DE68915231T2

DE68915231T2 - Verfahren und Vorrichtung zur multiplen Elektrophorese mit kontrollierter Wanderung von Makromolekülen in Gelplatten.

Info

Publication number: DE68915231T2
Application number: DE68915231T
Authority: DE
Inventors: Bernard Dutertre
Original assignee: Bertin et Cie SA
Current assignee: Bertin Technologies SAS
Priority date: 1988-09-06
Filing date: 1989-09-04
Publication date: 1994-12-01
Anticipated expiration: 2009-09-05
Also published as: BR8907077A; EP0358556B1; JPH03502136A; FR2639253A2; DE68915231D1; FR2639253B2; US5102524A; CA1332157C; WO1990002601A1; AU624180B2; EP0358556A1; AU4217289A; KR900701376A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur multiplen Elektrophorese zur kontrollierten Migration von Makromolekülen in Gelplatten.
Heutzutage wendet man Verfahren der Trennung von Makromolekülen, z.B. bei Proteinen oder Nukleinsäuren, durch Elektrophorese mittels eines elektrischen Feldes an, das an die Längsränder einer rechteckigen Platte aus einem geeigneten Gel angelegt wird, z.B. Agarose oder Polyacrylamid. Proben der zu trennenden Makromoleküle, z.B. Nukleinsäure, werden in im Gel gebildeten Schächten längs eines Randes der Platte angeordnet, worauf das ganze in eine geeignete Elektrophorese-Flüssigkeit eingetaucht wird. Die gegen den vorgenannten Rand der Platte sowie den gegenüberliegenden Rand derselben gerichteten Elektroden werden an unterschiedliche Potentiale derart angeschlossen, daß sich zwischen den Elektroden ein elektrisches Feld in einem der erwünschten Migrationsrichtung der Makromoleküle in der Gelplatte entsprechendem Sinn aufbaut. Unter der Wirküng des elektrischen Feldes verlagern sich die Makromoleküle der in den Schächten befindlichen Proben quer über das Gel zum gegenüberliegenden Plattenrand mit Geschwindigkeiten, die Funktionen insbesondere ihrer molaren Masse sind, derart, daß am Ende einer vorgegebenen Zeit die Makromoleküle unterschiedlicher molarer Massen im Gel unterschiedliche Strecken durchwandert haben.
Bei einem bekannten Verfahren werden die so getrennten Makromoleküle in der Folge zwecks ihrer späteren Hybridisierung sowie Erfassung durch Ansaugen oder mittels eines elektrischen Feldes, das senkrecht zur Platte im gewollten Sinn gerichtet ist, auf eine Membran übertragen, die über einer großen Fläche der Gelplatte angeordnet ist, vgl. z.B. WO-A-87/02132.
Dieses Verfahren und die Geräte, die zu seiner Durchführung angefertigt sind und vor allem für Laboratorien geeignet sind, d.h. daß es sich um Geräte geringer Größe handelt, arbeiten mit geringen Arbeitstakten, wobei die Gelplatten nacheinander usw. behandelt werden.
Außerdem sind die mit diesen Geräten durchgeführten Trennungen nicht genau reproduzierbar und können von einer Platte zur anderen oder von einer Probe zur anderen in derselben Platte schwanken, noch würde es wegen des ungleichmäßigen elektrischen Feldes zwischen den Elektroden auf Grund der Andersartigkeit des durchquerten Bereiches sein, daß identische Makromoleküle mit derselben molaren Masse über unterschiedliche Strecken wandern können, wenn sie an verschiedenen Stellen derselben Platte oder auf verschiedenen Platten angeordnet sind.
Daraus ergeben sich insbesondere Schwierigkeiten der Interpretation der Ergebnisse und die Unmöglichkeit, die Geräte zur Trennung der Makromoleküle durch Elektrophorese zu automatisieren.
Das Dokument DE-A2 107092 beschreibt einen Elektrophorese-Behälter mit einem darin angeordneten, vertikale Gelplatten enthaltenden Gehäuse zwischen parallelen Elektroden zwischen ihnen und den Platten, die sich in zwei horizontalen Ebenen darunter und unterhalb des Gehäuses erstrecken. Diese bekannte Vorrichtung ermöglicht die Migration von Makromolekülen in einer Richtung in. den Gelplatten und bewirkt, daß die Gelplatten in dem Gehäuse hergestellt werden können.
Das Doküment WO-A-84/02001 beschreibt eine Elektrophoresevorrichtung zur Trennung von Makromolekülen in horizontal gestapelten Gelplatten mittels vertikaler Elektroden, die um den Plattenstapel längs der Plattenseiten gleichmaßig verteilt sind. Diese bekannte Vorrichtung ermöglicht keine Migration von Makromolekülen in zu den Ebenen der Gelplatten parallelen Ebenen.
Das Doküment EP-A-0234836 beschreibt einen Elektrophorese-Behälter, in dem eine Gelplatte vertikal zwischen zwei Gruppen horizontal erstreckter, zu beiden Seiten der Gelplatte angeordneter und in bezüglich dieser Platte schrägen Ebenen liegender Elektroden angeordnet werden kann. Zur aufeinanderfolgenden Durchführung der Trennung der Makromolekülen der Gelplatte nach ihrer Übertragung auf eine Membran muß man die Trennelektroden in dem Behälter anordnen, sie danach herausziehen und hernach Übertragungselektroden im Behälter anordnen. Zwischen der Trennung und der Übertragung muß die Gelplatte behandelt, einer Membran zugeordnet und mit der Membran wieder im Behälter angeordnet werden.
Die Erfindung hat insbesondere die Vermeidung der Unzulänglichkeiten der früheren Verfahren zum Ziel.
Sie hat ein Verfahren und eine Vorrichtung zur multiplen Elektrophorese zum Ziel, die die Durchführung der Trennung von Makromolekülen in Gelplatten auf sichere, zuverlässige, wiederholbare und perfekt automatisierbare Weise ermöglichen
Die Erfindung hat auch ein Verfahren und eine Vorrichtung der Art zum Ziel, die die gleichzeitige Behandlung einer großen Anzahl Gelplatten ermöglichen.
Die Erfindung hat auch ein Verfahren und eine Vorrichtung der vorgenannten Art zum Ziel, die auf Wunsch Abwandlungen der Trennungsbedingungen der Makromoleküle durch kontrollierte Änderung des elektrischen Feldes ermöglichen, das an die Gelplatten zur Migration der Makromoleküle angelegt wird.
Sie schlägt ein Verfahren zur multiplen Elektrophorese zur kontrollierten Migration von Makromolekülen in Gelplatten vor, welches das Eintauchen der Gelplatten in einen Behälter mit einer elektrophoretischen Flüssigkeit, wobei diese Platten entlang eines Randes Makromoleküle enthalten und zumindest eine Zelle bilden, in welcher sie parallel und in Abstand voneinander angeordnet sind, und das Anlegen elektrischer Potentiale an langgestreckte Elektroden aufweist, die zueinander und zu den in der Flüssigkeit eingetauchten Gelplatten parallel sind und entlang zweier gegenüberliegender Enden der Plattenzelle in zwei normal auf die Platten stehenden Ebenen angeordnet sind, wobei die in einer Ebene liegenden Elektroden auf gleichem Potential liegen, um zwischen diesen Ebenen ein elektrisches Feld zur Migration von Makromolekülen in den Gelplatten zu erzeugen, und ist dadurch gekennzeichnet, daß
-dieser Behälter weitere langgestreckte Elektroden aufweist, welche zu den oben genannten Elektroden parallel und so zwischen den Enden der Plattenzelle angeordnet sind, daß alle Elektroden an den Schnittlinien zweier Reihen von Ebenen angeordnet sind, wobei die Ebenen einer ersten Reihe normal auf die Platten und eine erste Migrationsrichtung stehen und die Ebenen der zweiten Reihe parallel zu den Platten sind,
-und daß das Verfahren das Anlegen elektrischer Potentiale an die Elektroden aufweist, um in den Gelplatten und in der elektrophoretischen Flüssigkeit zuerst ein erstes elektrisches Feld, das in allen Punkten im wesentlichen parallel zu der ersten Migrationsrichtung ausgerichtet ist, und dann ein zweites elektrisches Feld zu erzeugen, welches parallel zu einer zweiten Migrationsrichtung und normal auf die Gelplatten ausgerichtet ist,
-wobei das erste elektrische Feld durch Anlegen unterschiedlicher elektrischer Potentiale an unterschiedliche Elektrodenebenen der ersten Reihe erzeugt wird und die in einer Ebene der ersten Reihe enthaltenen Elektroden auf gleichem elektrischen Potential liegen,
-und das zweite elektrische Feld durch Anlegen unterschiedlicher elektrischer Potentiale an unterschiedlichen Elektrodenebenen der zweiten Reihe erzeugt wird und die in einer Ebene der zweiten Reihe enthaltenen Elektroden auf gleichem elektrischen Potential liegen.
Die in senkrecht zur erwünschten Migrationsrichtung der Makromoleküle verlaufenden Ebenen liegenden Elektroden definieren Äquipotentialflächen, die im wesentlichen eben sind, oder zumindest in erster Näherung,, da sie von parallelen und komplanaren Geraden definiert sind.
Da das elektrische Feld zwangsläufig zu den Äquipotentialflächen normal ist, die selbst senkrecht zur erwünschten Migrationsrichtung sind, erhält man daher zwangsläufig in den Gelplatten ein elektrisches Feld, das zumindest auf dem Niveau jeder Elektrode in der gewollten Richtung orientiert ist, u.zw. trotz der Ungleichartigkeit der dem elektrischen Feld unterworfenen Umgebung.
Daraus ergibt sich eine Kontrolle der Stärke und der Orientierung des elektrischen Feldes quer zu den Gelplatten, die derart ist, daß man bei denselben Bedingungen die Trennungen der Makromoleküle und perfekt wiederholbare Messungen erhält.
Daraus leitet sich die Möglichkeit ab, die Trennungsvorgänge der Makromoleküle zu automatisieren und diese mit einer Datenverarbeitungsanlage zu steuern, z.B. mittels eines Automaten, wie er in einer anderen Patentanmeldung der Anmelderin beschrieben ist, die am selben Tag hinterlegt worden ist.
Weiters kann man nicht nur die Trennung der Makromoleküle in den Gelplatten, sondern gleicherweise ihre Übertragung auf die Membranen durchführen, die passend längs einer der großen Seiten der Gelplatten angeordnet sind.
Gleichermaßen kann man durch gleichmaßige Verteilung der Potentiale auf den gleichmaßig bezüglich der Plattenstapel verteilten Elektrodenebenen ein einheitliches elektrisches Feld quer zum Plattenstapel schaffen.
Als Variante umfaßt das Verfahren gleicherweise Veränderung der Größe und/oder des Sinnes des elektrischen Feldes quer zum Plattenstapel, indem die Verteilung der Potentiale über den Elektrodenebenen verändert wird.
Die zeitlichen Änderungen der Potentialdifferenzen zwischen den Elektrodenebenen können synchron und untereinander gleich sein, um die Größe des elektrischen Feldes zeitlich zu verändern, ohne seine Verteilung im Raum zu ändern; genau so gut können die Potentialdiffernzen zwischen den Elektrodenebenen örtlich verändert werden, um die Intensität des elektrischen Feldes örtlich zu ändern.
Gemäß einer anderen Variante umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren die allenfalls zyklische Abänderung der Potentialdifferenzen zwischen den Elektrodenebenen.
Auf diese Weise kann man die Makromoleküle durch Stöße in der erwünschten Migrationsrichtung zum Wandern bringen.
Gemäß einer weiteren Variante der Enfindung umfaßt das Verfahren gleicherweise die Nebeneinanderordnung zumindest zweier Plattenstapel, indem sie in einer zur vorgenannten Migrationsrichtung parallelen oder senkrechten Richtung nebeneinander anordnet werden.
Man kann auch die Gelplatten der verschiedenen Stapel mit unterschiedlichen elektrischen Feldern behandeln.
Die Erfindung schlägt gleicherweise eine Vorrichtung zur multiplen Elektrophorese zur kontrollierten Migration von Makromolekülen in Gelplatten vor, die aufweist: einen Behälter, in welchem die Gelplatten aufgenornmen werden können, Mittel zur Halterung der Gelplatten, welche parallel und in Abstand voneinander gehalten werden und zumindest eine Zelle bilden, eine Mehrzahl von langgestreckten Elektroden, die zueinander und zu den Platten parallel sind und entlang zweier gegenüberliegender Enden der Plattenzelle in zwei Ebenen normal auf die Platten angeordnet sind, Mittel zum Verbinden der Elektroden einer Ebene, durch welche sie auf gleichem Potential gehalten werden, und Mittel zum Anlegen elektrischer Potentiale an diese Elektroden, um zwischen diesen beiden Ebenen in den Gelplatten ein elektrisches Feld zur Migration von Makromolekülen zu erzeugen, und die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie aufweist:
-weitere langgestreckte Elektroden, die parallel zu den oben genannten Elektroden und so zwischen den Enden der Plattenzelle in dem Behälter angeordnet sind, daß alle Elektroden an den Schnittlinien vön zwei Reihen von Ebenen liegen, wobei die Ebenen einer ersten Reihe normal auf die Platten und eine erste Migrationsrichtung der Makromoleküle stehen und die Ebenen der zweiten Reihe parallel zu den Platten sind,
-Mittel zum Verbinden der Elektroden einer Ebene der ersten Reihe, welche sie auf einem gemeinsamen elektrischen Potential halten, und Mittel zum Verbinden der Elektroden unterschiedlicher Ebenen der ersten Reihe, welche das Herstellen einer Potentialdifferenz zwischen zwei aufeinanderfolgenden Ebenen der ersten Reihe ermöglichen,
-Mittel zum Verbinden der Elektroden einer Ebene der zweiten Reihe, welche sie auf einem gemeinsamen elektrischen Potential halten, und Mittel zum Verbinden der Elektroden unterschiedlicher Ebenen der zweiten Reihe, welche das Herstellen einer Potentialdifferenz zwischen zwei aufeinanderfolgenden Ebenen der zweiten Reihe ermöglichen,
-Steuermittel zum Verändern der Potentialverteilung an den Elektroden der Ebenen, um in den Gelplatten und in der elektrophoretischen Flüssigkeit zuerst ein erstes elektrisches Feld, welches parallel zu der ersten Migrationsrichtung ausgerichtet ist, und danach ein zweites elektrisches Feld zu erzeugen, welches parallel zu einer zweiten Migrationsrichtung ist, die Normal auf die Gelplatten ausgerichtet ist.
Vorzugsweise sind die Elektroden zwischen den Rändern der Gelplatten und zwischen diesen Gelplatten in regelmaßigen Abständen angeordnet.
Vorzugsweise sind die Mittel zum Verbinden zwei aufeinanderfolgender Elektroden einer Ebene vom Typ mit steuerbarer Leitfähigkeit, die zwischen einem im wesentlichen widerstandslosen leitfähigen Zustand und zumindest einem leitfähigen Zustand mit einem bestimmten Widerstand ungleich null veränderbar ist.
Die Mittel zum Verbinden können insbesondere elektronische Bauelemente, wie Transistoren, Thyristoren, usw. sein, die wahlweise leiten oder gesperrt sind.
Die Mittel zum Verbinden können einzeln oder in Gruppen gesteuert sein, vorzugsweise durch die Mittel, welche allen Elektroden gemeinsam sind, die in ein und derselben Gruppe paralleler Ebenen liegen.
Bei einer Ausführungsform der Erfindung sind die Mittel zum Verbinden der Elektroden und die Steuermittel von zumindest einer dielektrischen Platte gehalten, an welcher die Elektroden mit einem ihrer Enden befestigt sind.
Gemaß einer Ausführungsvariante der Erfindung ist die Halterung zum Aufnehmen zumindest zweier Plattenstapel geeignet, welche Seite-an-Seite angeordnet und zumindest in einer Richtung parallel zu den Platten verbunden sind, und eine Elektrodenreihe der vorhin genannten Art, welche Mittel zum Steuern und Mittel zum Verbinden von Elektroden aufweist, ist jedem Plattenstapel zugeordnet, um in den Platten dieser Zellen elektrische Felder zu erzeugen, die gewünschtenfalls gleich oder unterschiedlich, miteinander verbunden oder voneinander unabhängig sind.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung sind die Elektroden in einem beweglichen Gitter eingebaut, welches die Halterung für die Gelplatten bildet.
In der Praxis genügt es, die Elektroden durch gegebenenfalls perforierte Platten oder Gitter aus dielektrischem Material untereinander zu verbinden, um einen Tragkorb zu bilden, zwischen dessen Elektroden man die Gelplatten anordnet, die man in den Behälter durch dessen horizontale Oberseite eintaucht und aus diesem herauszieht.
Es ist gleichfalls vorgesehen, daß die unteren Enden der genannten Elektroden Mittel zum Verbinden oder zum Anschließen dieser Elektroden aufweisen, welche von einer Bodenwand des besagten Behälters gehalten sind.
In diesem Fall genügt es daher, das Gitter auf dem Behälterboden anzuordnen, damit die vertikalen Elektroden des Gitters mit den Mitteln zum Anlegen des Potentials und der Steuerschaltung der Vorrichtung mittels der Elektroden am Behälterboden verbunden sind.
Vorteilhafterweise bilden diese Mittel zum Verbinden oder Anschließen zugleich Mittel zum Positionieren des Gitters in dem Behälter.
Vorzugsweise sind Elektroden des Behälterbodens im wesentlichen punkförmig und bilden ein Netz in Form eines quadratischen oder rechteckigen Maschenwerkes, dessen Seiten parallel bzw. senkrecht zur erwünschten Migrationsrichtung der Makromoleküle verlaufen.
Sie sind über gesteuerte Verbindungsmittel untereinander verbunden, was ermöglicht, wahlweise die in einer gememsamensenkrecht zur erwünschten Migrationsrichtung der Makromoleküle verlaufenden Ebene liegenden Elektroden auf demselben Potential zu halten und eine Potentialdifferenz zwischen zwei aufeinanderfolgenden dieser Ebenen zu schaffen.
Die Erfindung sieht in diesem Fall weiters vor, daß die Vertikalwände des Behälters vertikale lineare Elektroden aufweisen, welche gleichfalls an die gesteuerten Verbindungsmittel angeschlossen sind, die es ermöglichen, zwischen diesen wahlweise Potentialdifferenzen herzustellen oder sie auf gleichem Potential zu halten.
Um die Behandlungskapazität der erfindungsgemaßen Vorrichtung zu verbessern, kann das Gitter zumindest auf einem Niveau zwei Reihen von Gelplatten aufweisen, bei welchen die Platten einer Reihe im wesentlichen in der Verlängerung der Platten der anderen Reihe angeordnet, aber der Länge nach gegensinnig bezüglich der Ausgangslage der Makromoleküle ausgerichtet sind.
Man kann auch mehrere Doppelreihen von Gelplatten behandein, ohne hiefür die gesamte Potentiäldifferenz im Behälter zu erhöhen, die man für eine Platte benötigt.
Vorzugsweise sind die Elektroden von zylindrischen Röhren aus dielektrischem Material umgeben, die gegenüber der elektrophoretischen Flüssigkeit perforiert oder porös sind.
Diese an ihren Enden offenen Rohre bilden einen Getter für Gasblasen, die bei der Elektrolyse durch Kontakt mit den Elektroden entstehen, und führen die Blasen zur freien Oberfläche der Flüssigkeit, ohne daß sie in Kontakt mit den Gelplatten gelangen können.
In der folgenden Beschreibung eines Beispiels bezieht man sich auf die beiliegenden Zeichnungen, in denen zeigen:
Fig. 1 schematisch einen bekannten Apparat zur Trennung von Makromolekülen durch Elektrophorese,
Fig. 2 eine schematische Ansicht des Endes einer Elektrodenreihe, die zur Anwendung in der erfindungsgemaßen Vorrichtung geeignet ist,
Fig. 3 dieselbe Elektrodenreihe, jedoch in unterschiedlicher Weise gesteuert,
Fig. 4 schematisch eine Reihe ähnlicher Elektroden und ihre Steuermittel,
Fig. 5 schematisch eine Draufsicht auf die erfindungsgemaße Vorrichtung mit vier Elektrodenreihen für vier Gelplattenstapel,
Fig. 6 und 7 zwei schematische schaubildliche Ansichten eines Elektrodengitters gemaß zweier verschiedener Ausführungsformen der Erfindung,
Fig. 8 einen schematische Aufriß eines Tragkorbes für die Gelplatten,
Fig. 9 eine Seitenansicht dieses Korbes,
Fig. 10 eine schematische schaubildliche Ansicht des Tragkorbes für die Platten,
Fig. 11 eine schematische schaubildliche, teilweise weggebrochene Ansicht eines Elektrophorese-Behälters,
Fig. 12 eine Teilansicht in größerem Maßstab der Positioniermittel des Korbes im Behälter,
Fig. 13 eine schematische Ansicht des Schaltkreises der Verbindung der Elektroden am Behälterboden,
Fig. 14 eine schematische schaubildliche, teilweise weggebrochene Ansicht einer anderen Ausführungsform des Elektrophore-Behälters und
Fig. 15 einen schematischen teilweisen Querschnitt durch die porösen Röhren, die um die vertikalen Elektroden des Korbes montiert sind.
In Fig. 1 ist sehr schematisch das Prinzip der Trennung von Makromolekülen in einer Gelplatte durch Elektrophorese dargestellt.
Makromoleküle, z.B. Nukleinsäure, enthaltende Proben, werden in Schächten 10 angeordnet, die in einer rechteckigen Platte 12 aus Agarose- oder Polyacrylamidgel längs einer der kürzen Seiten dieser Platte gebildet sind. Die die Proben enthaltende Gelplatte 12 wird in einem Elektrophorese-Behälter 14 zwischen zwei Elektroden 16 (bzw. einer Anode und einer Kathode) in der in Fig. 1 gezeigten Lage angeordnet. Der Behälter 14 wird sodann mit einer geeigneten elektrophoretischen Flüssigkeit gefüllt, worauf die Elektroden an die Klemmen einer elektrischen Energiequelle derart angeschiossen werden, daß sich zwischen den Elektroden eine vorbestimmte Potentialdifferenz aufbaut, die ein elektrisches Feld hervorruft, das von einer Elektrode zur anderen in der erwünschten Migrationsrichtung der Makromoleküle quer über die Gelplatte 12 verläuft.
Die Migrationsgeschwindigkeiten der Makromoleküle quer über die Platte 12 in Richtung zum gegenüberliegenden Plattenrand sind Funktionen ihrer molaren Masse. Infolgedessen werden am Ende einer vorgegebenen Zeit die Makromoleküle in der Platte 12 Strecken zurückgelegt haben, die jeweils eine Funktion ihrer molaren Masse ist. Als Beispiel sind die von den Makromolekülen in einem Schacht 10 zurückgelegten Strecken D1, D2, D3 dargestellt.
Diese Trennung der Makromoleküle als Funktion ihrer molaren Masse erlaubt nach der Übertragung auf eine Membran und Markierung durch Hybridisierung oder ein anderes Verfahren, die Makromoleküle mittels geeigneter Sonden zu identifizieren und wieder zu erkennen.
Die Anwendungen einer solchen Technik sind vieWältig und für die Industrie mehr und mehr interessant. Jedoch können die bekannten Elektrophorese-Apparate nur in Laboratorien verwendet werden und sind zur Automatisierung ungeeignet.
Dies ist insbesondere deshalb so, weil die Umgebung, in der sich das elektrische Feld zwischen den Elektroden 16 aufbaut, teilweise heterogen ist; sie besteht aus der Platte 12, der Übertragungsmembran, die sich längs der langen Seite der Platte 12 befindet, der elektrophoretischen Flüssigkeit als Bad der Platte 12 und der Elektroden 16, der Halterung der Platte 12 und der Membran, usw. Das elektrische Feld zwischen den Elektroden 16 ist daher nicht gleichmaßig und weiters nicht an allen Stellen parallel zur erwünschten Migration der Makromoleküle in der Platte 12 gerichtet. Durch elektrochemische Reaktion bilden sich weiters Blasen in der mit den Elektroden in Berührung stehenden elektrophoretischen Flüssigkeit auf Grund der verhältnismäßig beträchtlichen Potentialdifferenz zwischen den Elektroden 16 und ihrer kleinen Oberfläche, und diese Blasen, die sich von Elektroden lösen, behindern oder beeinflussen die Migration der Makromoleküle.
Wie angedeutet, ermöglichen das Verfahren und die Vorrichtung nach der Erfindung, diese Unzulänglichkeiten der derzeitigen Technik zu vermeiden und überdies die Trennung und die Übertragung der Makromoleküle durch Elektrophorese zu automatisieren.
Das Verfahren sowie die Vorrichtung nach der Erfindung ermöglichen weiters, gleichzeitig eine große Anzahl Gelplatten zu behandein, welche Proben der zu trennenden Makromoleküle aufweisen.
Im folgenden wird auf die Fig. 2 und 3 Bezug genommen, welche schematisch gewisse wesentliche Kennzeichen der Erfindung zeigen, die insbesondere auf die Migration von Makromolekülen quer über die Gelplatten und die Übertragung der Makromoleküle auf die den Gelplatten zugeordneten Membranen anwendbar sind.
Die erfindungsgemaße Vorrichtung besteht im wesentlichen aus einem Elektrophorese-Behälter mit geeigneten Abmessungen, einer Reihe langgestreckter Elektroden 20, die z.B. von Drähten aus einem geeigneten elektrisch leitenden Material gebildet sind. Die Elektroden 20 sind untereinander parallel und erstrecken sich senkrecht zur Zeichenebene der Fig. 2 und 3. Sie sind an den Schnittstellen zweier Reihen zueinander senkrechter Ebenen angeordnet, von denen die einen senkrecht zur erwünschten Migrationsrichtung der Makromoleküle und die anderen senkrecht zu den ersten und zur Übertragungsrichtung der Makromoleküle auf die Membranen verlaufen.
Die in einer gemeinsamen, senkrecht zur erwünschten Migrationsrichtung verlaufenden Ebene liegenden Elektroden 20 sind untereinander derart verbunden, daß sie sich auf demselben Potential befinden, während die in zu diesem Typ unterschiedlichen Ebenen liegenden Elektroden auf unterschiedlichen Potentialen sein müssen, um ein zur erwünschten Migrationsrichtung paralleles elektrisches Feld zu schaffen. Außerdem sind die Elektroden bloß an ihren Enden untereinander derart verbunden, daß im Elektrodengitter ein Stapel Gelplatten 12 angeordnet werden kann, dessen eine lange Seite mit einer Übertragungsmembran 22 versehen ist und die von Halterungen 24 eines Korbes 26 getragen sind, wie nur in Fig. 2 mit strichlierten Linien dargestellt. Die also einen vertikalen Stapel bildenden Gelplatten 12 sind in gegenseitigen Abständen gehalten und in gleichen Abständen oder auch nicht zwischen den zu den Elektroden 20 parallelen Ebenen angeordnet, wobei jede der senkrechten Ebenenreihen von den Elektroden 20 begrenzt ist.
Eine Elektrode einer äußersten vertikalen Ebene, z.B. die in der linken oberen Ecke des Musters in Fig. 2 angeordnete Elektrode und die diagonal gegenüberliegende Elektrode sind an zwei Klemmen einer elektrischen Gleichspannungsquelle angeschlossen, die in einer gemeinsamen Vertikalebene angeordneten Elektroden sind untereinander an dasselbe Potential angeschlossen , und die in einer gemeinsamen Vertikalebene liegende Elektrodenreihe ist mit der in einer anderen benachbarten oder folgenden Vertikalebene angeordneten Elektrodenreihe durch einen Widerstand 28 eines Spannungsteilers verbunden, der schrittweise jeweils eine vorbestimmte Potentialdifferenz schafft.
Da die Erzielung eines gleichmaßigen elektrischen Feldes quer über alle Platten 12 erwünscht ist, haben alle Widerstände 28 dieselbe Größe und die Vertikalebenen der Elektroden denselben gegenseitigen Abstand.
Die die von den Elektroden 20 begrenzten parallelen Vertikalebenen sind zumindest auf dem Niveau der sie enthaltenden Elektroden 20 Äquipotentialflächen. Das elektrische Feld E1 oder der Gradient des entwickelten Feldes zwischen den Elektroden ist zu den Äquipotentialflächen normal und ist daher wegen der geometrischen Anordnung der Elektroden und der Gelplatten 12 an sehr vielen Stellen parallel zu der erwünschten Migrationsrichtung der Makromoleküle, wobei die Größe im wesentlichen konstant ist.
Daraus folgt, daß die Ergebnisse der Trennung der Makromoleküle durch Migration quer über die Gelplatten 12 zumindest in erster Näherung genau und wiederholbar sind. Eine vorhergehende Eichung oder Kalibrierung der Vorrichtung ermöglicht erforderlichenfalls die präzise Bestimmung von allfälligen Singularitäten des elektrischen Feldes, die jedenfalls gering sein werden, und die bei der Auswertung der Ergebnisse der Trennung zu berücksichtigen sind.
In logischer Folge gestatten das Verfahren und die Vorrichtung gemaß der Erfindung die gleichzeitige Behandlung einer großen Anzahl Gelplatten 12.
In Fig. 3 ist dieselbe Anordnung der Elektroden 20 zur Übertragung der Makromoleküle auf die den Gelplatten 12 zugeordneten Membranen 22 verwendet. Bezüglich der Fig. 2 sind einzig die Verbindungen zwischen den Elektroden geändert, da ja ein elektrisches Feld erhalten werden soll, das senkrecht zu den Ebenen der Platten 12 verläuft.
Zu diesem Zweck sind die in einer gemeinsamen, zu den Platten 12 parallelen Horizontalebene liegenden Elektroden 20 an dasselbe Potential angeschlossen, wahrend die in einer gemeinsamen Horizontalebene liegenden Elektrodenreihe mit der in einer anderen, benachbarten oder folgenden Horizontalebene liegenden Elektrodenreihe durch einen Widerstand 30 mit vorbestirnmtem Betrag verbunden ist. Die die Elektroden 20 enthaltenden Horizontalebenen bilden somit Äquipotentialflächen, die senkrecht zu dem elektrischen Feld E2 verlaufen, das entsteht, sobald die Elektroden 20 der oberen Horizontalebene und die Elektroden der unteren Horizontalebene an zwei entgegengestzte Klemmen der Gleichspannungsquelle angeschlossen werden.
Da alle elektrischen Widerstände 30 denselben Betrag haben, ist das elektrische Feld E2 zur Übertragung für alle Platten 12 von derselben Größe, wo auch immer sie sich im Stapel befinden.
Es ist demgemaß sofort ersichtlich, daß genügt, die Beträge der Widerstände 28 und 30 abzuänder, um besondere Verteilungen des elektrischen Feldes quer über die Platten 12 in der Migrationsrichtung und in der Übertragungsrichtung der Makromoleküle zu erhalten. Durch Steuerung der Beträge der an die Elektroden der äußersten Ebenen angelegten Potentiale und der zeitlichen Anderung dieser Potentiale kann man örtlich oder in der gesamten Vorrichtung die Größe des elektrischen Feldes nicht nur permanent, sondern auch zyklisch verändern. Insbesondere kann man auch die Richtung des elektrischen Feldes während einer vorbestimmten Dauer umkehren, danach erneut umkehren, um es wieder in der erwünschten Richtung der Migration oder der Übertragung zu orientieren.
Man kann weiters durch Kommutation ein Fortschälten einer vorgegebenen Potentialverteilung durchführen, die an den Elektroden in aufeinanderfolgenden Ebenen anliegt und insbesondere eine Umkehr des elektrischen Feldes beinhalten kann, wobei man schrittweise durch das Elektrodengitter vorgeht.
Man kann auch die Elektroden in aufeinanderfolgenden Ebenen oder gewisse von ihnen durch eine vorbestinnnte Potentialdifferenz, z.B. zur Migration der Makromoleküle in den Gelplatten, fortschälten. Dies ermöglicht, daß das elektrische Feld wiederholt über vorbestimmte Längsabschnitte oder erwünschtenfalls über die gesamte Länge der Gelplatten wirkt, wobei das Feld mittels einer Potentiäldifferenz geschaffen wird, das mehrfach unter der Potentialdifferenz liegt, die an die Elektroden an den gegenüberliegenden Enden der Gelplatten angelegt werden sollte, um ein elektrisches Feld derselben Intensität zu erhalten. Dies ergibt wichtige Vorteile auf dem Gebiet des Energleverbrauches, der Wahl der Bestandteile zur Kommutation der Potentiale, der Erwärmung der Flüssigkeit, der Bildung der Blasen in der Flüssigkeit, usw.
Fig. 4 zeigt schematisch eine Endansicht der Anordnung der Elektroden und ihrer Verbindungsmittel, welche insbesondere die Anordnungen gemaß Fig. 2 und 3 zur Migration bzw. der Übertragung der Makromoleküle ermöglichen.
Gemaß Fig. 4 ist jede Elektrode 20 an der Schnittstelle einer Horizontalebene und einer Vertikalebene (alle beide senkrecht zur Zeichenebene) angeordnet und mit den benachbarten Elektroden über einen elektronischen Bauteil 32 mit gesteuerter Leitfähigkeit, wie einen Transistor oder einen Thyristor, verbunden, der wahlweise leitend oder gesperrt sein kann, d.h. dessen elektrischer Widerstand entweder im wesentlichen null oder im wesentlichen unendlich ist.
Bei der dargestellten Ausführungsform sind die die in verschiedenen Horizontalebenen liegenden Elektroden 20 verbindenden Bauteile 32 alle mit ihrem Steuereingang an eine gemeinsame Leitung 34 angeschlossen, die zu einer Steuerschaltung 36 führt. Desgleichen sind alle die in aufeinanderfolgenden Vertikalebenen liegenden Elektroden 20 untereinander verbindenden Bauteile 32 alle mit ihrem Steuereingang an eine gemeinsame Leitung 38 angeschiossen, die zur Steuerschaltung 36 führt. Diese Schaltung steuert ebenso durch Leitungen 40 bzw. 42 die Potentiale der Elektroden 20 in der lmken oberen Ecke sowie in der rechten oberen Ecke des Schältbildes gemaß Fig. 4.
Die in einer gemeinsamen Vertikalebene angeordneten Elektroden sind mit den in der einem Widerstand 28 benachbarten Vertikalebene verbunden, und die in einer gemeinsamen Horizontalebene angeordneten Elektroden sind mit den in der einem Widerstand 30 benachbarten Horizontalebene verbunden, welche Widerstände denselben Betrag oder unterschiedliche Beträge aufweisen können, wie dies gemaß der Figur der Fall ist. Insbesondere kann man einstellbare Widerstände vorsehen.
Wenn alle die in aufeinanderfolgenden Horizontalebenen liegenden Elektroden untereinander verbindenden Bauteile 32 derart gesteuert sind, daß sie einen Widerstand von im wesentlichen null haben, und alle die in aufeinanderfolgenden Vertikalebenen liegenden Elektroden untereinander verbindenden Bauteile 32 derart gesteuert sind, daß ihr Widerstand im wesentlichen unbegrenzt ist, erhält man die Anordnung gemaß Fig. 2.
Wenn umgekehrt die die aufeinanderfolgenden Horizontalebenen untereinander verbindenden Bauteile 32 derart gesteuert sind, daß ihr Widerstand im wesentlichen unbegrenzt ist, und die die aufeinanderfolgenden Vertikalebenen untereinander verbindenden Bauteile 32 derart gesteuert sind, daß ihr Widerstand im wesentlichen null ist, so erhält man die Anordnung gemaß Fig. 3.
Werden die Widerstände 28 und 30 durch variable Potentialquellen ersetzt, deren Betrag von einer geeigneten Steuerschaltung, wie einem Operationsverstärker, gesteuert ist, so erhält man elektrische Felder, die von einem Bereich der Platte zu einem anderen örtlich unterschiedlich sind.
Mittels der Steuerschaltung 36 kann man weiters in erwünschter Weise die durch die Leitungen 40 und 42 an die Elektroden in der linken oberen Ecke und der rechten unteren Ecke des Netzwerkes gemaß Fig. 4 angelegten Potentiale verändern. Auf diese Weise kann man zeitweilig das elektrische Feld umkehren, um z.B. ein pulsierendes elektrisches Feld zu erzielen. Man kann weiters die Platten mit einer Abfolge elektrischer Felder überstreichen, die örtlich unterschiedlich, sogar entgegengesetzt sind.
Wenn die Reihen Gelplatten unterschiedlichen elektrischen Feldern ausgesetzt werden sollen, d.h. daß deren Verteilung im Raum und/oder ihre zeitlichen Änderungen verschieden sind, so kann man die Anordnung gemaß Fig. 5 verwenden, die die gleichzeitige Behandlung einer gewissen Ahhhhl Stapel 46 von Gelplatten ermöglicht. Jeder Stapel 46 ist einem System Elektroden 48 desselben Typs wie in Fig. 4 zugeordnet, weiches System eine Steuerschaltung 36 zur Anderung des quer über den Plattenstapel verlaufenden Feldes aufweist. Jede Steuerschaltung 36 ist selbst an ein zentrales Steuersystem 50 angeschlossen, das z.B. von einem Computer geführt ist. In diesem Fall können die Potentiäländerungen in dem den verschiedenen Plattenstapeln 46 zugeordneten Elektrodensystem 48 auf Wunsch gleichartig oder unterschiedlich sein, untereinander verbunden oder voneinander unabhänglg
Das Verfahren sowie die Vorrichtung nach der Erfindung ermöglichen somit die Verwirklichung der Trennung von Makromolekülen mit unterschiedlichen molaren Massen unter einheitlichen Bedingungen oder auch das Studium des Verhaltens von Makromolekülen der gleichen Art und derselben molaren Masse in unterschiedlichen elektrischen Feldern und in Gelplatten unterschiedlicher Art.
Ein Vorteil der erfindungsgemaßen Elektrodenanordnung ist, daß die Gelplatten jeden zwischen den Elektrodenebenen oder zwischen gewissen hievon vorgesehenen Platz einnehmen können, ohne daß dies zu einer Abwandlung der Verteilung der elektrischen Felder führt.
In der Praxis (Fig. 6) sind die Elektroden 20 an einem Ende auf einer gemeinsamen Platte 52 aus dielektrischem Material samt den Bauteilen 28, 30, 32 und den notwendigen Verbindungen befestigt. Ebenso sind die Elektroden vorteilhafterweise Drähte aus leitendem Material; sie sind an ihrem anderen Ende an einer zweiten Platte aus dielektrischem Material befestigt, die gewisse Bauteile der nötigen Verbindungen tragen kann oder nicht.
Die Potentialquelle und die Steuerschaltungen 36, 50 befinden sich vorzugsweise an der Außenseite des Bades elektrophoretischer Flüssigkeit.
In Fig. 2 sind ebenso die verschiedenen Gelplatten schematisch dargestellt, die auf einen Teil des Korbes 26 bildenden Halterungen montiert sind, der durch Verlagerung ins Innere und Äußere des Elektrodengitters verschiebbar ist.
Bei einer Variante (Fig. 7) können die Elektroden von parallelen leitenden Streifen 54 begrenzt sein, die auf den Wänden 56 des Behälters z.B. durch Galvanisieren gebildet sind.
Die erfindungsgemaßen Elektrophorese-Behälter sind in bekannter Weise mit einem System zur Zirkülation und Kühlung der elektrolythischen Flüssigkeit ausgestattet.
Im folgenden wird auf Fig. 8 und 9 Bezug genommen, in denen schematisch ein erfindungsgemaßer Halterungskorb für die Gelplatten dargestellt ist.
Dieser Korb 60 besteht im wesentlichen aus horizontalen Platten 62, die vertikal übereinander angeordnet und voneinander in einem Abstand gehalten sind, der gleich der Höhe einer vertikal angeordneten Gelplatte ist, wobei gewisse Platten 62 im Abstand von den Behälterwänden liegen und/oder perforiert sind, um den Durchtritt von Gasblasen zu ermöglichen, oder selbst ein Gitter bilden.
Die Platten 62 aus dielektrischem Material sind durch vertikale, gerade Elektroden 64 untereinander verbunden, die starre Stäbe aus elektrisch leitendem Material oder wieder einfach elektrisch leitende Drähte sein können, die zwischen den Platten gespannt sind, die in diesem Fall über starre, elektrisch nichtleitenden Stützen verbunden sind, welche die erwünschte mechanische Festigkeit besitzen und z.B. in den Ecken und in der Mitte der Platten 62 angeordnet sind.
Die Elektroden 64 sind in Form eines querliegenden, rechteckigen oder quadratischen Maschenkorbes angeordnet und haben im wesentlichen die Funktion von Ausgangslinien für die Äquipotentialflächen.
Die Gelplatten 66 werden auf den Platten 62 zwischen den Elektroden 64 derart vertikal angeordnet, daß die erwünschte Migrationsrichtung der Makromoleküle in den Gelplatten horizontal ist.
Bei Betrachtung der Fig. 8 und 9 kann man auf verschiedenen Nievaus des Korbes 60 eine ausreichend große Anzahl Gelplatten 66 anordnen, die auf jedem Nivau Seite an Seite liegen und z.B. zwei Plattenreihen bilden, wobei die Platten der einen Reihe in der Verlängerung der entsprechenden Platten der anderen Reihe liegen.
Falls erwünscht, können die Platten der einen Reihe im selben Sinne wie dem der anderen Reihe oder auch im entgegengesetzten Sinn orientiert werden. Im ersten Fall liegt die Potentialdifferenz zwischen den Enden des Korbes in der Größenordnung des Doppelten der an den Enden einer Gelplatte anzulegenden Potentialdifferenz. Im zweiten Fall ist die Potentialdifferenz zwischen den Enden des Korbes im wesentlichen gleich der Potentialdifferenz zwischen den Enden einer Gelplatte: z.B. wird eine Spannung V1 an die Elektroden 64&sub1; an den Enden des Korbes und eine Spannung V2 an die Elektroden 64&sub2; der querverlaufenden Mittelebene des Korbes angelegt, wobei die Differenz V1 - V2 gleich der anzulegenden Potentialdifferenz zwischen den Enden einer Gelplatte ist.
Die Fig. 10 zeigt eine schaubildliche Ansicht einer Ausführungsvariante des Korbes, der nur ein einziges, zwischen zwei Platten 62 aus dielektrischem Material begrenztes Niveau zum Beladen mit Gelplatten aufweist, von denen bloß die obere Platte perforiert ist, um den Durchtritt von Gasblasen zu ermöglichen, die durch die Elektrolyse in der elektrolythischen Flüssigkeit entstehen.
Die Fig. 11 zeigt schematisch einen Behälter, der zur Aufnhahme des Korbes gemaß Fig. 10 bestimmt ist.
Dieser Behälter 70 hat Quaderform und besteht aus einem horizontalen Boden 72 und vier vertikalen Wänden 74 und gegebenenfalls einer beweglichen horizontalen oberen Wand, die in der Zeichnung nicht dargestellt ist.
Der Boden 72 des Behälters weist eine Reihe im wesentlichen punktförmige Elektroden 76 aufs die einen quadratischen oder rechteckigen Maschenraster bilden, der demjenigen der Elektroden 64 des Korbes derart gleicht, daß die punktförmigen Elektroden 76 am Boden 72 des Behälters sich genau in der Verlängerung der vertikalen Elektroden 64 des Korbes befinden, wenn der Korb im Behälter angeordnet ist.
Wie in Fig. 12 gezeigt, können die unteren Enden der Elektroden 64 Mittel zum Kontakt mit den punktförmigen Elektroden 76 und zur Positionierung des Korbes im Behälter aufweisen.
Bei dem dargestellten Ausführungsbeispiel ist jede drahtförmige Elektrode 64 des Korbes an ihrem unteren Ende mit einem leitenden Stecker 78 verbunden, der eine halbkügelförmige Unterseite aufweist, die über die Unterseite der Platte 62 des Korbbodens vorragt und von einer kegelstumpfartigen Vertiefüng 80 eines elektrischen Kontaktes aufgenommen ist, der eine punktförinige Elektrode 76 am Behälterboden bildet.
Die punktförmigen Elektroden 76 sind an der Außenseite des Behälters durch den in Fig. 13 gezeigten und bereits anhand der Fig. 4 beschriebenen Schältkreis untereinander verbunden, der gesteuerte Verbindungsmittel zwischen den benachbarten Elektroden 76 aufweist. Die verschiedenen Reihen der Elektroden 76 sind durch Verbindungselemente 82 untereinander verbunden, die entweder Leiter mit einem elektrischen Widerstand von im wesentlichen null oder mit einem im wesentlichen unbegreiizten elektrischen Widerstand gesperrt sind. Desgleichen sind die verschiedenen Spalten der punktförmigen Elektroden 76 durch Verbindungselemente 84 desselben Typs wie die Elemente 82 untereinander verbunden. Außerdem sind Widerstände 86 oder gleichwertige Schaltelemente zwischen den verschiedenen Reihen der Elektroden 76 und Widerstände 88 oder gleichwertige Schaltelemente zwischen den verschiedenen Spalten der punktformigen Elektroden 76 vorgesehen.
Die Verbindungselemente 82 und 84 sind in folgender Weise gesteuert: Wenn die Verbindungselemente 82 einen elektrischen Widerstand von im wesentlichen null haben, haben die Verbindungselemente 84 einen im wesentlichen unbegrenzten elektrischen Widerstand, wodurch die Spalten der punktförmigen Elektroden 76 Äquipotentiallinien darstellen und zwei aufeinanderfolgende Spalten der Elektroden zwischen sich eine Potentialdifferenz besitzen, die vom Betrag des entsprechenden Widerstandes 88 bestimmt ist, wobei die Elektroden an der oberen linken Ecke und der unteren rechten Ecke des Schaltkreises an geeignete Potentialquellen angeschlossen sind. Da die Verbindungselemente 82 einen im wesentlichen unbegrenzten elektrischen Widerstand und die Verbindungselemente 84 einen Widerstand von im wesentlichen null haben, stellen anderseits die Reihen der punktförmigen Elektroden Äquipoteniallinien dar und weisen zwei aufeinanderfolgende Reihen zwischen sich eine Potentialdifferenz auf, die vom Betrag des entsprechenden Widerstandes 86 bestimmt ist.
Die vertikalen Wände 74 des Behälters 70 können (Fig. 11) vertikale lineare Elektroden 90 aufweisen, die z.B. von auf ihren Innenseiten aufgalvanisierten Leitern gebildet und untereinander sowie mit den Reihen bzw. Spalten der punktförmigen Elektroden 76 des Behälterbodens durch die Elemente 83, 84 verbunden sind,
Man versteht den Betrieb des in Fig. 11 gezeigten Behälters 70. Der mit der erwünschten Anaahl Gelplatten beladene Korb wird in den Behälter eingesetzt und darin dank der in Fig. 12 gezeigten Mittel automatisch positioniert, die zugleich die elektrische Verbindung zwischen den punktförmigen Elektroden 76 und den Elektroden 84 des Korbes sicherstellen. Durch Steuerung der Verbindungselemente 82 und 84 wird zuerst die Migration der Makromoleküle in den Gelplatten parallel zur Plattenlänge und dann durch Umkehren der Rollen der Verbindungselemente 82 und 84 die Migration der Makromoleküle quer zur Dicke der Gelplatten und ihre Übertragung auf die zugeordneten Membranen gewährleistet. Die Reihen bzw. danach die Spalten der punktförmigen Elektroden 76 sowie die linearen Elektroden 90 der Vertikalseiten des Behälters stellen ebene Äquipotentiafflächen dar, die, wie bereits erläutert, zuverlässige und haargenaue Messungen ermöglichen.
In Fig. 11 bezeichnet der Pfeil mit voller Linie die Richtung, in der die Gelplatten orientiert sind, und die strichlierten Pfeile die Richtungen des elektrischen Feldes zur Migration bzw. zur Übertragung der Makromoleküle.
Die Verlagerung des Korbes im Behälter 70 erfolgt durch vertikale Verschiebung quer zur offenen Oberseite des Behälters 70 z.B. mittels eines Roboterarmes, der das Einsetzen des Korbes an einer Belade- und Entladestation ermöglicht, wo man den Korb vorbereiten kann, wahrend ein anderer Korb auf dem Weg zur Behandlung im Behälter 70 ist.
Bei einer in Fig. 13 gezeigten einfacheren Ausführungsvariante weist der Boden 92 des Behälters punktförmige Elektroden 94 auf, die gemaß einem quadratischen Maschenraster angeordnet sind und in ihnen Reihen bilden, die durch im Behälterboden eingebettete Leiter untereinander verbunden sind. Diese Reihen entsprechen jeweils den Reihen Elektroden 64 eines Korbes und sind an ihren Enden mit vertikalen Elektroden 96 verbunden, welche auf zwei einander gegenüberliegenden Vertikalseiten 98 des Behälters gebildet sind. Diese Elektroden 94 und 96 stellen mit den geraden Elektroden 64 eines Korbes Äquipotentialflächen dar, die senkrecht zur erwünschten Migrationsrichtung der Makromoleküle verlaufen.
Man verfährt nun in der folgenden Weise: Der Korb wird derart im Behälter angeordnet, daß die in ihrn enthaltenen Gelplatten sich senkrecht zu den Äquipotentialflächen erstrecken, die von den linearen Elektroden 94 und 96 definiert sind. Die Elektrophorese ermöglicht also, die Migration der Makromoleküle in den Gelplatten parallel zur Plattenlänge sicherzustellen. Man kann sodann den Korb dem Behälter entnehmen, diesen um 90º um eine vertikale Achse drehen, danach wieder derart in den Behälter einbringen, daß die Gelplatten parallel zu den Äquipotentialflächen sind, die von den linearen Elektroden 94 und 96 definiert sind. Die Elektrophorese verursacht also die Migration der Makromoleküle in der Dicke der Gelplatten und ihre Übertragung auf die zugeordneten Membranen.
Die beiden strichlierten Pfeile zeigen die Längsorientierungen der Gelplatten in ihren beiden betreffenden Stellungen der Migration und der Übertragung der Makromoleküle, und die Pfeile mit vollen Linien entsprechen der Orientierung des elektrischen Feldes zwischen den Elektrodenebenen.
Bei einer Variante kann man zwei Behälter wie in Fig. 3 vorsehen, die in unmittelbarer gegenseitiger Nähe montiert sind, und in dem einen die Migration der Makromoleküle über die Lange der Gelplatten und in dem anderen die Übertragung der Makromoleküle auf die zugeordneten Membranen durchführen.
Die beiden anderen Vertikalseiten 100 des Behälters nach Fig. 13 sind elektrodenfrei.
Zur Festlegung der Potentiale der verschiedenen Elektrodenebenen kann man Operationsverstärker verwenden, die von einem Informationsverarbeitungssystem gesteuert sind. Es ist dann sehr einfach, zwischen den Elektrodenebenen zeitlich und räumlich variable elektrische Felder gemaß zyklischer Regeln oder nicht zu erzielen, elektrische Felder vom Impulstyp anzuwenden, usw.
Wie auf der rechten Seite der Fig. 12 gezeigt, sind z.B. Operationsverstärker 102 jeweils an ihrem Ausgang an eine Reihe der Elektroden 76 angeschlossen. Einer ihrer Eingänge ist mit einem Ausgang einer Steuerschaltung 104 verbunden, während ihr anderer Eingang geerdet ist.
Da die Elektroden 76 einen quadratischen Raster bilden, ermöglicht ein Mehrfach-Umschalter 106 das Anlegen der Ausgangsspannungen der Verstärker 102 entweder an die Reihen oder die Spalten der Elektroden 76.
In Fig. 14 sind schematisch zylindrische Röhren 108 oder Manschetten gezeigt, welche die vertikalen Elektroden 64 eines Korbes umgeben. Diese an ihren Enden offenen Röhren 108 bestehen aus dielektrischem Material und sind perforiert oder porös, um den Durchtritt der elektrophoretischen Flüssigkeit quer durch ihre Wand in Richtung zu den Elektroden 64 zu erlauben. Diese Röhren bilden zugleich Blasengetter, in denen Gasblasen, die sich durch die Elektrolyse bilden, zur freien Oberfläche der Flüssigkeit geleitet werden, ohne in Kontakt mit den Gelplatten zu gelangen. Sie dienen auch als Schutz für die Elektroden 64 und verhindern, daß die Gelplatten 66 in Kontakt mit den Elektroden kommen. Außerdem kann man daher Elektroden verwenden, die aus einem leitenden Metall hergestellt sind, das weniger teuer als Platin ist. Wenn sich gegebenenfalls durch die Elektrolyse Niederschläge an den Elektroden bilden, wird durch die Röhren vermieden, daß diese Niederschläge in das Flüssigkeitsbad gelangen können, in dem sich die Gelplatten befinden.
Im vorstehenden sind Ausführungsformen der Erfindung beschrieben worden, die anwendbar sind, wo bei vertikalen Gelplatten die beiden Richtungen der Migration und der Übertragung der Makromoleküle horizontal sind. Es versteht sich, daß die Erfindung auch den Fall deckt, wo die Gelplatten vertikal, die Richtung der Migration der Makromoleküle in den Gelplatten vertikal und ihre Richtung der Übertragung auf die zugeordneten Membranen horizontal sind. Hiefür genügt die Verwendung von Körben, in denen die Elektroden 64 horizontal verlaufen.

Claims

1. Verfahren zur multiplen Elektrophorese zur kontrollierten Migration von Makromolekülen in Gelplatten, welches aufweist: das Eintauchen der Gelplatten (12) in einen Behälter mit einer elektrophoretischen Flüssigkeit, wobei diese Platten entlang eines Randes Makromoleküle enthalten und zumindest eine Zelle bilden, in welcher sie parallel und in Abstand voneinander angeordnet sind, und das Anlegen elektrischer Potentiale an langgestreckte Elektroden (20), die zueinander und zu den in der Flüssigkeit eingetauchten Gelplatten (12) parallel sind und entlang zwei gegenüberliegender Enden der Plattenzelle in zwei normal auf die Platten stehenden Ebenen angeordnet sind, wobei die in einer Ebene liegenden Elektroden auf gleichem Potential liegen, um zwischen diesen Ebenen ein elektrisches Feld zur Migration von Makromolekülen in den Gelplatten zu erzeugen, dadurch gekennzeichnet, daß

- dieser Behälter weitere langgestreckte Elektroden (20) aufweist, welche zu den oben genannten Elektroden parallel und so zwischen den Enden der Plattenzelle angeordnet sind, daß alle Elektroden an den Schnittlinien zweier Reihen von Ebenen angeordnet sind, wobei die Ebenen einer ersten Reihe normal auf die Platten und eine erste Migrationsrichtung stehen und die Ebenen der zweiten Reihe parallel zu den Platten sind,

- und daß das Verfahren das Anlegen elektrischer Potentiale an die Elektroden (20) aufweist, um in den Gelplatten und in der elektrophoretischen Flüssigkeit zuerst ein erstes elektrisches Feld (E1), das in allen Punkten im wesentlichen parallel zu der ersten Migrationsrichtung ausgerichtet ist, und dann ein zweites elektrisches Feld (E2) zu erzeugen, welches parallel zu einer zweiten Migrationsrichtung und normal auf die Gelplatten ausgerichtet ist,

- wobei das erste elektrische Feld (E1) durch Anlegen unterschiedlicher elektrischer Potentiale an unterschiedliche Elektrodenebenen der ersten Reihe erzeugt wird und die in einer Ebene der ersten Reihe enthaltenen Elektroden (20) auf gleichem elektrischen Potential liegen,

- und das zweite elektrische Feld (E2) durch Anlegen unterschiedlicher elektrischer Potentiale an unterschiedlichen Elektrodenebenen der zweiten Reihe erzeugt wird und die in einer Ebene der zweiten Reihe enthaltenen Elektroden (20) auf gleichem elektrischen Potential liegen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite elektrische Feld (E2) zum Überführen der Makromoleküle auf Membranen (22) verwendet wird, die auf den Gelplatten angeordnet sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Ebenen der Elektroden entlang der Gelplatten (12) und zwischen diesen Gelplatten in regelmaßigen Abständen angeordnet sind.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die elektrischen Potentiale gleiclimaßig auf die Elektrodenebenen aufgeteilt sind, um in den Gelplatten (12) ein gleichmaßiges elektrisches Feld zu erzeugen.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Potentialaufteilung auf die Elektrodenebenen verändert wird, um die Amplitude und/oder die Richtung des elektrischen Feldes in den Gelplatten (12) zu verändern.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die zeitlichen Anderungen der elektrischen Potentialdifferenzen zwischen den Elektrodenebenen synchron erfolgen, um eine zeitliche Anderung der Amplitude des elektrischen Feldes herbeizuführen ohne seine Verteilung im Raum zu verändern.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es ein örtliches Verändern der an die Elektrodenebenen angelegten elektrischen Potentiale aufweist, um die Intensität des elektrischen Feldes örtlich zu verändern.

8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es ein zeitlich vorübergehendes oder zyklisches Verändern der elektrischen Potentialdifferenzen zwischen den Elektrodenebenen aufweist, um insbesondere ein Abtasten der Elektrodenebenen durch eine Potentialdifferenz zu ermöglichen.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest zwei Zellen (46) mit Gelplatten Seite-an-Seite in dem Behälter angeordnet und in einer Richtung parallel oder normal zu der gewünschten Migrationsrichtung miteinander verbunden sind.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die elektrischen Felder in den Platten der unterschiedlichen Zellen (46) in unterschiedlicher Weise verändert werden.

11. Vorrichtung zur multiplen Elektrophorese zur kontrollierte Migration von Makromolekülen in Gelplatten, die aufweist: einen Behälter, in welchem die Gelplatten (12) aufgenommen werden können, Mittel (24, 26) zur Halterung der Gelplatten (12), welche parallel und in Abstand voneinander gehalten werden und zumindest eine Zelle bilden, eine Mehrzahl von langgestreckten Elektroden (20), die zueinander und zu den Platten (12) parallel sind und entlang zweier gegenüberliegender Enden der Plattenzelle in zwei Ebenen normal auf die Platten angeordnet sind, Mittel zum Verbinden der Elektroden einer Ebene, durch welche sie auf gleichem Potential gehalten werden, und Mittel (36) zum Anlegen elektrischer Potentiale an diese Elektroden, um zwischen diesen beiden Ebenen in den Gelplatten ein elektrisches Feld zur Migration von Makromolekülen zu erzeugen, dadurch gekennzeichnet, daß sie aufweist:

- weitere langgestreckte Elektroden (20), die parallel zu den oben genannten Elektroden und so zwischen den Enden der Plattenzelle in dem Behälter angeordnet sind, daß alle Elektroden an den Schnittlinien von zwei Reihen von Ebenen liegen, wobei die Ebenen einer ersten Reihe normal auf die Platten und eine erste Migrationsrichtung der Makromoleküle stehen und die Ebenen der zweiten Reihe parallel zu den Platten sind,

- Mittel (32) zum Verbinden der Elektroden (20) einer Ebene der ersten Reihe, welche sie auf einem gemeinsamen elektrischen Potential halten, und Mittel (28, 30) zum Verbinden der Elektroden unterschiedlicher Ebenen der ersten Reihe, welche das Herstellen einer Potentialdifferenz zwischen zwei aufeinanderfolgenden Ebenen der ersten Reihe ermöglichen,

- Mittel (32) zum Verbinden der Elektroden (20) einer Ebene der zweiten Reihe, welche sie auf einem gemeinsamen elektrischen Potential halten, und Mittel (28, 30) zum Verbinden der Elektroden unterschiedlicher Ebenen der zweiten Reihe, welche das Herstellen einer Potentialdifferenz zwischen zwei aufeinanderfolgenden Ebenen der zweiten Reihe ermöglichen,

- Steuermittel zum Verändern der Potentialverteilung an den Elektroden der Ebenen, um in den Gelplatten und in der elektrophoretischen Flüssigkeit zuerst ein erstes elektrisches Feld (E1), welches parallel zu der ersten Migrationsrichtung ausgerichtet ist, und danach ein zweites elektrisches Feld (E2) zu erzeugen, welches parallel zu einer zweiten Migrationsrichtung ist, die Normal auf die Gelplatten ausgerichtet ist.

12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß jede Gelplatte (12) einer Membran (22) zugeordnet ist, auf welche die Makromoleküle unter der Wirküng des zweiten elektrischen Feldes (E2) übertragen werden.

13. Vorrichtung nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektroden (20) entlang der Gelplatten und zwischen diesen Gelplatten in regeimaßigen Abständen angeordnet sind.

14. Vorrichtung nach einen der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel (30) zum Verbinden zwei aufeinanderfolgender Elektroden einer Ebene vom Typ mit steuerbarer Leitfähigkeit sind, die von einem im wesentlichen widerstandslosen leitfähigen Zustand auf einen leitfahigen Zustand mit einem bestimmten Widerstand größer null veränderbar ist.

15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel (30) zum Verbinden durch Mittel (36) gesteuert werden, welche allen Elektroden gemeinsam sind, die in ein und derselben Reihe parälleler Ebenen liegen.

16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel (28, 30, 32) zum Verbinden der Elektroden und die Steuermittel (36) von zumindest einer dielektrischen Platte gehalten werden, an welcher die Elektroden (20) mit ihren Enden befestigt sind.

17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß sich jede Gelplatte (12) in einem Behälter zwischen zwei Gruppen koplanarer Elektroden befindet.

18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Haltemittel zum Aufnehmen zumindest zweier Zellen (46) mit Gelplatten geeignet sind, welche Seite-an-Seite angeordnet und zumindest in einer Richtung parallel zu den Platten verbunden sind, und daß eine Elektrodenreihe (48) der vorhin genannten Art, welche Mittel zum Steuern und Mittel zum Verbinden von Elektroden aufweist, jeder Plattenzelle (46) zugeordnet ist, um in den Platten dieser Zellen elektrische Felder zu erzeugen, die gewünschtenfalls gleich oder unterschiedlich, miteinander verbunden oder voneinander unabhänglg sind.

19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel zu Steuern mittels eines Computers automatisier- und steuerbar sind.

20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Gelplatten (66) in dem Behälter (70) vertikal zwischen den Elektroden (64) angeordnet sind.

21. Vorrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektroden (64) Stäbe eines beweglichen Gitters (60) sind, welches die Halterungsmittel für die Gelplatten (66) bildet.

22. Vorrichtung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die unteren Enden der Elektroden (64) Mittel zum Anschließen dieser Elektroden (76, 94) aufweisen, welche von einer Wand (79, 92) am Boden des Behälters gehalten sind.

23. Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel (70) zum Anschließen ebenso Mittel zum Positionieren des Gitters (60) in dem Behälter bilden.

24. Vorrichtung nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektroden (76) der Bodenfläche (72) des Behälters im wesentlichen punktförmig sind.

25. Vorrichtung nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektroden (94) der Bodenfläche (92) des Behälters im wesentlichen punktförmig sind und untereinander mittels paralleler Leiter verbunden sind, welche normal zu der gewünschten Migrationsrichtung der Makromoleküle in den Gelplatten angeordnet sind.

26. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 22 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Vertikalwände (74, 98, 100) des Behälters lineare Elektroden (90, 96) aufweisen, welche normal zu der gewünschten Migrationsrichtung der Makromoleküle stehen und an gesteuerte Mittel zum Verbinden angeschlossen sind, die es ermöglichen, zwischen diesen selektiv Potentialdifferenzen herzustellen oder sie auf gleichem Potential zu halten.

27. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß das Gitter (60) zumindest auf einem Niveau zwei Reihen von Gelplatten (66) aufweist, bei welchen die Platten einer Reihe im wesentlichen in Verlängerung der Platten der anderen Reihe angeordnet und entweder gleich- oder gegensinnig ausgerichtet sind.

28. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektroden (64) von zylindrischen Röhren (108) aus dielektrischem Material umgeben sind, welches löchrig oder porös ist und einen Getter für Blasen bildet.