合にあた
つ【はＡｘ：３ｎ氏らの方法をＫｏｈｎ氏らが変更・修
正したものに従って−１０〜１０．５でブロムシアン法
を使用した。参考文献としてＡｘｄｎＲ。

（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ　ＡＢ　）らによるＵＳ−Ａ−
３，６４５，８５２Ｋｏｈｎ　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒａ８Ｃｏｍｍｕｎ　１
０７（１９８２）ｐ、　８７８〜を参照されたい。

軟骨由来の蛋白性グリカン：ヒアルロン酸の結合フラグ
メント（ＲＡＢｒフラグメント）、連結蛋白およびこれ
らの混合物はＴｅｎｇｂｌａｄ氏が報告したように調製
した。参考文献として、Ｂｉｏｃｈａｍ　Ｊ　１９９（
１９８１）　ｐ、２９７〜３０５Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ　
１８５（１９８０）　ｐ−１０１〜５Ｂｉｏｃｈｅｍ　
Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ　５７８（１９７９）　ｐ、
　２８１〜９を参照されたい。

蛋白質のヨーＰ化はＴｅｎｇｂｌａｄ氏が報告したよう
に実施した。参考文献としてＴｅｎｇｂｌａｄ　Ａ　Ｖ
ＣよるＢｉｏｃｈｅｍ　Ｊ　１９９（１９８１）　ｐ・
２９７〜３０５、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ１８５（１９８０
）　ｐ−１ｃＮ〜５を参照されたい。

試験法変法 変法（１）（標識物質に関する先行技法）１００μｌの
標準物質／試料、１００μｌのアガロースに結合させた
ＨＡ（０，０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中に０．４μ
ｌデル／　ｍｅの濃度。このｐＨ７，０の緩衝液は１．
６５　Ｍ　ＮａＣ１、”ＩＢ！９Ａ、０４１俤ツイーン
■２０．０．１５％カーソン■を含有する）およびクロ
ラミンＴでヨーｒ化したＨＡＢｒフラグメントと連結蛋
白の混合物を前記した緩衝液に４５　％　ＢＳＡが加わ
ったものに溶解・稀釈して３０μμとしたもののうちの
２５μ４をと９６者金工を混合し、％如ことわらなけれ
ば３時間、室温（１８〜２５℃）にてインキュベートす
る。その後０．９チＮａＣ１，０，０７％ツイーン■の
２，５コで３回洗浄する。

変法（２）（発明） １００ＡＡ！の標準物質／試料とクロラミンＴにてヨー
ｔ？化した純粋ｉ　ＨＡＢｒを０．１Ｍ１Ｐ８６．１の
リン酸ナトリウム緩衝液（１ｅＡＢｓＡ、　０．１％ツ
イ■ 一ン　２０、α１５チカーソン■を含有）に溶解稀釈し
て１５μμとしたものから２００μ！をとり、両者混合
し、特にことわら危ければ、６０分間室温（１８〜２０
℃）にてインキュベートする。

ついで、アガロース粒子（上記の緩衝液に０，６μｌ）
ｆル／ｌの濃度）に結合させた１００μｌのＨＡ１００
μｌを添加し、得られた混合物を特にことわらなければ
、４５分間、室温（１８〜２０℃）にてインキュベート
する。０．９チＮａＣ２，０，０７チツイーン■２０の
２　ＷＬｌで２回洗浄する。

実施例　１ ＨＡＥｒフラグメントと連結蛋白の単一混合物を別個に
ヨード化する。２種類の血清を使用し、変法（１）にて
、上記ヨード化物と数回の試験を行逢った。

結　果： 第１表Ａ ヨード化（１）　　　ヨード化（２） 平均濃度　５０μ？Ａ１９μμ 血　　清１ 定量値の変動率　　３４チ　　　　３２チ平均濃度　１
２１　ｔｔｔ／ｌ　　７　Ｂ　μｔ／１血　清２ 定量値の変動率　　２６％　　　　１７チ純化したＦＬ
Ｉｌｊ３ｒを別個にヨード化する。２種類の血清を使用
し、変法（２）に従って数回試験を行なった。

結　果： 第１表Ｂ 平均濃度　３８　μｔ／ｌ　　３８　μ？／ｌ血　　清
１ 平均濃度　１１２μ？／ｌ　　１０４μｆ／１血　清２ 定量値の変動率　　９．３チ　　　　４０％実施例　２ Ｈ７＋１Ｂｒフラグメントと連結蛋白の混合物をヨード
化しついで、セファクリル＠Ｓ−２００で分離した。多
くの血清試料についてヨーｌ−化ＨＡＢｒフラグメント
をトレーサーとして使用した定量とヨード化連結蛋白を
トレーサーとして使用した定量とを実施した。変法（１
）に従い、両方の定量を並行して同じ標準物質とアガロ
ース結合ＨＡ（０，２μｌ／ｒｄ）を使用して行った。

結　　果： 第２表　　　　　　　濃度　μｔ／Ｉ ＴＬ　　　　　　　　　　４６　　　　　　　　　１３
３Ａｓ　　　　２１　　　　１６９ Ｃ２５１２２ Ａ　　　　　Ｉ２　　　　５７ Ｎ９５　　　３６　　　　１　Ｄ。

Ｎ９６　　　　　　　２７　　　　　　　　　　７６Ｎ
５２７　　４４　　　　１２７ Ｎ５３２　　　　１１６　　　　　　　　２６６Ｎ５４
２　　３９　　　　３７ Ｎ５４３　　３５　　　　　６．７ Ｎ５４４　　１６　　　　　９．４ Ｎ　５４５　　２５　　　　　９．７ Ｎ５４６　　３７　　　　２９ Ｎ５４７　　３４　　　　３８ Ｎ５４８　　２６　　　　１２ Ｎ５５０　　１２３　　　　１９４ この実験では連結蛋白とＨＡＢｒがそれぞれ異なったと
ころを測定していることを示す。

実施例　３ この結合率の温度依存性と変動値。

第３表Ａ ＋４℃　　　　　　　　　２６５チ ＋８℃　　　　１３．５％ ＋１８℃　　　　　　　　３０．５係 ＋２０℃　　　１７．２チ ＋２３℃　　　　　　　　３０７％ ＋２６℃　　　１７．５チ ＋３０℃　　　　　　　　２９．５％ ＋５７℃　　　１１．６チ　　２６．１％結合の程度は
大きく、温度による変動は少ないことが示される。ここ
では表示されていないが、変動中は温度依存性がある。

このことから、定量は２７℃以下の温度、望むら（は２
５℃以下すなわち２２℃以下がすすめられる。

第３表Ｂ （温度は２３〜２６℃） １ｈ　　　１２．８チ　　０．５ｈ　　　　　　　　　
３２．３チ２ｈ　　　１５．９％　　１ｈ　　　　Ｏ，
７５ｈ　　　３１．８％３ｈ　　　１７．５係　　２　
ｈ　　　　　　　　　３１．３％５ｈ　　　１９．９チ ０．５　ｈ　　　２７．９％ ０．７５ｈ　　　３１．６チ １　　ｈ　　　　１．Ｏｈ　　　３３．３チ１．２５ｈ
　　　３３．８係 実施例　４ 異なったーの緩衝液を用いて得られる反応混合物（１）
の−と百分率（Ｉｌｌで表示される血清と標準物質のそ
れぞれに対して、結合率Ｂ／’ｒ、１００μｌの標準物
質又は血清、１００μｌのアガロースに結合したＨＡ、
１００／ｊＮの　Ｉ−ＨＡＢｒを０，１Ｍリン酸緩衝液
（１，０Ｍ　ＮａＣ１，１％　ＢＳＡ、　０．１　％ツ
イーン２０．０．１５％６−ソン０を含有）で混合し、
緩衝液のｐＨは変化させる。

結　果： 第４表 ４．０　　　５．５　　５．５　　９．３　　　Ｂ、６
５．０　　　５．８　　５．８　　９．７　　９．２６
．０　　６．３　　６．５　　１１．３　　１０．８６
．５　　　６．７　　６．８　　１１．４　　１０．９
６．８６．９　　７．３　　１１，７　　１１．３ｚ２
　　　　ス２　　　　７．９　　　１２．０　　　１１
．０７．５　　７．４　　８．１　　１２．０　　１０
．０７．８　　　７．５　　８．３　　１１．１　　９
．５８．０　　　７．６　　　′Ｂ、５　　１０．６８
．８結果はｐＨは５．８から７４の間を選択すべきこと
を示す。血清試料では一変動によって障害が出現する。

又、血清には通常大きな緩衝容量が認められる。

特許出願人　　ファーマシア・アクチェボラーグ外２名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）試料（分析対象物）のヒアルロン酸にヒアルロン酸
   構造を有する第一の反応物（反応物（１）、誘導体化さ
   れたヒアルロン酸）とヒアルロン酸結合性の構造を有す
   る第二の反応物（反応物（２））とを加え、互に反応さ
   せて反応物（１）と（２）とを生体特異な親和性により
   結合させて複合体を形成させ、そして前記の複合体を上
   述の反応体の一つに共有結合で結ばれた標識で表示する
   かまたは上述の複合体と反応する抗体の利用によつて間
   接的に表示することによる阻害法によるヒアルロン酸の
   測定法において、 ｉ）反応物（２）はヒアルロン酸結合性の構造を有する
   軟骨の蛋白性グリカンである反応物であり、 ｉｉ）反応物（１）と（２）との互の反応は、ａ）ｐ＾
   Ｈ範囲が５．８から７．３まで（このｐ＾Ｈは緩衝容量
   が上記の範囲にあり、反応混合物 中の全濃度が０．０４Ｍを越える系外から加えた緩衝剤
   成分（酸−塩基対）によつて 得られる） およびｂ）温度範囲が＋０．℃から２７℃までの条件で
   遂行されることを特徴とする、上 記のヒアルロン酸の測定法。 ２）反応物（１）が固定相に結合させたヒアルロン酸で
   あることを特徴とする特許請求の範囲第１項によるヒア
   ルロン酸測定法。 ３）反応物（２）は分析的に検出可能な基を有すること
   を特徴とする特許請求の範囲第２項による方法。 ４）系外から加える酸−塩基対はＨ＿２ＰＯ＿４＾−／
   ＨＰＯ＿４＾２＾−であることを特徴とする特許請求の
   範囲第１項から第３項までのいずれかによる方法。 ５）反応物（１）の添加以前に前述のｐ＾Ｈ範囲と温度
   範囲で試料と反応物（２）を前もつてインキュベートす
   ることを特徴とする特許請求の範囲第２項から第４項ま
   でのいずれかによる方法。