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Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren von und
Vorrichtungen für die preparative Elektrophorese und
insbesondere solche Verfahren und Vorrichtungen, die in einem
großen Maßstab zur Gewinnung von gelösten Makromolekülen
verwendet werden können.
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Die analytische elektrophoretische Trennung von Proteinen und
anderen Verbindungen, daß heißt, die Trennung nach Ladung in
einem elektrischen Feld wird normalerweise in einer Säule mit
antikonvektivem Medium, z. B. einen chemischen Gel,
durchgeführt. Die Proben werden auf die Oberfläche des Gels
aufgetragen, eine elektrische Spannung wird angelegt und nach
einem Zeitintervall kommen die getrennten Komponenten am Boden
der Gelsäule heraus. Das Ausmaß der Arbeitsweise ist durch den
Querschnitt des Gels begrenzt, das nicht die Kapazität des
Systems überschreiten darf, um die Hitze, die durch den Strom
erzeugt wird, zu entfernen. Dies kann nur in einem Ausmaß von
wenigen Quadratzentimetern aufgrund der sehr geringen
Wärmeleitfähigkeit des Gels liegen.
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Ein Beispiel von analytischer Geltrennung zeigt die WO-A-
87/00635. In dieser Druckschrift wird vorgeschlagen, die
Polarität der elektrischen Spannung abwechselnd umzukehren, so
daß alle Moleküle, die in den Poren des Gels eingeschlossen
wurden, eine Möglichkeit erhalten, dieses zu verlassen.
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Es ist ebenfalls bekannt, eine elektrophoretische Trennung
ebenso zwischen freifließenden Strömen entweder mit freien oder
fixierten Begrenzungen durchzuführen. Dieses Verfahren wird
verwendet, wenn große Mengen an gelösten Makromolekülen
gewonnen werden sollen. Bei elektrophoretischer Trennung mit
freien Begrenzungen werden makromolekulare Spezies in Lösung,
einschließlich kolloidale Lösungen, getrennt wenn ein Strom der
Lösung zwischen geladenen Elektroden geführt wird. Der Strom
wird dann, ohne vorgemischt zu werden, in eine Vielzahl von
Abschnitten mit verschiedenen Anteilen der molekularen Spezies,
die in dem Originalstrom vorhanden ist, geteilt (vergleiche US-
Patentbeschreibung 2 878 178 und Britische Patentbeschreibung 1
255 418). Bei elektrophoretischer Trennung mit fixierten
Begrenzungen bewirkt eine semipermeable Membran die Trennung
zwischen zwei Strömen von Flüssigkeiten, zwischen denen
wenigstens eine molekulare Spezies unter dem
elektrophoretischen Einfluß wandert (vergleiche US-
Patentbeschreibung Wo 79/00002 und US-Patentbeschreibung 3 989
613). Die Membran bewirkt die Verhinderung der Mischung des
Stroms infolge der konvektiven Ströme und in allen diesen
früheren Anordnungen sind die Löcher der Trennungsmembran
relativ groß, verglichen mit der Größe der zu trennenden
Teilchen.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Elektrophorese mit
fixierten Begrenzungen unter Verwendung einer Membran
durchgeführt, deren Poren größer sind als, aber nahekommend der
Größe von wenigstens einem der gelösten Stoffe, die getrennt
werden sollen. Ein Problem jedoch, das eine Erfahrung des
Erfinders bei Verwendung solch einer Membran ist, ist die
Verschmutzung und Verstopfung der Membranporen. Die Wirksamkeit
des Verfahren hängt ab von:
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1. dem maximalen Kontakt der behandelten Lösung mit der
Membranoberfläche, und
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2. der unverminderten Durchlässigkeit der Membranporen, um den
beabsichtigten Durchfluß der fraglichen Makromoleküle zu
gewährleisten.
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Auf der anderen Seite hängt der maximale Kontakt von der
gleichmäßigen Verteilung des Flüssigkeitsflusses in den Räumen
zwischen den Membranen ab. Aufgrund des relativ langsamen
Durchflusses der Flüssigkeit bei der elektrophoretischen
Trennung kann eine Vervielfältigung des Flusses durch parallele
Räume in einem Stapel von elektrophoretischen Membranen ebenso
wie die Sicherstellung eines einheitlichen Flusses des
Flüssigkeitsfilms entlang jeden Raumes schwierig sein, wegen
einer bevorzugten Kanalisierung infolge von leichten
Unterschieden in der Geometrie, dem Luftabschluß und ähnlichen
Fehlern.
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Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur Trennung
von wenigstens zwei makromolekularen gelösten Stoffen veranlaßt
durch elektrophoretische Wanderung von wenigstens einem
gelösten Stoff aus einem ersten Lösungsmittelstrom zu einem
zweiten Lösungsmittelstrom in einer Vorrichtung bestehend aus
einem Gehäuse, einem Paar Elektroden, die innerhalb des
Gehäuses positioniert sind, jede Elektrode eines Paares ist
angrenzend an entgegengesetzten Enden des Gehäuses positioniert
und jede ist umgeben von Vorrichtungen, um einen Fluß eines
geeigneten Puffers an der Elektrode vorbeizuleiten, einer
ersten Einlaßöffnung, durch die der erste Lösungsmittelstrom in
das Gehäuse eingeführt wird, und einer Auslaßöffnung dafür,
einer zweiten Einlaßöffnung, durch die der zweite
Lösungsmittelstrom in das Gehäuse eingeführt wird, und eine
Auslaßöffnung dafür, eine Vielzahl von elektrophoretischen
Membranen, die sich, im wesentlichen parallel davon, getrennt
angeordnet, quer im Gehäuse zwischen den Elektroden angeordnet,
erstrecken, die Membranen dienen zur Begrenzung eines ersten
Lösungsmittelweges für den ersten Lösungsmittelstrom und eines
separaten zweiten Lösungsmittelweges für den zweiten
Lösungsmittelstrom, das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
daß die Membran Poren mit einer Größe größer als, aber
nahekommend der Größe von wenigstens einem der gelösten Stoffe,
besitzt und das die Spannung über den Elektroden periodisch
gestoppt oder umgekehrt wird, während die Nettobewegung des
gelösten Stoffes in der gewünschten Richtung aus dem ersten
Lösungsmittelstrom in den zweiten Lösungsmittelstrom
aufrechterhalten wird und während der erste Lösungsmittelstrom
im ersten Lösungsmittelweg und der zweite Lösungsmittelstrom im
zweiten Lösungsmittelweg aufrechterhalten wird.
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Ein weiteres Problem bei der bekannten elekrophoretischen
Trennung mit fixierten Begrenzungen ist die Schwierigkeit in
der Aufrechterhaltung eines freien Lösungsmittelflusses
zwischen benachbarten Membranen. Unter einem bevorzugten
Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung
bereit, um auf wirksame Weise benachbarte Membranen räumlich zu
trennen, während ein freier Fluß des gelösten Stoffes
dazwischen gewährt wird.
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Eine weitere Schwierigkeit bei bekannten elektrophoretischen
Trennungsvorrichtungen mit fixierten Begrenzungen sind noch
immer die physikalischen Probleme des Füllens, des Leerens, der
Reinigung und der Zusammenbau des Gehäuses, das die Elektroden
und Membranen enthält. Üblicherweise wird ein solches Gehäuse
im wesentlichen in einem Stück mit verbundenen
Vorratsbehältern, Pumpen, Kühlapparaten und dergleichen
gebildet, was seinerseits das Gehäuse schwierig in der
Handhabung macht. Unter einem weiteren bevorzugten
Gesichtspunkt zielt die vorliegende Erfindung darauf ab, diese
physikalischen Handhabungsprobleme mittels Durchführung der
Elektrophorese in einer verbesserten Vorrichtung zu überwinden.
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In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das
Lösungsmittel in dem ersten Lösungsmittelstrom veranlaßt, in
einer pilsierenden Art und Weise zu fließen.
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Das Pulsieren des ersten Lösungsmittelstroms kann durch
abwechselndes Verschließen elastischer Schläuche, die von einer
peristaltischen Pumpe zu oder von der elektrophoretischen Zelle
führen, herbeigeführt werden. Das abwechselnde Verschließen
solcher elastischen Schläuche kann direkt oder indirekt durch
einen geeigneten Nocken, Exzenter und dergleichen Mittel
herbeigeführt werden. In einer alternativen bevorzugten
Ausführungsform wird eine Pumpe vorzugsweise am unteren Ende
der Elektrophoresezelle abwechselnd in Bewegung gesetzt oder
mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten befähigt, um den
benötigten pulsierenden Fluß des ersten Lösungsmittelstroms zu
bewirken.
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Die Arbeitsweise der oben erwähnten bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung kann leicht verstanden werden in Bezug auf eine
Zelle, die nur den ersten und zweiten Lösungsmittelstrom
besitzt, wobei der erste Lösungsmittelstrom, soweit die
gelösten Moleküle betroffen sind, oberhalb einer
Trennungsmembran und der zweite Lösungsmittelstrom ist
unterhalb davon, ist. In solch einer Anordnung können fünf
Phasen der elektrophoretischen Wanderung unterschieden werden:
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1. obere Flüssigkeitsphase,
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2. obere Begrenzung mit Membran,
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3. Membrangel,
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4. untere Begrenzung,
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5. untere Flüssigkeitsphase.
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Die optimalen Anforderungen für jede dieser Phasen sind
unterschiedlich:
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1. Die elektrophoretische Wanderung in der oberen Flüssigkeit
wird durch einen schnellen turbulenten Fluß gestört. Auf der
anderen Seite soll eine Flußrate so langsam sein, daß alle
wichtigen Komponenten zum nächstgelegenen Teil der Membran
wandern und ein großer entfernt liegender Teil der Membran
nicht an dem Verfahren beteiligt sein soll. Auf diese Weise ist
in dieser Phase ein bevorzugtes Fließmuster schrittweise, mit
einem Schritt, der die verwendete Lösung durch eine frische
ersetzen soll, gefolgt von einer stationären Periode, die die
Wanderung zu der Membran bewirkt. Das optimale Volumen und die
Dauer eines jeden Zyklus hängt von den vorherrschenden
Bedingungen ab.
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2. Die obere Flüssigkeits-/Membranbegrenzung kann durch
versperrende Moleküle unter Bildung eines unlöslichen Filmes
auf der Oberfläche blockiert werden, ein Zustand, der in
Filtrationsverfahren "Fouling" genannt wird. Wenn nötig, kann
dem entgegengewirkt werden, durch zeitweilige Umkehrung des
elektrischen Feldes gegen Ende eines jeden Zyklus, um die
aggregierten Moleküle abzulösen. Die Frequenz und Dauer der
Feldumkehr muß experimentell bestimmt werden und kann manuell
oder automatisch durch Beobachtung der Änderung der
elektrischen Leitfähigkeit der Stapel während jeder Phase oder
jedes Zyklus kontrolliert werden.
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3. Innerhalb der Membran ist der Transport hauptsächlich
abhängig von den Eigenschaften des Stroms und der
Membranzusammensetzung und ist von der Fließbewegung isoliert.
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4. In der unteren Fließphase ist ein starker Querstromfluß
erwünscht, weil er eine Molekülanhaftung an begrenzende
Membranen verhindert, die das Lösungsmittels von den
Pufferströmen trennen, und er die Möglichkeit zur
Wärmeableitung mit der Hilfe eines externen Wärmeaustauschers.
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Der pulsierende Fluß wird einigermaßen die
Oberflächenverschmutzung der Membranen vermindern, zusätzlich
jedoch kann die Form des elektrischen Feldes, dieser Erfindung
gemäß, die Membranverstopfung verhindern. Während der
Mechanismus, der periodischen Umkehr der Polarität der
elektrophoretischen Zelle ziemlich komplex ist und unter
anderem durch die Brownsche Molekularbewegung und Absorption
auf die Membran beeinflußt wird, ist zu berücksichtigen, daß
die Wirkung mit einem Sieb verglichen werden kann, in dem das
Sieben der Teilchen durch Vibration des Siebes begünstigt wird.
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Aneinanderliegende Membranen in der Vorrichtung, in der die
vorliegende Methode durchgeführt wird, sind vorzugsweise durch
ein Paar von im Wesentlichen parallelen Gittern getrennt. In
einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die
parallelen Gitter verflochten und so ausgewählt, daß deren
Maschen nicht miteinander ineinandergreifen. Üblicherweise
werden die Räume zwischen ineinanderliegenden Membranen durch
dazwischenliegende Dichtungen und Maschensiebe
aufrechterhalten, die das Haften der Membranen aneinander
verhindern. Jedoch wurde beobachtet, daß, ohne die Hilfe von
hohem positivem Druck-, die Membranen dazu neigen, auf der
Oberfläche der Maschen zu haften und so eine beinahe
vollständige Hemmung des Flusses bewirken. Es stellte sich
heraus, daß die Verwendung von wenigstens zwei
aneinanderliegenden Gittern, die den Raum zwischen den Membran
genau bestimmen, den Fluß um einen großen Faktor verbessert.
Weitere Verbesserungen wurden nach den Beobachtungen
eingeführt, daß zwei parallel angeordnete Gitter mit derselben
Maschengröße dazu neigen, sich teilweise miteinander zu
verflechten, was eine Wechselwirkung mit dem freien Fluß zur
folge hat. Dies wird vorzugsweise dadurch verhindert, daß
sichergestellt ist, daß die Maschen von benachbarten Gittern
nicht identisch sind. Zum Beispiel kann eine quadratische
Masche mit einer diagonalen Masche alternieren oder
aneinanderliegende Gitter können mit verschiedenen
Maschengrößen hergestellt sein (z. B. mit 0,3 und 0,4 bis 0,5 mm
Öffnungen). Vorzugsweise sind die beiden Gitter in einer
einzelnen gegossenen Dichtung enthalten, um die Handhabung auf
ein Mindestmaß zu verringern.
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In einem herkömmlichen Filterstapel wird die Flüssigkeit mit
hoher Kraft gepumpt, um einen Querstromfluß in den Räumen
zwischen den Membranen zu schaffen, wobei der gesamte Stapel
zwischen starren Wänden eingeklemmt ist, um ein
Auseinanderreißen durch den hohen inneren Druck zu vermeiden.
Diese Anordnung ist nicht für die Elektrophorese geeignet, weil
die tragenden Wände mit dem elektrischen Feld über dem Stapel
und mit dem Entfernen des Gases, das durch die Elektroden
gebildet wird, nicht vereinbar wären. In der vorliegenden
Erfindung wird der Stapel vorzugsweise kollabiert gehalten,
ohne Hilfe von externen Stützen, durch Anordnung der Pumpen an
der unteren Seite, d. h. an der unteren Seite der
Elektrophoresezelle, so daß der Fluß durch Ansaugen bewirkt
wird, während die Flüssigkeit passiv in den Stapel eintritt, um
die Flüssigkeit zu ersetzen, die durch die Pumpen entfernt
wird. Auf der anderen Seite wird die externe Pufferzirkulation
durch einen positiven Druck aufrechterhalten, was auch zum
Erhalt des Stapels in seinem komprimierten Zustand beiträgt.
Alternativ können die Kammern, die den Zirkulationspuffer
transportieren, unter Druck gesetzt werden und der Fluß durch
den Stapel wird durch eine positive Druckzuführung bewirkt, der
geringer als der externe Pufferdruck gehalten wird, die
Aufrechterhaltung des freien Flusses und die gleichmäßige
Verteilung der Flüssigkeit innerhalb des Stapels ist für die
wirksame Trennung erforderlich. Verlängerte flexible Einlaß-
und Auslaßschläuche bilden vorzugsweise die Puffer- und
Lösungsmittelströme und werden bereitgestellt, um die
Elektrophoresezelle und die Zufuhr- und/oder Auslaßbehälter für
die Puffer- und Lösungsmittelströme zu verbinden. Die Einlaß-
und Auslaßschläuche sind vorzugsweise miteinander verbunden, um
einen einzelnen Nabel zu bilden. Diese Anordnung erleichtert
die freie Bewegung der Zelle im Hinblick auf den restlichen
Teil der Vorrichtung. Die Zelle, die so mit dem Rest der
Vorrichtung verbunden ist, ist vorzugsweise so montiert, daß
sie wenigstens in eine Ebene geneigt werden kann, was das
Füllen und Leeren der elektrophoretischen Zelle erleichtert.
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Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise in
einer Vorrichtung für die elekrophoretische Trennung von
molekularen Spezies, die in einer Flüssigkeit in wenigstens
zwei Komponentengruppen vorhanden sind, durchgeführt, bestehend
aus einem Gehäuse, einem Paar Elektroden, die innerhalb des
Gehäuses positioniert sind, jede Elektrode eines Paares ist
angrenzend an entgegengesetzten Enden des Gehäuses positioniert
und jede ist umgeben von Vorrichtungen, um einen Fluß eines
geeigneten Puffers an der Elektrode vorbeizuleiten, einer
Vielzahl von semipermeablen Membranen, die in wenigstens zwei
Gruppen geteilt sind, die Membranen jeder Gruppe sind im
wesentlichen parallel angeordnet, räumlich über das Gehäuse
zwischen den Elektroden angeordnet liegend, um eine Vielzahl
von Kammern zu bilden, jede Gruppe von Kammern ist von
angrenzenden Gruppen von Kammern durch Barrieren getrennt, die
nicht den Durchfluß eines elektrischen Stroms zwischen den
Elektroden, aber wirksam den Flüssigkeitsfluß durch diese
unterbricht, einem Einlaß in jede der Kammern von einer Gruppe
davon, einem Auslaß aus jeder der Kammern einer Gruppe davon,
jede der Kammern einer Gruppe ist parallel oder in Serie mit
einer entsprechenden Kammer der oder jeder der anderen Gruppe
verbunden, so daß die Flüssigkeit von den jeweiligen Einlässen
zu den jeweiligen Auslässen geführt werden kann.
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In der bevorzugten Vorrichtung zur Durchführung dieser
Erfindung verringern sich die Porengrößen der Membranen in
jeder Gruppe in der Richtung der Wanderung der zu trennenden
molekularen Spezies. Im allgemeinen werden alle der zu
trennenden molekularen Spezies in einen ersten flüssigen Strom
eingeführt, der durch eine erste Kammer jeder Gruppe fließt.
Die molekulare Spezies wird unter dem Einfluß des
elektrophoretischen Potentials in eine zweite, dritte usw.
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fließen, eine der Kammern entspricht der jeweiligen molekularen
Größe jeder der Spezies. Es liegt jedoch innerhalb des Aspekts
dieser Erfindung, die molekulare Spezies in den flüssigen
Strom, der durch zwei oder mehrere dieser Kammern einer jeden
Gruppe davon fließt, einzuführen.
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Die Kammern werden vorzugsweise gebildet aus kombinierten
Dichtungen und Gittern, die zwischen den aneinanderliegenden
Membranen angeordnet sind, den Einlaß- und Auslaßpassagen und
den Passagen, die die entsprechenden Kammern der verschiedenen
Gruppen verbinden, die durch die aneinanderstoßenden Membranen
und Dichtungen führen.
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Die verwendeten Membranen werden vorzugsweise aus einem
Polyacrylamidgel gebildet. Ein Vorteil von Polyacrylamidgel als
eine Matrix für die elektrophoretische Trennung ist die leichte
Herstellung und die Kontrolle der Porengröße innerhalb weiter
Grenzen. Das Polymer ist jedoch zu spröde, um als dünne
Membranen gehandhabt zu werden. Dies kann durch Verwendung von
Blättchen aus porösem Material, wie z. B. mit Polyacrylamid
imprägnierten Papier oder Gewebe überwunden werden.
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In der vorliegenden Erfindung sind die Elektroden vorzugsweise
mit einem Mantel von fließendem Puffer umgeben, der von und zu
einem entfernten Tank oder Tanks gepumpt wird, wobei Wärme und
Gasblasen bei diesem Verfahren entfernt werden. Die Elektroden
können aus dünnen Platindraht hergestellt sein, aber es können
auch Plättchen oder Folien eines geeigneten Materials verwendet
werden. Die Puffer können von den Flüssigkeitsströmen, die die
zu trennenden molekularen Spezies enthalten, durch eine Membran
einer genügend kleinen Porengröße getrennt werden. Alternativ
können, im Falle von Drahtelektroden, die Elektroden jede für
sich durch Hohlfaser oder Schläuche aus semipermeablem Material
umhüllt sein, die den zirkulierenden Puffer mit sich führen.
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Wenn eine vollständige Trennung in einem einzelnen Durchfluß
nicht ausgeführt werden kann, kann die Beladungslösung
rezirkuliert werden. In diesem Fall ist es wünschenswert, das
Vermischen der schwächeren Rückführungslösung mit dem
angereicherten Rest in dem Vorratsbehälter zu verhindern. Eine
Anreicherung auf der Oberfläche der restlichen Flüssigkeit kann
verwendet werden, um die kinetische Energie des
zurückfließenden Stromes zu verteilen, der dann schonend über
die restliche Lösung geschichtet wird. Zusätzlich können einige
Arten von antikonvektiven Zusätzen (z. B. Perlen, Schwämme oder
Ketten) in dem Rezirkulationstank verwendet werden. In
ähnlicher Weise kann die Rezirkulation des unteren Abflusses
zur fortschreitenden Konzentrierung der extrahierten
Komponenten verwendet werden . .
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Vorzugsweise wird der aufwärtige Fluß unterbrochen und schließt
einen nahezu vollständigen Austausch der Lösung in dem Stapel
ein. Dies kann durch eine Druckkolbenpumpe (z. B. eine Spritze)
mit einem Einwegeeinlaß- und Auslaßventil bewirkt werden. Die
Pumpe ist vorzugsweise an der unteren Seite des Stapels
angeordnet. Vorzugsweise ist der Pumpmechanismus mit dem
Stromumkehrschalter verbunden, um die synchrone Arbeitsweise
wie im folgenden Beispiel sicherzustellen:
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1. Takt 1 (z. B. 5 Sekunden). Druckkolben aus, Pumpe gefüllt mit
der Lösung, die aus dem Stapel entfernt wurde (ersetzt durch
eine frische Flüssigkeit, die aus dem Reservoir angesaugt
wurde).
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2. Intervall (z. B. 60 Sekunden) für den elektrophoretischen
Transport, während der Druckkolben langsam niedergedrückt wird,
Ausstoßen des Pumpenabflusses in ein Sammel- oder
Rezirkulationsreservoir. Der Strom kann durch einen verbundenen
Mechanismus während der letzten Sekunden des Zyklus umgekehrt
werden.
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Zur gleichen Zeit wird der abwärtige Fluß unabhängig wie oben
beschrieben überwacht. Es ist jedoch wichtig, den mittleren
Druck innerhalb des Stapels geringer als den in der
Pufferlösung zu halten, um den Stapel in einem verdichteten
Zustand zu halten. Vorteile können erreicht werden, wenn einer
der Ströme, die das gelöste Molekül enthalten, veranlaßt wird,
in einer pulsierenden Art und Weise zu fließen, um
augenblicklich zu bewirken, daß der Druck darin gleich dem
Druck der Pufferlösung wird, oder diesen gerade überschreitet.
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Die Lösungen der makromolekularen gelösten Spezies können
richtige Lösungen oder kolloidale Lösungen sein.
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Die verschiedenen Merkmale der vorliegenden Erfindung können
zusammen oder getrennt bei der Trennung von gelösten
Makromolekülen in einem viel größeren Bereich, als es vorher
möglich gewesen ist, mitwirken. Proteine können zum Beispiel in
Mengen, die 100 g/h überstreiten, gewonnen werden.
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Nachstehend wird lediglich beispielhaft eine bevorzugte
Ausführungsform der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf
die beigefügten Zeichnungen beschrieben, wobei:
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Fig. 1 eine schematische perspektivische Ansicht der
Elektrophoresevorrichtung der vorliegenden Erfindung darstellt;
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Fig. 2 eine Querschnittsansicht durch II-II von Fig. 1
darstellt;
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Fig. 3 einen schematischen auseinandergezogenen
Perspektivschnitt eines Stapels der Membranen, die in der
Elektrophoresevorrichtung von Fig. 1 verwendet werden,
darstellt;
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Fig. 4 einen Graph, der eine Anzahl möglicher Variationen der
Flußgeschwindigkeit der nach oben und nach unten fliegenden
Flüssigkeiten durch die Elektrophoresevorrichtung der Fig. 1,
darstellt;
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Fig. 5 eine schematische longitudinale Schnittansicht durch
eine Pumpe, die in der Elektrophoresevorrichtung gemäß der
vorliegenden Erfindung verwendet wird, darstellt;
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Fig. 6 und 7 jeweils schematisch eine mehr komplexe Anordnung
der Membranen und Dichtungen, die in der
Elektrophoresevorrichtung der vorliegenden Erfindung verwendet
werden, zeigt.
Beste Ausführungsform zur Durchführung der Erfindung
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Die Elektrophoresevorrichtung (10) umfaßt ein Gehäuse, das die
Elektroden enthält und eine Anordnung von elektrophoretischen
Membranen wie sie nachfolgend beschrieben werden, Zufuhrquellen
für eine aufwärts fließende Flüssigkeit, die einen gelösten
Stoff enthält, eine abwärts fließende Flüssigkeit und eine
Pufferlösung, geeignete Pumpen und Rohrleitungen und eine
elektrische spannungsquelle, um die gelösten Stoffe zu
veranlassen, sich elektrophoretisch über die zwischen der
aufwärts fließenden Flüssigkeit und der abwärts fließenden
Flüssigkeit liegenden Membranen zu bewegen.
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Die aufwärts fließende Flüssigkeit (11) ist in einem oben
offenen Vorratsbehälter (12) enthalten. Die aufwärts fließende
Flüssigkeit fließt aus dem Vorratsbehälter (12) durch den
Schlauch (13) in das Gehäuse (14). Sie kommt aus dem Gehäuse
(14) über den Schlauch (15), die Pumpe (16) und den Schlauch
(17) in den Vorratsbehälter (12) zurück. Ein Schwimmkissen
eines Material (18) ist in dem Vorratsbehälter (12) vorhanden,
so daß die zurückkehrende, im allgemeinen weniger dichte,
aufwärts fließende Flüssigkeit, die in den Vorratsbehälter
eingeführt wird, sich nicht unnötig mit der im allgemeinen
dichteren, aufwärts fließenden Flüssigkeit bereits im
Vorratsbehälter (12) mischt.
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Die abwärts fließende Flüssigkeit ist in einem oben offenen
Vorratsbehälter (21) enthalten. Die abwärts fließende
Flüssigkeit fließt aus dem Vorratsbehälter (21) durch den
Schlauch (22) in das Gehäuse (14). Sie kehrt aus dem Gehäuse
(14) durch den Schlauch (23), die Pumpe (14) und den Schlauch
(25) zurück. Eine Kühlvorrichtung (26), die eine Spule durch
die ein Kühlmittel fließt umfaßt, ist in die abwärts fließenden
Flüssigkeit (19) im Vorratsbehälter (21) getaucht, um die
abwärts fließenden Flüssigkeiten zu kühlen. Alternativ oder
zusätzlich können eine oder beide der aufwärts und abwärts
fließenden Flüssigkeiten durch eine Spule geführt werden, die
in ein Kühlbad getaucht ist.
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Die Pufferlösung (27) ist in einem oben offenen Vorratsbehälter
(28) enthalten. Sie wird mit einer Pumpe (29) durch einen
Schlauch (31) in das Gehäuse (14) gepumpt, von wo aus sie durch
den Schlauch (32) in den Vorratsbehälter (28) zurückkehrt. Die
Kühlvorrichtung (26) schließt eine Kühlspule in dem
Vorratsbehälter (28) ein, um die Pufferlösung (27) zu kühlen.
Jeder der Schläuche (31) und (32) ist nahe des Gehäuses (14)
gegabelt, so daß ein getrennter Pufferstrom an jeder der
Elektroden im Gehäuse (14) vorbeifließt.
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Ein Gleichstromnetzgerät (33) liefert eine elektrische
spannungsquelle, um die elektrophoretische Wanderung der
gelösten Moleküle aus der aufwärts fließenden Flüssigkeit in
die abwärts fließende Flüssigkeit anzutreiben. Das Netzgerät
(33) ist mit Drähten (34) mit den Polen (35) auf dem Gehäuse
(14) verbunden.
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Die Schläuche (13) und (15) der aufwärts fließenden
Flüssigkeit, die Schläuche (22) und (23) der abwärts fließenden
Flüssigkeit, die Pufferschläuche (31) und (32) und die Drähte
(34) sind alle durch Klammern (36) miteinander verbunden, um
eine einzige Nabelschnur (37) zu bilden. Dies erlaubt eine
bequeme Bewegung des Gehäuses (14) bezüglich der anderen
Komponenten in der Elektrophoresevorrichtung (10).
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Das Gehäuse (14) ist drehbar auf einem Ständer (38) mit einen
Bolzen (39) befestigt, der durch ein Loch in dem Ständer (38)
und einem entsprechenden Loch in einer Lasche (41) führt, die
von der Unterseite des Gehäuses (14) herabhängt. Das Lösen des
Bolzens (39) erlaubt dem Gehäuse, daß es um die Achse des
Bolzens drehbar ist. Dies berücksichtigt das Herunterlassen des
Einlasses des Gehäuses (14), wenn das Gehäuse zuerst mit den
aufwärts fließenden, den abwärts fließenden und den
Pufferflüssigkeiten beladen wird. Solch ein Vorgehen trägt dazu
bei, die Entwicklung von Luftlöchern in dem Gehäuse (14) zu
vermeiden. In ähnlicher Weise kann das Gehäuse (14) bequemer
durch Niederdrücken des Auslasses des Gehäuse (14) abgelassen
werden.
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Das Gehäuse besitzt eine rechteckige Deckplatte (42), die an
ihrer Unterseite eine rechteckige Verstärkerrippe (43) hat. An
einem Ende ist die Deckplatte (42) mit vertikalen Löchern (44)
und (45) ausgestaltet, die sich durch die Deckplatte (42) und
die Verstärkerrippe (43) erstrecken, die so angepaßt sind, das
sie jeweils die Schläuche (13) und (22) aufnehmen, während das
andere Ende der Deckplatte (42) ähnlich mit Löchern (nicht
gezeigt) ausgestaltet ist, um die Schläuche (15) und (23)
aufzunehmen. Eine Bohrung (46) erstreckt sich horizontal in die
Deckplatte (42) nahe an deren einem Ende und ist für eine
Verbindung zu einem Arm des Schlauchs (31) angepaßt. Ein
seitliches Loch (47) verbindet die Bohrung (46) mit der
Unterseite der Deckplatte (42). In ähnlicher Weise ist eine
Bohrung (nicht gezeigt) an dem anderen Ende der Deckplatte für
eine Verbindung zu einem Arm des Schlauchs (32) vorhanden.
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Die Unterseite der Deckplatte (42) ist innerhalb des Bereichs,
die durch die Verstärkerrippe (43) begrenzt wird, mit einer
Vielzahl von Klampen (48) ausgestattet, um einen
Platinelektrodendraht (49) zu halten, der mit einem der Pole
(35) verbunden ist.
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Das Gehäuse besitzt des weiteren eine Bodenplatte (51), die
ähnlicherweise an einem Ende mit einer Bohrung (46) und einem
seitlichen Loch (47), um die Pufferlösung (27) durch einen Arm
des Schlauchs (31) einzuführen und an dem anderen Ende mit
einer weiteren Bohrung (nicht gezeigt) für die Verbindung mit
dem Pufferaustauschschlauch (32) ausgestaltet ist; die
Bodenplatte (51) ist auch mit Klampen (48) für den
Elektrodendraht (49) ausgestattet. Die Bodenplatte (51) ist auf
ihrer Oberseite mit einer rechteckigen Verstärkerrippe (52)
ausgestaltet, mit einer inneren Abmessung, die etwas größer als
die äußere Abmessung der Verstärkerrippe (43) ist.
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Ein rechteckiger Abstandshalterrahmen (53) vervollständigt das
Gehäuse (14) und ist zwischen der Deckplatte (42) und der
Bodenplatte (51) angeordnet. Der Abstandshalterrahmen (53)
sitzt dicht an jeder der Verstärkerrippen (43) und (52).
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Eine Anordnung von Begrenzungsmembranen (54),
Elektrophoresemembranen (55) und Abstandshalter (56) ist in
einer parallel planaren Anordnung innerhalb des Gehäuses (14)
angeordnet. Die Begrenzungsmembranen (54) sind an der Ober- und
Unterseite des Membranstapels und in seinem Mittelpunkt
angeordnet. Die Begrenzungsmembranen (54) sind so konstruiert,
daß sie den Durchfluß der gelösten Makromoleküle verhindern,
während sie den Durchfluß eines elektrischen Stroms, der durch
die kleinen Ionen des Puffers durchgeführt wird, gestatten. An
jedem Ende sind die Begrenzungsmembranen mit Löchern in gleiche
Ausrichtung wie die Löcher (44) und (45) an dem einen Ende der
Deckplatte (42) und den entsprechenden Löchern an ihrem anderen
Ende versehen.
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Jede der Elektrophoresemembranen (55) ist so konstruiert, daß
sie den Durchfluß von wenigstens dem gewünschten gelösten
Molekül dadurch erlaubt. Die Membranen (55) sind auch an jedem
Ende mit Löchern in der gleichen Ausrichtung wie die Löcher
(44) und (45) an dem einen Ende der Deckplatte (42) und den
entsprechenden Löchern an ihrem anderen Ende versehen.
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Jede der aneinanderliegenden Begrenzungsmembranen (54) und der
Elektrophoresemembranen (55) ist durch einen Abstandshalter
(56) getrennt, der von einer peripheren Dichtung umhüllt und in
einem Stück mit ihr geformt ist, ein Paar Plastikmaschengitter
(58) sind parallel gegenüber angeordnet, wobei die zwei Gitter
(58) entweder in ihrer Maschengröße verschieden sind oder die
jeweiligen Längs- und Querfäden der Maschen sind in einem
Winkel gegeneinander angeordnet, so daß die beiden Maschen
nicht ineinander greifen können. Jeder Abstandshalter ist mit
zwei Löchern an jedem Ende ausgestattet, um den Löchern an den
Enden der Membranen (54) und (55) zu entsprechen. Jeweils eines
dieser Löcher ist jedoch mit einer Dichtung umgeben. Die
korrekte Anordnung der Gitter hält die aufwärts und
abwärtsfließenden Flüssigkeitsströme getrennt, während es den zwei
Strömen gestattet, entlang den gegenüberliegenden Seiten einer
jeden der Elektrophoresemembranen, wie in Fig. 3 gezeigt, zu
fließen. Die in Fig. 3 gezeigte Anordnung ist für ein Paar von
Elektrophoresemembranen (55) ausgelegt, die parallel arbeiten.
In alternativen Anordnungen können die Dichtungen so
konstruiert sein, um für zwei oder mehrere Gruppen von
Membranen zu sorgen, wobei jede Gruppe unterteilt ist durch
eine oder mehrere Elektrophoresemembranen, um eine Vielzahl von
Kammern zu bilden, die in Serie oder parallel verbunden sind.
Wenn mehr als eine Elektrophoresemembran in jeder Kammer
bereitgestellt wird, so wie gewünscht, wenn dann mehr als zwei
Lösungsmittelströme verwendet werden, können die
Elektrophoresemembranen eine unterschiedliche Porengröße
besitzen. Vorzugsweise nimmt die Porengröße in Richtung der
Wanderung der oder einem der gelösten Spezies ab.
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Bei Gebrauch wird die Pufferlösung (27) bei geringem Druck
schnell durch die Räume geführt, die die Elektroden (49)
anliegend an der Deckplatte (42) und der Bodenplatte (51)
umgeben. Dieser Fluß der Pufferlösung (27) dient zur Entfernung
der Wärme und der Gasbläschen aus dem Gehäuse (14). Der Fluß
der abwärts fließenden Flüssigkeit (19) durch das Gehäuse (14)
ist vorzugsweise kontinuierlich, wie durch die Flußlinie (a) in
Fig. 4 gezeigt.
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Der Fluß der aufwärts fließenden Flüssigkeit (11) durch das
Gehäuse (14) wird vorzugsweise in pulsierender Art und Weise
durchgeführt. In Darstellung (b) der Fig. 4 wird der Fluß
abwechselnd durch Stoppen der Pumpe (16) oder anderes
Verschließen des Flusses gestoppt. Das zackenförmige
Fließmuster der Darstellungen (c) und (d) kann durch eine
Abfolge von plötzlichen Kompressionen der Schläuche (13) oder
(15), z. B. durch die Einwirkung eines von einer Nocke
betriebenen fallenden Gewichts, erreicht werden. Die Pulse
können in positiver oder negativer Richtung sein, abhängig
davon, ob die Pumpe auf der aufwärts fließenden Seite (c) oder
der abwärts fließenden Seite (d) des Gehäuses (14) ist. In
jedem Fall wird der gesamte Nettofluß nicht verändert. Die
optimale Frequenz, Gestalt und Amplitude des Pulses kann
experimentell durch Routinetests bestimmt werden.
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Fig. 5 zeigt eine bevorzugte Pumpe (16) zum Pumpen des
aufwärts fließenden Lösungsmittels (11) durch das Gehäuse (14).
Die Pumpe (16) umfaßt einen Kolben (62), der in einem Zylinder
(63) bewegbar ist und der außerhalb davon mit einer Feder (64)
unter Spannung gesetzt ist. Der Zylinder (63) ist in einer
fließenden Verbindung mit einem Paar von Einwegventilen
bezeichnet mit (65). Der Kolben (62) arbeitet durch Rotation
einer Nocke (66) wie angedeutet. Die Nocke (66) drückt langsam
den Kolben (62) zusammen. Wenn der Kolben sich dem Ende seiner
Bewegung nähert, berührt er einen Schalter (67), um die
Polarität der Elektroden umzukehren. Wenn der Nockenabsatz den
Kolben (62) passiert hat, veranlaßt die Feder den Kolben sich
schnell zurückzuziehen. Diese schnelle Rückzugsbewegung des
Kolbens berührt wieder den Schalter, um die normale Polarität
der Elektroden wiederherzustellen und gleichzeitig einen
schnellen Fluß des Lösungsmittels durch das Gehäuse (14) zu
bewirken.
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Eine weitere Entwicklung der Flußverteilung in den getrennten
Stapeln ist in den Fig. 6 und 7 dargestellt, von denen Fig.
6 drei auseinandergezogene Schnitte durch verschiedene Pläne
(A, B, C) zeigt. Die 12 numerierten Zeichnungen in Fig. 7 zeigen
die Reihenfolge von individuellen Elementen mit Buchstaben und
Zahlen, die mit denen der Schnitte korrespondieren. In diesem
Fall sind die Räume nicht durch externe Schläuche sondern durch
eine interne Anordnung von Perforationen in den Membranen und
Zugängen in den Dichtungen verbunden. Beispielsweise wird
angenommen, daß der Stapel drei Einlässe (ein) und Auslässe
(aus) besitzt, entsprechend dreier getrennter Ströme, die in
den Schnitten durch Pfeillinien gezeigt sind. Auch die
Reihenfolge der Membranen (z. B. von abnehmender Permeabilität)
m&sub1;, m&sub2;, m&sub3; und der entsprechenden Dichtungen (g) wird einmal
wiederholt, um die Oberfläche zu vergrößern. Die Dichtungen
haben drei Paare von Öffnungen, aber nur eines dieser Paare ist
mit dem zentralen Raum durch einen Zugang verbunden (parallele
Linien in der Planansicht). Die Membranen (m1,2,3) haben
zueinander passende Perforationen, dargestellt als Kreise in
drei ausgewählten Positionen, um die drei Ströme voneinander
getrennt, durch Führen des Flusses durch die passenden Räume,
zu halten, z. B. A- durch 2 und 8, B- durch 4 und 10 und C-
durch 6 und 12. Es ist selbstverständlich, daß die Zahl der
Ströme horizontal gesteigert werden kann, z. B. durch eine
Wiederholung der gleichen Reihenfolge (in einer größeren
Ausführung der Vorrichtung), um den Durchsatz zu erhöhen, oder
durch Hinzufügen von neuen Membranen mit unterschiedlichen
Eigenschaften. Die Zahl der Zyklen der Membranen usw. in dem
Stapel kann auch vervielfältigt werden, wenn es nötig ist, das
Ausmaß der Trennung zu erhöhen. Es ist auch in Betracht zu
ziehen, daß vormontierte Module hergestellt werden können, um
in oder eingefügt in einem Trennungsstapel verwendet zu werden.