PT87210B

PT87210B - Processo electroforetico de concentracao isoelectrica e dispositivo para a sua realizacao

Info

Publication number: PT87210B
Application number: PT87210A
Authority: PT
Inventors: Daniel Michel Faupel; Pier Giorgio Righetti
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1987-04-11
Filing date: 1988-04-08
Publication date: 1993-11-30
Also published as: IE881067L; HK192495A; US4971670A; DE3876273T2; GR3007124T3; DE3876273D1; PT87210A; DK174962B1; FI881652A; EP0287513A2; ES2037273T3; FI97893B; CA1335805C; IE62803B1; FI881652A0; EP0287513B1; DK191388D0; JPH0781987B2; DK191388A; US5082548A

Description

PROCESSO ELECTROFORETICO DE CONCENTRAÇÃO ISOELECTRICA E DISPOSITIVO PARA A SUA REALIZAÇÃO

taminadores. 0 invento diz também respeito a um aparelho para a sua realização, em que a mistura a ser separada circula dentro duma corrente hidráulica na câmara (8); os cilindros (5) e (12) contêm gradientes de pH imobilizados, ou são substituídos por membranas de pH isoeléctricas anfóteras. Cada um dos gradientes e membranas de pH tem condutividade e ambas capacidades de tamponagem e titulação no seu intervalo de pH. As extremidades dos referidos gradientes ou membranas de pH que constituem o tecto e a base da câmara (8) têm pontos isoeléctricos iguais, ou ligeiramente superiores e ligeiramente inferiores, ao ponto isoeléctrico da proteína de interesse, a qual é mantida no seu ponto isoeléctrico dentro da corrente hidráulica e não passa através dos referidos gradientes de pH ou membranas de pH. Contrariamente as proteínas e sais contaminadores são guiados por um campo eléctrico através dos referidos gradientes de pH ou membranas de pH para dentro dos reservatórios de electrólito (3) e (14); o processo descrito tem a vantagem do composto desejado não necessitar de ser detectado e extraído de qualquer matriz, por exemplo dos referidos gradientes de pH, e da recolha e pureza do composto desejado ser superior.

presente invento refere-se a um novo processo inventivo para a separação de compostos químicos, por exemplo peptidos e proteínas, possuindo uma carga eléctríca resultante igual a zero ou neutra sob as condições experimentais utilizadas, a partir de outros compostos químicos anfó teros ou não-anfôteros, por exemplo outros peptidos, proteínas e/ou sais, possuindo uma carga eléctrica resultante, sob as mesmas condições experimentais, por electroforese, especialmente concentração isoeléctrica preparativa, e a um novo dispositivo, i.e. um aparelho, para realizar o referido processo.

A electroforese preparativa é uma técnica conhecida e várias formas de aparelhos de electroforese foram propostos para ambos os fins analíticos e preparativo. Basicamente, os instrumentos e os princípios para a electroforese preparativa podem classificados em quatro classes principais, de acordo com o principio electroforético utilizado /veja-se A.T. Andrews, Electrophoresis:Theory, Techniques, and Biochemical and Clinicai Applications, Clarendon Press, Oxford 19867:

a) electroforese de disco

b) electroforese de fase livre

c) isotacoforese e

d) concentração isoeléctrica £veja-se P.G. Righetti, Isoelectric FocusingrTheory, Methodology and Applications, Elsevier, Amsterdam, pp. 204-207(1983)7.

Em geral, a electroforese de disco e a isotacoforese são realizadas em matrizes hidrofíIicas, quer contínuas (agarose e políacrilamida), quer descontínuas (leitos granulados, tais como Sephadex¹ '). Elas são caracterizadas por um poder de resolução elevado, mas cargas admissíveis de amostra baixas. A electroforese de fase livre utiliza geralmente tampões contínuos, é realizada numa fase liquida livre e é caracterizada por uma película fina de tampai τ

de escoamento contínuo com uma entrada de amostra contínua. Basicamente, esta técnica oferece grandes capacidades de manuseamento da amostra, mas baixa resolução.Além disso, devido ao maior coeficiente de difusão de proteínas, este método é sobretudo limitado ã purificação de células intactas ou organelos subcelulares.

A concentração isoeléctrica (CIE) pode ser realizada quer em suportes líquidos (gradientes de densidade) quer em meios de gel, contínuos ou granulados.De facto, a técnica de CIE foi iniciada como uma metodologia preparativa, utilizando-se colunas de vidro verticais cheias com sacarose com um gradiente de densidade. Cargas de amostra moderadamente elevadas podem ser trabalhadas com um poder de resolução elevado (ApI=0,02 de uma unidade de pH; pl= =ponto isoeléctrico), o qual, contudo, se perde fortemente quando do esvaziamento da coluna através do funil de recolha do fundo.Esta técnica está, de facto, hoje em dia, practicamente abandonada em favor da CIE em meios de suporte gelatinosos (sobretudo matrizes de agarose e poliacrilamida).Esta técnica permite um elevado poder de resolução, mas apenas cargas de proteínas moderadas. Além disso, todas as técnicas preparativas que utilizam, como meios anti-convectivos, geles hidrofí1icos, têm o problema de recolha da proteína purificada a partir dammatriz. Isto requere etapas de tratamento adicionais, por exemplo detecção da zona de interesse,corte da banda e eluição por difusão ou recolha electroforética.

que tem duas grandes desvantagens: a) baixas recolhas, dado que qualquer matriz tende a adsorver irreversivelmente as proteínas; b) a possibilidade de contaminação proveniente do material de gele(especialmente no caso de suportes sintéticos, tais como poliacrilamida, contaminação proveniente de monômeros não reagidos e de espirais de poli-acrilamida, oligoméricas, curtas, enxertada não-covalentemente à matriz volumétrica.

presente invento ê baseado no objectivo de proporcionar um processo para a purificação de compostos químicos possuindo, tal como os peptídos, um ponto isoeléctrico, ou estando descarregados sob as condições utilizadas, por electroforese, em que, contrariamente ao produto desejado, apenas os sub-produtos indesejados e os contaminantes são postos em contacto com a matriz e em que o referido processo proporciona excelentes produções do produto desejado numa forma muito pura.

A concepção do referido objectivo e a sua solução implicam etapas inventivas.

invento é descrito a seguir fazendo-se referência aos desenhos anexos em que:

A Fig. 1 é uma vista esquemática de conjunto de um aparelho que pode ser utilizado para realizar o processo electroforético de acordo com o presente invento, a Fig. 2 é uma vista esquemática explodida de partes do aparelho representado na Fig. 1, a Fig. 3 é uma vista esquemática explodida de um modelo de realização alternativo de um aparelho de acordo com o presente invento, a Fig. 4 é uma vista esquemática das partes mais importentes de um outro modelo de realização alternativo de um aparelho que pode ser utilizado para realizar o processo de acordo com o presente invento, as Fig. 5, Fig 6 e Fig. 7 são diagramas que ilustram o êxito da separação electroforética de acordo com o processo do presente invento, a Fig. 8 ê uma vista em corte de um terceiro modelo de realização alternativo de um aparelho de acordo com o presente invento, a Fig. 9 é uma vista inferior de um disco perfurado que é uma parte do aparelho representado na Fig. 12, a

		a	Fig.	10 é	uma	vista	superior do
referido	disco,
		a	Fig.	11 é	uma	vista	transversal
tirada ao	longo da	linha	XI-XI	da	Fig.	9, e
		a	Fig.	12 é	uma	vista	transversal de

um quarto modelo de realização alternativo de um aparelho de acordo com o presente invento.

presente invento refere-se a um processo electroforético de concentração isoeléctrica para a separação e purificação de um composto quimico anfótero ou neutro, solúvel num solvente adequado ao processo, a partir de um ou mais compostos químicos carregados electricamente, solúveis no referido solvente, sendo o referido processo realizado por utilização de um aparelho electroforético, em que o fluxo eléctrico, i.e. o campo eléctrico que passa através da matriz electroforêtica é associado a fluxo hidráulico (7),(8) e (11) (Ver as figuras), sendo a direcção do referido fluxo eléctrico diferente da do referido fluxo hidráulico, compreendendo o referido fluxo hidráulico uma solução do referido composto no referido solvente e segmentado a referida matriz em duas partes, uma parte (5) ou (25), localizada no lado catódico do referido fluxo eléctrico, e a outra,(12) ou (26), localizada no lado ánódico do referido fluxo eléctrico, caracterizado por o referido composto quimico anfótero ou neutro ser mantido num estado isoeléctrico ou descarregado dentro do fluxo hidráulico, e por o(s) referido(s) composto(s) quimico(s) carregado(s) ser(em) removido(s) do fluxo hidrau lico pelo fluxo eléctrico para dentro de pelo menos uma das referidas partes da referida matriz, ou através de pelo menos uma das referidas partes para dentro de pelo menos um dos reservatórios (3) e (14) de solução de electrólito, em que as referidas partes, representam independentemente uma da outra, gradientes de pH imobilizados (5) e (12), possuindo cada uma condutividade e as capacidades de tamponização e de titulação no seu intervalo de pH, ou membranas de pH (25) e (26), possuindo cada uma condutividade e capacidade de tamponização e de titulação a um valor de pH especifico.

composto anfótero ou neutro, mantido num estado isoeléctrico ou descarregado, é um composto químico com carga eléctrica resultante nula, ou que é neutro sob as condições do processo de purificação e na altura em que se dá efectivamente a separação do(s) composto(s) quimico(s) indesejado(s) que o acompanham. Ele é preferivelmente uma proteína, um enzima, um peptido menor com pelo menos dois amino ácidos, ou um composto contendo uma metade de proteina ou de peptido, por exemplo uma glicoproteina, mas também um ácido nucleico, um lípido complexo ou um carboidrato complexo.

Contrariamente, um composto quimico carregado electricamente é uma espécie quimica com uma carga eléctrica sob as condições do processo de purificação e na altura em que se dá efectivamente a separação do composto quimico desejado, por exemplo uma proteina, um enzima ou um peptido menor carregado, i.e. não-isoeléctrico, e também um sal, por exemplo um sal de metal alcalino, por exemplo cloreto de sódio.

Um solvente adequado para o processo de acordo com o presente invento é qualquer solvente que solubilize o composto quimico desejado e que leve em linha de conta o fluxo eléctrico desejado, por exemplo água ou uma mistura de água com um álcool adequado, por exemplo um alcanol inferior, por exemplo metanol ou etanol, ou uma solução

Γ

aquosa contendo ureia, detergentes ou qualquer outro solvente prótico ou orgânico miscível em água.

fluxo eléctrico é produzido pelo gerador (1). Pode-se utilizar qualquer voltagem que o sistema tolere, por exemplo 100 a 10.000 Volt, especialmente 500 a 10.000 volt, preferivelmente 500 a 5.000 volt, por exemplo 500 a 1.000, 5.000 ou mesmo 10.000 volt, desde que o calor produzido possa ser dissipidado por arrefecimento adequado. Em equilíbrio, os valores típicos são por exemplo 1.000 volt, 3mA e 3 W ou 500 volt, lOmA e 5 W.

A matriz electroforética é um veiculo para a separação electroforética.

fluxo hidráulico é produzido por exemplo por uma bomba, por agitação ou por rotação da câmara de fluxo (8) em volta dum eixo adequado e compreende como fase liquida uma solução contendo a mistura a ser separada.

A direcção do fluxo hidráulico pode fazer qualquer ângulo adequado, por exemplo 5^o a 90°, especialmente 30° a 90°, e preferivelmente ser mais ou menos perpendicular (ortogonal), com a direcção do fluxo eléctrico.

Um gradiente de pH imobilizado como o contido por exemplo nos cilindros (5) ou (12) consiste numa função de pH estável sobre uma matriz electroforética, por exemplo um gele. Os gradientes de pH imobilizados compreendem um intervalo de pH que é produzido duma maneira conhecida per se, por exemplo por meio de um gradiente de densidade sobreposta e polimerização (veja-se a Application Note 321, datada de Agosto de 1982, de LKB-Produkter AB, Box 305, S-16126 Bromma,Suécia), por exemplo por mistura de volumes iguais das duas soluções de partida A e B descritas a seguir, num misturador de gradiente, por exemplo o

-9MicroGrad Gradient Maker” fornecido por LKB-Produkter AB, estando a saída do misturador ligada ao cilindro (5) ou (12). A solução de partida A é uma solução densa e ácida e contém Imobilinas cb tamponização (marca registada, utilizada a seguir sem indicação) ou um seu equivalente, Imobilinas de não-tamponização ou um seu equivalente, Anfolinas (marca registada, utilizada a seguir sem indicação) ou um seu equivalente, acrilamida, N,N'-metileno-bis-acrilamida, glicerol, água e catalisadores de polimerização adequados. A solução de partida B é uma solução leve e básica que contém Imobilinas de tamponização, Imobilinas de não-tamponização, Anfolinas, acrilamida, Ν,Ν'-metileno-bis-acrilamida, água e catalisadores de polimerização adequados, excepto glicerol.

As membranas de pH imobilizadas isoeléctricas anfôteras distinguem-se dos gradientes de pH imobilizados pelo facto de não compreenderem um intervalo de pH, mas por possuírem por toda a membrana o mesmo valor de pH. A manufactura das membranas é similar a, mas ainda mais simples do que a manufactura dos gradientes de pH, dado que não é necessário nem o misturador de gradiente nem o glicerol para preparar o gradiente de densidade.

As membranas são manufacturadas por polimerização, preferivelmente à volta do pH neutro, a 50°C num forno de ventilação forçada durante 1 hora, de uma solução de monómeros (em geral 10-15% de T e 3-4% de C) contendo quantidades variáveis de Imobilinas de tamponização e de titulação nas relações necessárias para produzir o ponto isoeléctrico desejado, conjuntamente com Anfolinas, com catalisadores de polimerização adequados e com água. E essencial que as membranas tenham uma boa capacidade de tamponização no seu ponto isoeléctrico a fim de evitar a electroendosmose, um termo que indica um fluxo liquido volumoso através da membrana causado pela presença ou aquisição de uma carga eléctrica resultante .Contudo, a molaridade da Imobilina não deve

de preferencia ultrapassar 50 mM por cada Imobilina na membra_ na.

As Anfolinas são substâncias anfóteras de baixo peso molecular, i.f. anfólitos, as quais contrariamente às Imobilinas não são fixadas ao polímero de acrílamida/Ν,Ν¹-metileno-bis-acrilamida e são por isso capazes de contribuírem para a condutividade eléctrica. Misturas de muitas substâncias anfôteras tais como amino-ácidos e peptidos e alguns componentes anfóteros e não-anfóteros podem actuar como anfólitos adequados. Contudo, a grande maioria de experiências de concentração isoelêctrica é efectuada com o auxilio de misturas de anfólitos comerciais. Entre estas, as mais amplamente utilizadas são comercializadas por LKB Produkter AB sob a marca comercial Ampholines. Elas consistem em misturas sintéticas de ácidos de pol iaminopol icarboxilico com pesos moleculares sobretudo entre 300 e 600. Podem-se utilizar outros produtos que contenham agrupamentos de ácido sulfónico ou fosfônico, adicionalmente aos grupos de aminas e de ácido carboxi 1 ico.Estes jyrodutos (Servalyts®, Serva-Feinbiochemica GmbH; Biolytes^, Bio-Rad Laboratories;

(D

Pharmalytes^J , Pharmacia AB) foram recentemente comparados com as Anfolinas e mostraram ter uma actuação semelhante.

As Imobilinas são derivados de acrilamida com a estrutura geral

C=CH-8-ή-R, em que R contém quer um ácido carboxilico, quer um grupo amino terciário. As Imobilinas são concebidas para co-polimerização com acrilamida e N,N¹-metileno-bis-acrilamida a fim de produzirem gradientes de pH imobilizados. Cada derivado tem um valor de pK definido e conhecido.A acrilamida pode ser substituída, por, por exemplo, metacri lamida e a N,N¹-metileno-bis-acrilamida pode ser substituida por qualquer outro agente de ligação cruzado adequado por exemplo outros derivados de acrilamida adequados.N-(3-Dimetilamino-propi1)-metacrilamida com um valor de pK de 9,5 pode ser

mencionada como um exemplo de um derivado de metacrilamida que seja análogo a uma Imobi1ina.Apôs a co-polímerização, as Imobilinas são ligadas covalentemente, i.e. imobi1izadas, e não contribuem de forma nenhuma para a condutividade do gradiente de pH ou de membrana de pH.Contudo, as Imobilinas contribuem para a capacidade de tamponização e de titulação.

Preferivelmente, os gradientes de pH e as membranas de pH são fundidos algures dentro duma gama de pH entre cerca de 3 e cerca de 10, dependendo das Imobilinas e das Anfolinas disponíveis. Se o composto com interesse é anfótero, os valores de pH nas duas extremidades do gele adjacentes â camara de fluxo (8) têm que ser ajustados para um valor imediatamente acima e abaixo ou para um valor igual ao ponto isoeléctrico da referida substância anfótera, com a precisão necessária para a manter no estado isoeléctrico constantemente. A referida precisão e a diferen ça entre os valores de pH das referidas extremidades de gele, i.e. a amplitude em termos de unidades de pH do intervalo entre as referidas extremidades de gele, dependem do poder de resolução necessário, i.e. dos pontos isoelêctricos dos contaminantes que têm de entrar no gele, i.e. que pelo menos atravessam o gele. A fim de se obter o mais elevado poder de resolução possivel, os valores de pH nas referidas extremidades de gele podem ser iguais ao ponto isoeléctrico do composto desejado. Neste caso, é vantajoso evitar as perdas do composto desejado, que podem acontecer por difusão, através da inserção de um dispositivo mecânico apropriado, por exemplo um filtro millipore adequado, entre o gele e o fluxo hidráulico. Se o composto com interesse é neutro, os valores de pH nas referidas extremidades do gele são escolhidos de maneira que os contaminantes tenham que entrar no gele. Os referidos contaminantes podem permanecer dentro do gele ou deixá-lo novamente e acumularem-se nas câmaras anódica e catódica (14) e (3). Os catalisadores de polimerização adequados são por exemplo, N ,N,N¹ , N¹-tetrameti letilenodiamina (TEMED) e persulfato de amónio. Os referidos catali-12-

sadores são adicionados pouco tempo antes de se começar a misturar as soluções densa e leve mencionadas anteriormente. Outros meios de polimerização são por exemplo riboflavina com luz ultravioleta ou radiação gama.

No misturador de gradiente, a solução básica e leve é misturada com a solução ácida e densa que é removida simultaneamente para a saída do misturador de gradiente que está ligada ao contentor (5) ou (12). Deste modo, o gradiente de densidade obtido varia conjuntamente com o gradiente de pH. A extremidade inferior dos contentores (5) e (12) é provisoriamente fechada, por exemplo com parafilme. Depois do processo de polimerização ter terminado, o parafilme é removido. Se o diâmetro interior do referido conter^ tor é demasiado grande, pode ser necessário inserir um suporte, por exemplo uma placa perfurada, que não é removida, na extremidade inferior do contentor.Pelo menos as partes do con^ tentor que entram em contacto com o polimero têm de ser feitas de um determinado material ao qual o polimero adira bem, por exemplo de vidro, a fim de evitar a passagem de liquido entre a parede do contentor e do polimero. Os contentores (5) e (12) contendo os ingredientes de pH imobilizado são formados num aparelho de acordo com o presente invento, por exemplo como mostrado nas Figs. 1 e 2.

Seguidamente, os gradientes são adequadamente lavados para se remover as substâncias indesejadas, por exemplo químicos de Imobilina livres cataiisadores e monómeros não-enxertados. Por outro lado devido à baixa condu tividade da parte central do gele, na medida em que os aniões e catiões livres e fracos são consumidos electroforeticamente, as duas frentes de sais, acumuladas em direcção âs regiões anódica e catódica de gele, não são nunca capazes de deixar o gele. A fim de se obter uma boa concentração, o primeiro, um gradiente de Imobilina é sobreposto por um segundo, um gradiente de pH transportado por um veiculo anfólito.O aparelho

de acordo com o presente invento funciona normalmente com a câmara de fluxo cheia de liquido durante várias horas, por exemplo cerca de cinco horas, até se alcançar um estado estável antes da aplicação da amostra. A seguir, a câmara de fluxo (8) e, se necessário, todos os outros contentores, que entrem em contacto com o fluxo hidráulico, por exemplo, o reservatório de amostra (11), são esvaziados a fim de se remover o material nocivo saído do polímero, tal como monómeros não enxertados, e são cheios com a amostra a purificar.

Durante todo o processo de acordo com o presente invento, a solução da amostra é agitada vigorosamente para evitar a electrodecantação e manter a temperatura constante. Os gradientes de pH nos contentores (5) e (12) são também mantidos a temperatura constante. A temperatura utilizada depende inter alia do solvente, da estabilidade e da solubilidade da substância desejada. Em água, é normalmente mantida a um valor fixo entre cerca de 1 e 20°C, por exemplo a 2°C.

conceito básico do presente invento é o de uma técnica preparativa mista, utilizando-se um leito de liquido que pode ser um pequeno e que é ligado a duas fases de gele, delimitando-o, e é ilustrada no exemplo seguinte de purificação duma proteína. A proteína de interesse é mantida num estado isoeléctrico na fase liquida, por exemplo numa pequena câmara de reciclagem (8), enquanto que as impurezas que a acompanham são conduzidas ou em direcção ao cátodo (2), ou em direcção ao ânodo (13) e eventualmente (mas não necessariamente) concentradas nas fases de gele (5) e (12), representando os gradiente de pH (os números refe rem-se às figuras). Os gradientes de pH podem ser substituídos por membranas de pH. Deste modo, nesta técnica de focagem isoelêctrica modificada, a proteína de interesse não é conduzida electroforeticamente para a matriz de gele (da qual ela tem que ser recolhida por meio duma etapa de purificação adicional), mas é mantida num estado isoeléctrico na corrente de

liquido (fluxo hidráulico) (7),(8) e (11), constituindo a carga de amostra e apenas as impurezas (carregadas electric^ mente) são forçadas a se concentrarem nas fases de gele (5) e (12), delimitando a entrada de amostra de liquido, ou a serem recolhidas num ou em ambos os reservatórios de electrólito (3) e (14). De preferencia, o valor de pH dentro do fluxo hidráulico corresponde ao ponto isoeléctrico do composto desejado.Porque a separação electroforética é efectuada num gradiente de pH (concentração isoeléctrica), todas as espécies que têm um ponto isoeléctrico dentro do gradiente de pH (5) ou (12) são conduzidas pelo gradiente de voltagem para a zona especifica em que elas apresentam uma carga resultante igual a zero e onde elas permanecem estacionárias enquanto o campo eléctrico se mantém aplicado. A diferença, quando se compara com técnicas anteriores, é inter alia que as condições de partida são estabelecidas de maneira que o componente de interesse já seja isoeléctrico na câmara de fluxo (8) que constitui a carga de amostra de sistema. Deste modo, o componente de interesse não é forçado a migrar por meio do fluxo eléctrico. Em vez de se usar um sistema de concentração isoeléctrica convencional (CIE) baseado em tampões anfôteros .fveja-se P.G. Righetti, Isoelectric Focusing e Methodology and Applications, Elsevier.Amesterdam, páginas 204-207 (1983)7, no processo de acordo com o presente invento utiliza-se uma versão mais avançada do mesmo, uma técnica de gradiente de pH imobilizado (GPI) Zveja-se P.G. Righetti, J. Chromatogr. 300, 165-223 ( 1984)J.

Um sistema de concentração isoeléctrica convencional (CIF) não seria adequâvel para o processo de acordo com o presente invento pelas seguintes razões: a) a CIF não é estável ao longo do tempo; de facto o gradiente de pH decai e é sujeito a uma acidificação progressiva (movimento catódico) £cf. P.G. Righetti e J.W. Drysdale, Ann, N.Y. Acad. Sei. 209, 163-186 (1973)7 de maneira que a proteína de interesse não seja mantida na fase liquida, mas que se

mova eventualmente para dentro da matriz de gel; b) devido ao facto dos gradientes de pH serem produzidos apenas duma maneira aproximada em sistemas CIF, é impossível ajustar as condições de fronteira nas duas extremidades de gel adjacentes à câmara de fluxo (8) com a precisão necessária para manter o composto químico de interesse com um ponto isoelêctrico sempre exactamente no estado isoeléctrico, evitando assim que ele abandone a fase liquida /fluxo hidrául ico; (7) _s(8) e (11)7- Pelo contrário, com gradientes de pH imobilizados (GPI) e membranas de pH, é na maioria dos casos possível ajustarem-se as condições de fronteira de maneira que a extremidade anóoica de gele adjacente ao fluxo de amostra tenha um valor de pH imediatamente abaixo do ponto isoeléctrico (pi) do componente de interesse, enquanto que a extremidade de gele catódica respectiva é ajustada para um valor de pH imediatamente acima do pi do composto desejado.E claro que, a manufactura de GPI adequados pode ser dificultada em casos relativamente raros em que a substância desejada tem um pi extremamente elevado ou extremamente baixo. 0 referido composto químico, com um ponto isoeléctrico, será assim isoeléctrico neste intervalo de pH estreito delimitado pelos dois gradientes de pH imobilizados ou membranas de pH. Se o composto de interesse é anfótero, este intervalo compreende normalmente 0,05 a 0,2 unidades de pH; contudo, os intervalos que vão até 0,001 unidades de pH podem também ser obtidos. E também possível que o intervalo compreenda 0 unidades de pH, i.e. os valores de pH nas referidas extremidades de gele correspondem ao ponto isoeléctrico do composto desejado. Isto significa que não há intervalo de pH, mas apenas um intervalo de fluido entre as duas fases de gele. Se o composto de interesse é neutro, os valores de pH nas extremidades de gele não são escolhidos em atenção ao composto desejado, mas tendo em consideração os compostos anfóteros ou carregados indesejados, no sentido de que os compostos indesejados não devem ter um ponto isoeléctrico dentro do referido intervalo de pH. 0 composto neutro nunca entrará nos gradientes de pH, independen-16-

temente das condições de fronteira nas extremidades do gele adjacentes à câmara de fluxo (8).Adicionalmente a esta precisão no ajustamento das condições de fronteira, devido à estabilidade ilimitada dos GPI ao longo do tempo, fica automaticamente assegurado que o gradiente de pH nunca se move, de maneira que as condições isoelêctricas para o composto químico sob purificação serão constantemente encontradas no fluxo hidráulico, especialmente na câmara de fluxo (8), e em mais lado nenhum, por exemplo dentro das fases de gel anódicas ou catódicas (12) e (5).

processo de acordo com o presente invento tem pelo menos as seguintes vantagens principais: (a) recolhas de amostra extremamente elevadas, aproximando-se de 100%, porque o composto químico (por exemplo a proteína) sob purificação nunGa entra na fase de gele, sendo mantida descarregada, por exemplo num estado isoeléctrico, durante toda a etapa de purificação na fase liquida; (b) grandes cargas de amostra, porque o composto a purificar, por exemplo a carga de proteína, pode ser mantida a circular entre um reservatório separado (11) e a câmara de fluxo (8) e apenas pequenas quantidades necessitam de estar presentes, numa altura qualquer determinada, no campo eléctrico; (c) poder de resolução elevado, dependendo da estreiteza do intervalo de pH escolhido na vizinhança do ponto isoeléctrico (pi) do composto desejado, por exemplo proteínas; (d) remoção automática de quaisquer sais ou tampões que acompanhem o composto (por exemplo, o peptido ou a proteína) de interesse, o que significa que o presente processo pode também ser utilizado em electrodiálise (processo de dessalificação). Especialmente, a remoção de iões monovalentes de ácidos ou bases fortes, por exemplo Na⁺ e Cl, é muito fácil. Para a remoção de iões monovalentes de ácidos e bases fracas, por exemplo amónio e acetato, é vantajoso utilizarem-se as membranas de Imobilina isoelêctricas anfóteras descritas a seguir ou então pequenos gradientes de pH, i.e. gradientes compreendendo apenas uma

gama de pH relativamente pequena, por exemplo 0,5 a 1,0 unidades de pH, bastante afastados dos valores de pK dos ácidos e bases fracos respectivos. A remoção de iões multivalentes, por exemplo sulfato, fosfato e citrato demora mais tempo, possivelmente devido à interacção destas espécies com a matriz de Imobilina e é melhor efectuada sob o controlo de pH exterior, por exemplo com um pH-stat, porque senão, devido à remoção mais rápida do contra-ião monovalente, a solução dentro da camara (8) pode-se tornar mais ácida ou alcalina. A dessalificação rápida das amostras de proteína tendo com fim uma variedade de utilizações, por exemplo reacções de enzimas ou estudos de ligação de ligandos, é um dos problemas actuais da bíoquimica.

Qualquer conteúdo salino na carga de amostra (mesmo à concentração 1 mM) inibe o transporte de proteínas não-isoeléctricas, talvez por causa da fracção de corrente muito maior transportada pelos próprios iões, oposta às proteínas. Além disso, elevados níveis de sal no reservatório da amostra formam, fronteiras de iões catódicos e anódicos, alcalinos e ácidos respectivamente que podem dificultar a migração das proteínas e mesmo induzir a desnaturação. Nos geles de GPI segmentados (bem como nos convencionais), practicamente qualquer nível de sal presente na zona de amostra inibe o seu transporte electroforético. Por isso, a melhor maneira para eliminar eficientemente as impurezas de proteína de um componente isoeléctrico consiste na introdução de uma carga de proteínas já dessalifiçada no aparelho de GPI segmentado. Contudo, a eliminação de impurezas de proteínas pode ser alcançada, embora a uma velocidade inferior, mesmo na presença de sais na amostra. No último caso, os niveis de sal devem ser mantidos num valor mínimo compatível com a solubilidade da proteína (por exemplo 5mM ou menos) e deve-se empregar um controlo de pH externo (por exemplo com um pH-estato), de maneira a evitar-se as mudanças de pH drásticas na carga de amostra, provocadas pela

geração de fronteiras produzidas pelos constituintes do sal. Em muitos casos, pode ser necessária uma concentração minima de sal na fase de amostra durante a electroforese para evitar a agregação e precipitação de proteínas devido a se baixar demasiado uma resistência iónica no ou na vizinhança do ponto isoeléctrico. Para este fim, utiliza-se um fluxo hidráulico exterior, repondo a perda de sal devida aos transportes combinados de massa difusional e eléctrica (semelhante ao conceito de reoelectrólise de estado estável de Rilbes, H. Rilbe, d. Chromatography 159, 193-205 /19787 ).

processo acima mencionado, pode ser efectuado com um dos seguintes aparelhos electroforéticos, também incluídos no âmbito do presente invento: todos os referidos aparelhos electroforéticos compreendem basicamente uma câmara de fluxo (8) ligada a dois contentores (5) e (12) sendo cada um deles cheio, independentemente um do outro, com um gradiente de pH imobilizado, ou substituído por uma membrana de pH imobilizada, tendo um dos gradientes ou membranas, na sua extremidade ligada à câmara de fluxo (8), um ponto isoeléctrico imediatamente inferior ou igual ao ponto isoeléctrico do composto químico a purificar, e estando ligado pela sua outra extremidade à câmara anódica (14) e tendo o gradiente de pH ou a membrana de pH remanescente, na sua extremidade ligada à câmara de fluxo (8), um ponto isoelêctrico imediatamente acima ou igual ao ponto isoeléctrico do referido composto químico a purificar e estando ligado pela sua outra extremidade à câmara catódica (3).

Uma vista esquemática de uma de várias modificações possíveis destenovo aparelho electroforético é apresentada na Fig. 1. Uma câmara de fluxo (8) está ligada a um reservatório de amostra (11) que, em principio, pode conter qualquer volume para tratamento por meio duma bomba (9) de recirculação da carga através do campo eléctrico. Normalmente, a bomba (9) funciona à máxima velocidade, por

exemplo a 5 ml/min. Na perpendicular ao fluxo hidráulico (7), está activado um campo eléctrico entre as duas placas (2) e (13), preferivelmente feitas de platina, o qual serve para remover electroforeticamente da câmara de fluxo (8) qualquer ião ou espécie anfótera não-isoeléctrica. A câmara de fluxo (8) está ligada, por exemplo por meio dos vedantes por 0-ring superior e inferior (6) e (10), a dois cilindros (5) e (12) de gele de poliacrilamida, contidos dentro de tubos de vidro curtos, dotados de duas camisas (19) para o fluxo de arrefecimento (18) Z7( 19) θ (18) não são mostrados na Fig. 1, mas sim na Fig. 2/. 0 tubo superior está ligado, por exemplo por meio dum vedante por 0-ring (4) estanque â água, à câmara catódica (3), contendo geralmente a base diluída (por exemplo NaOH 50 mM ou etanolamina, etilenodiamina, lisina isoiónica ou arginina), como é normal em concentração isoeléctrica convencional (CIE).O tubo inferior (12) banha a sua extremidade directamente numa câmara anódica (14), em geral contendo um ácido diluido (forte ou fraco), tal como ácido acético, ácido fosfórico ou ácido sulfurico ou soluções de ácido glutâmico ou aspárticas isoiónicas, tal como é utilizado normalmente em CIE.Obviamente, os vedantes por 0-ring podem ser substituídos por quaisquer outros meios adequados para ligação das várias partes do aparelho.

A nova caracteristica da presente técnica de fraccionamento consiste no facto da câmara de fluxo (8) ser delimitada pelas extremidades de um gele de poliacrilamida inferior e superior representando gradientes de pH ou membranas de pH imobilizados. Os referidos gradientes de pH estão contidos nos cilindros (12) e (5) que são preferivelmente feitos de vidro ou de outro material adequado ao qual o gele seja capaz de aderir por forças adesivas. Por preparação das extremidades destes dois segmentos de gele que delimitam a câmara de fluxo (8) para se obterem pontos isoeléctricos (pi) imediatamente abaixo (no lado anódico) ou igual e imedíatamente acima (no lado catódico) ou igual ao ponto

isoeléctrico do composto desejado, por exemplo proteína, sob purificação, este composto na prática será titulado para o seu pi e como tal não será capaz de deixar o fluxo hidráulico (8), (7) e (11).

Contráriamente, todas as impurezas com um pi diferente, por exemplo impurezas proteináceas que acompanham o composto sob purificação, estarão automaticamente /Tio valor de pH prevalecente na câmara de fluxo (8)2 ou acima ou abaixo dos seus pi respectivos e serão assim forçados a deixar a câmara (8) e a concentrarem-se nos segmentos inferior ou superior (12) e (5) do gele de poliacrilamida imobilizado, ou serão recolhidos nas câmaras anódica ou catódica (14) ou (3). Dando-se um tempo de reciclagem suficiente sob um gradiente de voltagem, todas as impurezas deixam a câmara de fluxo (8) e o composto puro, por exemplo uma proteína isoeléctrica, é recolhido da câmara de fluxo (8) e do reservatório (11) de amostra que continham inicialmente a carga.Não são necessárias mais manipulações ou extracções de amostra, na medida em que o composto, por exemplo a proteina, de interesse permanece sempre na fase liquida e não entra no gele.

aparelho, que é montado por exemplo na vertical ou preferivelmente na horizontal, e que compreende as câmaras anódicas e catódicas (14) e (3), os cilindros de gele (12) e (5), os vedantes (10), (6) e (4) e a câmara de fluxo (8), é ligado a uma fonte de energia (1). Em equilíbrio, os valores típicos são 1000 V, 3mA e 3 W, sendo quais_ quer outros valores adequados para as separações, desde que o calor produzido possa ser removido por arrefecimento apropriado. A câmara de fluxo (8) da amostra é dotada de meios para a manter a uma temperatura constante, e/ou a carga é mantida num reservatório (11) maior encamisado, ligado a um termoestato (17). E vantajoso manter o reservatório da amostra (11) sob agitação continua e suave, senão, com o tempo,

uma caiada mais densa pode-se separar de uma outra mais leve. Utiliza-se um dispositivo qualquer de bombagem (9), por exemplo uma bomba peristâltica, para reciclagem, a qual é efectua_ da normalmente à velocidade máxima (por exemplo 5 ml/min), de maneira que a mostra permaneça durante um período de tempo o maos curto possível dentro da câmara de fluxo (8),evitando-se deste modo qualquer risco de desnaturação térmica. Este é um dos conjuntos de elementos mais simples para funcionamento.Em principio, qualquer outra sonda ou dispositivo de medição podem ser incorporados neste aparelho, se necessário; por exemplo, um sistema decfetecção por bio-sensores, um equipa mento de detecção fluorescente excitado por laser, qualquer sistema desejado acoplado roboticamente, um dispositivo, por exemplo um eléctrodo de fluxo para medições e controlo de pH, um dispositivo para monitorizar radioisótopos e/ou um dispositivo, por exemplo uma célula de fluxo para controlo da condutividade, se necessário.Obviamente, para fins especiais, o fluxo de amostra (7) pode também ser seguido por meio de luz ultravioleta ou visível, ou por observação fluorescente, com o equipamento standard acoplado a colunas cromatográficas para seguir a velocidade de remoção de alguns componentes da mistura.

A Fig. 2 é uma vista explodida esquemática do mesmo aparelho da Fig. 1, em que não é mostrada a fonte de energia (1), o agitador (16) e o termostato (17) representados na Fig. 1, mas em que se mostra as camisas(19) para o fluxo refrigerante (18) em volta dos cilindros de gele (5) e (12), bem como os vários componentes (3), (5), (6), (8), (10), (12) e (14) na posição correcta para montagem, mas ainda não montados. 0 fluxo regrigerante (18) está ligado a um termostato, por exemplo (17), não representado na Fig. 2. Embora não esteja representado na Fig. 2 (ver a Fig 1), o reservatório (11) da amostra também deve ser mantido a uma temperatura constante, por exemplo 2°C, uma vez que os pontos isoeléctricos dependem da temperatura. Se desejado,

-2 2-

a câmara de fluxo (8) pode estar também dotada de camisas para passagem de fluxo de arrefecimento. A Fig. 2, adiciona], mente à Fig. 1, mostra também uma forma preferida para a câmara de fluxo (8): a entrada e a saida do fluxo hidráulico (7) dirigem-no uma para o cilindro (12) e a outra para o cilindro (5).0 contentor (12), embora apresente duas pontas roscadas, pode ser mergulhado directamente dentro da solução de anólito na câmara do eléctrodo (14).

A Fig. 3 mostra um aparelho adequado, apôs ligação dos seus componentes, para purificação de dois compostos anfôteros, por exemplo duas proteínas, possuindo pontos isoeléctricos diferentes no mesmo aparelho e ao mesmo tempo. Os reservatórios da amostra (11a) e (11b) contêm a carga inicial que pode ser a mesma ou diferente.0 reservatório da amostra (11a) está ligado por meio de qualquer tipo de tubagem (7a) a uma das duas câmaras de fluxo (8a).0 reservatório da amostra (11b) está ligado por meio da outra tubagém (7b) à segunda câmara de fluxo (8b).

As câmaras de fluxo (8a) e (8b) estão separadas uma da outra por um cilindro intermédio (20) contendo um gradiente de pH imobilizado. A extremidade do referido gradiente de pH intermédio adjacente à cârara de fluxo (8b) tem um valor de pH ligeiramente mais alto, por exemplo + 0,05 unidades de pH, do que o do ponto isoeléctrico do composto desejado dentro da câmara de fluxo (8b), ou o mesmo valor de pH do composto desejado. A extremidade do referido gradiente de pH intermédio adjacente à câmara de fluxo (8a) tem um valor de pH ligeiramente mais pequeno,por exemplo -0,05 unidades de pH, do que o do ponto isoeléctrico do composto desejado na câmara de fluxo (8a), ou o mesmo valor de pH que o composto desejado. No fim do processo CIE, a espécie purificada desejada, por exemplo proteínas, são recolhidas nas câmaras (8a)Z~(lla) e (8b)J(llb), tendo sido removidos quaisquer contaminantes introduzidos.

Pode-se utilizar um aparelho de acordo com a Fig. 1, para fins analíticos, em que, contudo,a câmara de fluxo (8) é fechada, na medida em que não está ligada ao reservatório da amostra (11). Neste caso, o aparelho pode ser colocado numa posição horizontal, imerso no mesmo, refrigerante e rodado em torno do seu eixo. Em vez de se rodar todo o aparelho, a amostra dentro da câmara de fluxo pode ser agitada, por exemplo com uma haste magnética.

A utilização do aparelho de electroconcentração na posição horizontal com as referidas entradas e saídas na posição vertical, em que a saida está situada acima da entrada, não é sô vantajosa no caso especial atrás mencionado de uma câmara de fluxo fechada, mas também o é no caso de uma câmara de fluxo aberta, possuindo entradas e saídas para o fluxo hidráulico. Na disposição vertical, as bolhas de ar tendem a se acumular na parte superior da câmara de fluxo. Isto resulta num transporte irregular de impurezas e na criação de obstáculos ao fluxo de corrente eléctrica. Para a remoção das bolhas de ar, o aparelho tem que ser desmontado e colocado na horizontal para se poder remover completamente as bolhas através da corrente de saida. Por outro lado, o segmento de GPI inferior, imerso no reservatório de electrólito inferior(geralmente o ânodo) tende a aumentar de volume.Isto força o gel a sobressair do tubo de suporte e eventualmente a separar-se das paredes de vidro, caindo do seu alojamento. Estes problemas são eliminados com um aparelho na horizontal, por exemplo como o representado na Fig. 8, dotado dos filtros (21) em todas as extremidades dos segmentos de GPI, para bloqueamento das fases de gele de Imobilina in situ. Os filtros (21) são mantidos no seu lugar por meio dum 0-ring alojado num ressalto anular existente no tubo exterior.

Nas figs. 1 a 3, os contentores de gele imobilizado (5) e (12) estão situados em lados opostos. Contudo, é também possível dispô-los paralelamente um ao outro, conforme é mostrado na Fig. 4.Tal disposição é especialmente adequada para purificação em grande escala, uma vez que é possível imergir mais do que os dois contentores (5) e (12), por exemplo (4), (6), etc, na câmara de fluxo (8).

Para a maioria dos fins, o processo e o aparelho podem ser melhorados por substituição de pelo menos um dos gradientes de pH por membranas de pH imobilizado isoeléctricas e anfôteras. EStas membranas podem ser consideradas como gradientes de pH muito cutos, cobrindo apenas um intervalo de pH muito estreito. Idealmente, o referido intervalo de pH compreende zero unidades de pH. Por outro lado, a diferença entre os valores de pH nas extremidades dos gradientes de pH ou membranas de pH, que delimitam a câmara de fluxo (8), pode também ser reduzida para zero,i.e. a câmara de fluxo pode ser delimitada por exemplo por duas membranas com o mesmo valor de pH que é idêntico ao ponto isoeléctrico do composto desejado.

Este facto é surpreendente e facilita o método, dado que se podem preparar duas membranas idênticas em vez de membranas diferentes umas das outras. A utilização das membranas de pH em vez dos gradientes de pH tem a vantagem adicional de aquelas serem mais baratas. Além disso, o calor produzido pode ser removido mais facilmente.Por isso, as membranas de pH (25) e (26) são preferidas na maioria dos casos em que se efectuam purificações em grande escala.

invento refere-se também a um aparelho adequado para ser utilizado num processo electroforético de concentração isoeléctrica, conforme aqui descrito,

em que o referido aparelho compreende uma câmara de fluxo (8) ligada directa ou indirectamente quer a) a dois contentores (5) e (12), sendo cada um deles adequado para conter um gradiente de pH imobilizado, quer

b) a dois dispositivos que contêm membranas de pH imobilizado (25) e (26), quer

c) a um contentor de acordo com (a) anterior e a um dispositivo de acordo com (b) anterior, em que um dos contentores ou dispositivos estâ ligado pela sua outra extremidade â câmara anódica (14) e o outro contentor ou dispositivo estâ ligado pela sua outra extremidade à câmara catódica (3).

Os seguintes exemplos ilustram o invento sem o limitarem.

Abreviaturas:

A: Ampere

C: (se utilizado para descrever a composição do gel) percentagem (em peso) de T (ver em baixo) de monómero total relativa ao agente de ligação cruzada N,N¹-metileno-bis-acrilamida com a fórmula CH2=CH-C0-NH-CH2~C0-CH=CH2

GPI: gradiente de pH imobilizado pi: ponto isoeléctrico

T: concentração total/g/100 ml, i.e. peso por volume por centojde acrilamida e N,N¹-metileno-bis-acrilamida

TEMED: Ν,Ν,Ν¹,N¹-tetrametileno-bis-acri1amida

V: Volt

W: Watt

Exemplo 1: purificação duma mistura de proteínas equipamento experimental é o das Figs.l e 2. 0 segmento (12) de GPI inferior com um volume total de 26 ml contém uma matriz (7% de T e 4% de C) dentro duma gama de pH de 3,5 a 7,2 e 1% de anfólitos transportadores mais ou menos no mesmo intervalo de pH e ê preparado a partir duma solução densa ácida e duma solução leve básica por meio dum misturador de gradiente adequado da maneira que se segue:

A solução densa ácida é preparada a partir duma mistura de 685 ju 1 de pK 3,6, 223 /11 de pK 4,6, 226 /11 de pK 6,2, 118 /11 de pK 7,0 e 154 ul de pK 8,5 de Imobílinas (a partir de soluções de reserva 0,2M), 0,6 ml de Anfolina ® de pH 3,5-7,0, 3,1 ml de acrilamida de reserva (30% de T, 4% de C) e 3,6 ml de glicerol por adição de água a 13 ml.

A solução leve básica é preparada a partir duma mistura de 124 ml de pK 3,6, 511 /11 de pK 4,6, 347 /11 de pK 6,2, 139 /11 de pK 7,0, 310 /11 de pK 8,5 e 238 /11 de pK 9,3 de Imobílinas, 0,6 ml de Anfolina pH 3,5-7,0 e 3,1 ml de acrilamida de reserva (30% de T, 4% de C) por adição de água a 13 ml.

Uma vez transferida para um misturador de gradiente de duas câmaras adequado, adicionam-se 10 ul de TEMED e 13 /11 de persulfato de amónio a 40% a cada uma das soluções atraás mencionadas.

A saída do misturador de gradiente é ligada ã câmara (12), cuja extremidade é provisoriamente fechada, por exemplo com parafilme, até o processo de polimerização terminar. A polimerização continua durante cerca de 1 hora a 50°C (ou durante 2 horas a 37°C). 0 segmento superior de

GPI (5) (26 ml de volume total) contém uma matriz-(7% de T,4%

de C) dentro da gama de pH de 7,4-10,0, e anfólitos transpor tadores a 1% no mesmo intervalo de pH e é preparado a partir das soluções (a) e (b) abaixo mencionadas da seguinte maneira :

a) A solução densa ácida (pH 7,4) é preparada a partir duma mistura de 506 /11 de pK 3,6, 387 μ\ de pK 7,0, 361 /11 de pK 8,5 e 46 /11 de pK 9,3 de Imobilinas (a partir de soluções de reserva 0,2M), 0,6 ml de Anfolina pH 7-10, 3,1 ml de acrilamida-(30% de T, 4% de C) de reserva e 3,6 ml de glicerol, por adição de água a 13 ml.

b) A solução leve básica (pH 10) é preparada a partir duma mistura de 93 μ 1 de pK 3,6, 335 ul de pK 7,0 362 /11 de pK 8,5 e 289 /11 de pK 9,3 de Imobilinas, 0,6 ml de Anfolina pH 7-10 (todas as Anfolinas das soluções de reserva a 40%) e 3,1 ml de acrilamida-(30% de T, 4% de C) de reserva, por adição de água a 13 ml.

Uma vez transferidas para o misturador de gradiente, às soluções (a) e (b) são adicionados catalisadores (TEMED e persulfato de amónio, por esta ordem), como anteriormente. A saída do misturador de gradieii te ê ligada à câmara (5), cuja extremidade inferior é provisoriamente fechada.

Depois da polimerização ter terminado, os meios utilizados para fechar provisoriamente as câmaras (5) e (12) são removidos e as referidas câmaras contendo os geles de GPI assim preparados são construídas dentro do aparelho representado na Fig. 1.

Todos os iões não-anfÓteros (Imobilinas desenxertadas, catalisadores, tampões, etc) são removidos do gele, antes da aplicação da amostra, por pré-28-

-funcionamento durante 5 horas a 5 W/1000 Volt. Deste modo, a câmara de fluxo (8) fica limitada a um intervalo de pH estreito (pH 7,2-7,4) centrado no pi (7,30) da homoglobina de um adulto humano (pi típico da hemoglobina A de um adulto humano /HbAj num gele de GPI a 10°C). 70 mg do lisato total de um heterozigoto de hemoglobina C de adulto humano £HbC? (contendo cerca de 60% de HbA e 40% de HbC/, dissolvidos em 25 ml de anfólitos transportadores a 0,5% pH 6-8 são reciclados no aparelho pre-concentrado sob 1000 Volt constantes. Ao fim de intervalos de 30 minutos, recolhem-se amostras de 30 ul, as quais são guardadas a 4°C para análise subsequente. A experiência termina com a última recolha de amostra após 23 horas. Os aliquotas são analisados num gele de GPI-(5% de T, 4% de C) no intervalo de pH 6,5-8,5. Os resultados obtidos por analise densiométrica dos picos de HbA e HbC com um densímetro laser (fornecido por LKB) são apresentados na Fig. 5, em que o tempo ZhorasJ está definido ao longo do eixo dos xx e a quantidade /mg? de HbA e HbC ao lonfo do eixo dos yy. A curva I (triângulos refere-se ao HbA e a curva II ao HbC.Pode-se ver que, enquanto o HbA permanece constante durante a duração da experiência, o HbC é progressivamente removido até que, ao fim das 23 horas já não é possível detectá-lo.Após 12 horas de reciclagem, o HbA é pelo menos 95% puro, enquanto que, após 23 horas, é mais do que 99,5% puro.

Exemplo 2: remoção de matéria corante duma proteína

A fim de se apreciar o funcionamento do aparelho da Fig. 1 como uma unidade de electrodiálise, leva-se a cabo a análise da cinética da remoção de tintas coloridas (na forma de sais) de misturas de proteínas. No braço anódico (12) polimeriza-se um gele de GPI de pH 3,5-7,2 e no braço catódico (5) polimeriza-se um gel de GPI de pH 7,4-10. Deste modo, a alimentação é mantida a um pH

entre 7,2 e 7,4. Deste modo, a carga é mantida a um pH entre 7,2 e 7,4. A carga compreende uma solução de 40 mg de hemoglobina de adulto humano purificada em 0,5% de Anfolina a pH 6-8, à qual se adicionaram 10 mg de uma tinta ácida (azul bromofenol) e 10 mg de uma tinta básica (azul de toluidina) (25 ml de volume total). A remoção das referidas tintas submetidas a 1000 V constantes é seguida por recolha de amostras de 30 pl, ao fim de determinados intervalos de tempo e determinação das quantidades residuais por leituras espectrofotométricas a 600 nm. Os resultados são apresentados na Fig. 6, em que se pode ler o tempo Zhoras7 ao lonçjo do eixo dos xx e as quantidades das duas tintas ZmgJ ao longo do eixo do yy. A curva I (triângulos) mostra a migração catódica do azul de toluidina e a curva II refere-se à migração anôdica do azul de bromofenol. Conforme é mostrado na Fig. 6, ao fim de 2 horas praticamente todas as tintas já tinham sido removidas da câmara de fluxo, deixando a amostra de hemoglobina dessalifiçada. A velocidade de remoção parece seguir uma curva cinética de reacção de primeira ordem, dado que a curva (não representada) de log de concentração Vs. tempo é linear. A forma da curva I de azul de toluidina é inicialmente mais inclinada do que a de azul de bromofenol, mas as medições são complicadas pelo facto desta tinta parecer consistir numa família de três componentes, dado que se observaram três zonas de migração no gele superior.

Exemplo 3 dessa 1ificação da proteina ml duma solução de hemoglobina A de adulto humano (HbA) são traduzidas em 50 mM em NaCl e recicladas no aparelho representado na Fig. 1 a 10 W constantes e a 2°C. A câmara de reciclagem é delimitada por um pH de 7,2, como limite inferior, e por um pH de 7,4, como limite superior. A velocidade de reciclagem é de 10 ml/min. Ao fim

dos intervalos de tempo determinados, recolhem-se 2 ml de aliquotas que são mantidas a 25°C por meio dum termostato e são monitorizadas por meio dum medidor de condutividade (101) de Controlo Analítico, dotado de uma célula de condutividade Orion. As medições de condutividade são convertidas em milimoles residuais de NaCl. A dessalificação termina praticamen te ao fim de duas horas. A cinética de dessa 1ificação de HbA é mostrada na Fig. 7, em que ao longo do eixo dos xx se pode ler o tempo /.'horas.? e ao longo do eixo dos yy pode-ée ler a quantidade de cloreto de sódio /milimolesj.

Exemplo 4: purificação de N-aceti1-Eglina C

a) 0 ponto isoeléctrico de N-acetil-Eglina C (pl=5,5) é determinado sobre placas de PAG de Anfolina pH 3,5-9,5, 5% de T, 3% de C, 2,2% de concentração de Anfolina.

Cerca de 350 jug no total de proteínas são aplicados a cada recipiente (em volumes até 20 μ 1) e depois a concentração é efectuada a 10 W como limite, 10 mA e 1000 V em equilíbrio. Os tratamentos analíticos terminam geralmente ao fim de 2 horas e depois os geles são fixados e tingidos com Azul de Coomassie.

A solução de fixação é preparada por dissolução de 15 g de ácido tricloroacético em água duplamente destilada e por adição de água duplamente destilada até um volume total de 100 ml.

A solução corante é preparada por dissolução de 0,46 g de Azul de Coomassie R 250 em 400 ml da solução de descoloração atrás mencionada. A solução obtida é aquecida até 60°C e é filtrada antes da utilização. A solução de descoloração atrás mencionada é preparada por adição de água duplamente destilada a 500 ml de etanol até um volume total de 1000 ml (solução I), por adição de água duplamente

destilada a 80 ml de ácido acético até um volume total de 1000 ml (solução II) e por mistura das soluções I e II na proporção de 1:1 (v/v) antes da utilização.

b) Para a manufactura de duas membranas de Imobilina isoeléctricas, anfóteras, pH 5,5, 10,512 ml de uma solução 0,2M de Imobilina pK 4,6 e 9,664 ml de uma solução de Imobilina pK 9,3 são misturados e diluídos com água duplamente destilada para um volume total de 30,0 ml. 0 valor de pH da solução assim obtida é determinado, por meio dum medidor de pH, ser 5,5. Adicionam-se à referida solução 40,0 ml da solução A (ver em baixo), 1,5 ml de Anfolina de pH 5-7, 9 /j1 de TEMED 120 /jl da solução B (ver a seguir) e água duplamente destilada até um volume total de 120,0 ml. A solução A atrás mencionada ê preparada por dissolução de 28,8 g de acrilamida e 1,2 g de N,N¹-metileno-bis-acrilamida em água duplamente destilada e adição de água até um volume total de 100 ml. A solução B atrás mencionada é preparada por dissolução de 400 mg de persulfato de amónio em 880 μΐ de água duplamente destilada.

ml da solução obtida são deitados em cada um dos dois aparelhos descritos a seguir (ver c) e polimerizados a 50°C durante uma hora.

c) 0 aparelho mencionado anteriormente, utilizado para preparar as membranas, compreende uma placa feita de um material inerte, por exemplo pol itetraf luoroeti leno (Teflon®), que não adere ao polimerizado ou então que adere apenas num grau desprezável. Na referida placa coloca-se um disco perfurado (22) que se apresenta separado da referida placa por meio duma junta anelar (23) possuindo um diâmetro de 9 cm e uma espessura de 1 mm. A Fig. 9 mostra a vista inferior do referido disco, a Fig. 10 a vista superior e a Fig. 11 uma vista em corte transversal através da linha XI-XI indicada na Fig. 9. A solução a ser polimerizada é introduzida através dos furos (24) do disco perfurado.

d) as membranas obtidas de acordo com o processo descrito anteriormente, conjuntamente com as placas transportadoras perfuradas (22) são então formadas dentro dum cilindro com um diâmetro interior de cerca de 9,5 cm e uma altura entre as membranas de cerca de 3 cm. 0 referido cilindro está dotado de uma entrada (31) e de uma saída (30), uma oposta à outra, para entrada e saída do fluxo hidráulico (7) e é utilizado como câmara de fluxo (8). Se desejado, um filtro millipore (8 um) feito de celulose-acetato ou 6,6-poliamida (Nilon), ou equivalente, por exemplo um filtro de polipropileno pode ser colocado entre as membranas de pH (25) e (26) e o fluxo hidráulico (7), evitando que a substância a ser purificada (por exemplo, N-aceti1-Eglina C) entre em contacto directo com as membranas isoeléctricas.O aparelho de electroconcentração é completamente montado, em que o cilindro atrás mencionado com as membranas construídas substitui a câmara de fluxo (8) e os gradientes de pH imobilizado (5) e (12). Preferivelmente, o referido cilindro é utilizado na posição horizontal, com a entrada e saída posicionadas verticalmente estando a saida situada acima da entrada. A vantagem da disposição horizontal em comparação com a montagem vertical é a de que as bolhas de ar são espontaneamente removidas.

A Fig. 12 mostra uma vista transversal do aparelho montado. Um tubo cilíndrico é segmentado pelas membranas de pH suportadas (22) na câmara catódica (3), na câmara de fluxo (8) e na câmara anódica (14). 0 cátodo (2) e o ânodo (13) estão ligados por meio de fichas (32) à fonte de energia (1) /jião mostradaj. 0 fluxo hidráulico (7) entra na câmara de fluxo (8) por meio da entrada (31) e deixa-a através da saida (30). A solução de electrólito nas câmaras catódica e anódica pode ser renovada através da entrada e saida (27) e (28). As diversas partes do aparelho são mantidas unidas por meio de quatro pernos roscados (29) q£ são inseridos nos furos (33).

e) 0 aparelho de electroconcentração montado é posto em pré-funeionamento durante 1 hora a 500 Volt, 25 mA e 10 W numa sala fria (+5°C), com a câmara de fluxo cheia de liquido, mas sem a amostra de N-acetil Eglin a ser purificada. Então a câmara de fluxo é esvaziada e cheia com a amostra a purificar.

f) 1 g da amostra contendo ADN-N-acetil Eglina C (pureza: 80%, preparado de acordo com o pedido de patente Europeia No. 146 785) ê dissolvido em 100 ml de anfólidos transportadores a 0,2% com um pH de 5-7 e é reciclado (20 ml/minuto) no aparelho pré-concentrado sob 500 Volt constantes e mA/5 W, numa sala fria (+5°C). Ao fim de intervalos de 30 minutos, retiraram-se amostras de 100 μ 1 e estas são maii tidas a 4°C para análise subsequente. A experiência termina com a última recolha de amostra ao fim de 5 horas.Os aliquotas são analisados numa placa de PAG de Anfolina com um pH de 3-5-9-5 5% de T, 3% de C, 2,2% de concentração de Anfolina. Observou-se que todas as impurezas foram removidas apôs 3 horas de reciclagem.

Se desejado, as soluções dentro das câmaras catódica (3) e anódica (14) podem ser bombadas para uma linha de esgoto a uma velocidade de por exemplo 5ml/minuto e regeneradas a partir de grandes reservatórios.

Exemplo 5: membranas com capacidades de tamponagem diferentes .

Análogos das membranas de pI=5,50 apresentadas no Exemplo 4 são preparadas para incorporarem uma concentração de 10 mM, de 40 mM ou de 100 mM das Imobilinas.

Enquanto que as membranas de 10 e de 40 mM apresentam propriedades electroosmóticas correctas

e produzem valores de pi experimentais precisos, a superfície de 100 mM apresenta uma dispersão muito maior e mostra perfis de fluxo anómalos na zona de pH vizinha do pi. Parece assim razoável fixar um limite superior de molaridade de cerca de 50 mM de cada Imobilina na membrana.

Claims

1^{2 * * 5}. - Processo electroforético de concentração isoelêctrica para a separação e purificação de um composto anfôtero ou neutro, solúvel num solvente adequado para o referido processo, a partir de um ou mais compostos químicos carregados electricamente, solúveis no referido solvente, sendo o referido processo, realizado por utilização de um aparelho electroforético, em que a corrente eléctrica que passa através da matriz electroforética é associada a uma corrente hidráulica, sendo a direcção da referida corrente eléctrica diferente da corrente hidráulica, em que a referida corrente hidráulica compreende uma solução do referido composto no referido solvente, e divisão da referida matriz em duas partes, sendo uma das partes localizadas no lado catódico e a outra localizada no lado anódico, caracterizado por o referido composto químico anfôtero ou neutro ser mantido num estado isoeléctrico ou descarregado dentro da corrente hidráulica e por o(s) referido(s) composto (s) quimico(s) ser(em) removido(s) da corrente hidráulica pela corrente eléctrica para dentro de pelo menos uma das duas referidas partes da referida matriz, ou por meio de pelo menos uma das referidas partes para dentro de pelo menos um dos dois reservatórios de solução electrólito, representando cada uma das partes, independentemente uma da outra, gradientes de pH imobilizadas, cada um possuindo condutividade e ambas as capacidades de tamponagem e de titulação no seu intervalo de pH, ou membranas de pH imobilizadas, isoeléctricas e anfóteras, cada uma possuindo condutividade e as capacidades de tamponagem e de titulação, a um valor de pH especifico.

2³. - Processo electroforético de concentração isoelêctrica de acordo com a reivindicação 1 para a separação e purificação de um composto químico anfôtero ou neutro solúvel num solvente adequado ao referido processo,

-36a partir de um ou mais compostos químicos electricamente carregados solúveis no referido solvente, caracterizado por a corrente eléctrica estar associada a uma corrente hidráulica, cuja direcção é diferente da corrente eléctrica, e por o composto químico anfótero ou neutro ser mantido isoeléctrico ou descarregado dentro da corrente hidráulica, sendo os compostos químicos carregados removidos da corrente hidráulica pela corrente eléctrica para dentro de pelo menos um dos dois gradientes de pH imobilizados, ou por meio dos gradientes de pH para dentro de pelo menos um dos dois reservatórios de solução de electrólito.

3^â. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2 caracterizado por se separar e purificar um composto quimico anfótero a partir de um ou mais compostos químicos anfóteros, cujos pontos isoeléctricos são suficientemente diferentes do ponto isoeléctrico do composto desejado que é mantido isoeléctricoddentro da corrente hidráulica.

4^â. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 caracterizado por se separar e purificar um composto quimico anfótero a partir de um ou mais sais.

5^â. - Processo de acordo com a reivindicação 4 caracterizado por os sais serem sais de ácidos e bases monovalentes.

6^ã. - Processo de acordo com a reivindicação 4 caracterizado por os saís serem sais de ácidos e bases di- ou muItivalentes, ou sais de ácidos ou bases di- ou multivalentes.

7^â. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 caracterizado por o composto quimico a ser purificado ser um peptido, uma proteína ou um composto contendo uma porção peptidica ou de proteína, em que cada uma tem um ponto isoeléctrico entre pH 3 e 10.

8^a. - Processo de acordo com a reivindicação 7 caracterizado por o composto químico a purificar ser um peptido, uma proteína ou um composto contendo uma porção peptidica ou de proteína, tendo cada um ponto isoeléctrico entre pH 5 e 9.

9^a. - Processo de acordo com a reivindicação 3, 7 ou 8, caracterizado por os pontos isoeléctricos do composto anfôtero a purificar e dos compostos anfóteros indesejáveis a serem removidos diferirem de pelo menos 0,001 unidades de pH.

10^a. - Processo de acordo com a reivindicação 9 caracterizado por os pontos isoeléctricos diferirem de pelo menos 0,05 unidades de pH.

11^a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10 caracterizado por a direcção da corrente hidráulica ser ortogonal à direcção da corrente eléctrica.

12^a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11 caracterizado por a direcção da corrente hidráulica ser tal que as bolhas de ar são removidas da câmara de corrente.

13^a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-12 caracterizado por os gradien tes de pH imobilizados terem ambas as capacidades de tamponagem e de titulação no seu intervalo de pH e conterem uma quantidade de anfólitos no mesmo intervalo que assegura uma condutividade suficiente.

14³. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1-13 caracterizado por os gradientes de pH imobilizados e as membranas de pH imobilizadas possuírem uma capacidade de tamponagem e de titulação, um valor de pH e uma condutividade controlados e por poderem ser preparacts de uma maneira re-produtível.

15^ã. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-14, caracterizado por o composto desejado estar presente numa solução aquosa.

16^ã. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 3-15, caracterizado por os pontos isoeléctricos nas extremidades dos gradientes ou membranas de pH adjacentes à câmara de corrente serem iguais ou ligeiramente inferiores ao ponto isoeléctrico do composto quimico anfótero a ser purificado (lado anódico) e igual, ou ligeiramente superior ao ponto isoeléctrico do referido composto quimico anfotérico a ser purificado (lado catódico).

17^â. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 3-16 caracterizado por o valor de pH dentro da corrente hidráulica corresponder ao ponto isoeléctrico do composto desejado.

18³. - Aparelho electroforético de concentração isoeléctrica adequado para levar a cabo um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 17, caracterizado por compreender uma câmara de corrente ligada directa ou indirectamente quer

a) a dois contentores, sendo cada um deles cheio com um gradiente de pH imobilizado possuindo condutividade e ambas as capacidades de tamponagem e de titulação no seu intervalo de pH, quer

b) a duas membranas de pH imobilizadas, isoeléctricas e an-39- fóteras, possuindo condutividade e ambas as capacidades de tamponagem e de titulação a um valor de pH, especifico quer

c) a um gradiente de pH de acordo com a) anterior e a uma membrana de pH de acordo com b) anterior, sendo os pontos isoe léctricos nas extremidades dos gradientes ou membranas de pH adjacentes à câmara de corrente iguais ou ligeiramente inferiores ao ponto isoeléctrico do composto quimico anfótero a purificar (lado anódico) e igual ou ligeiramente superior ao ponto isoeléctrico do referido composto quimico anfótero a purificar (lado catódico) estando um dos gradientes de pH ou membranas de pH ligado pela sua outra extremidade à câmara anódica e estando o gradiente de pH ou membrana de pH remanescente ligado pela sua outra extremidade à câmara catódica.

19^â. - Aparelho electroforético de concentração isoeléctrica adequado para levar a cabo um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 17, caracterizado por compreender uma câmara de corrente ligada a dois contentores, em que cada um deles é cheio com um gradiente de pH imobilizado, tendo um dos gradientes, na sua extremidade ligada à câmara de corrente, um ponto isoeléctrico ligeiramente inferior ao ponto isoeléctrico do composto quimico anfótero a purificar estando a outra sua extremidade ligada à câmara anódica, e tendo o gradiente de pH, remanescente na sua extremidade ligada à câmara de corrente, um ponto isoeléctrico ligeiramente superior ao ponto isoeléctrico do referido composto quimico anfótero a ser purificado, estando a sua outra extremidade ligada à câmara catódica.

20³. - Aparelho de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado por a cârftara de correii te estar ligada por meio duma bomba ao reservatório da amostra.

21^a. _ Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20 caracterizado por estar ligado a um dispositivo para manter os gradientes de pH e a amostra a uma temperatura ambiente.

22^a. - Aparelho de acordo com qualquer das reivindicações 18 a 21 caracterizado por estar ligado pelo menos a um dos seguintes dispositivos: dispositivo para medição e controlo do pH, dispositivo para vigilância da condutividade, sistema de detecção de biossensores, equipamento imunoelectroforêtico, equipamento de detecção fluorescente excitado por laser, sistema ligado roboticamente, dispositivo para vigilância de radioisótopos, ou um dispositivo para vigilância da solução amostra em observação por UV, visivel ou fluorescente.

23^a. - Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 22 caracterizado por estar ligado a um dispositivo de suporte mecânico do gel de gradiein te de pH nos dois contentores, ou no gel das duas membranas de pH.

24^a. - Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 23 adequadas para a purificação simultânea de dois compostos anfóteros ou neutros, caracterizado por compreender duas câmaras de corrente, separa_ das uma da outra por um gradiente de pH imobilizado intermédio, ou por uma ou duas membranas de pH.

25^a. - Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 24 caracterizado por estar numa posição tal que as bolhas de ar são removidas da câmara de fluxo pela corrente hidráulica.

26³. - Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 25 caracterizado por os gradientes de pH imobilizados e as membranas de pH imobilizadas terem capacidades de tamponagem e de titulação, um valor de pH e condutividade controlados e por poderem ser preparados duma maneira reprodutível.

27³ . - Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 26 caracterizado por os gradientes de pH imobilizados e as membranas de pH imobilizadas terem capacidades de tamponagem, e de titulação controladas e conterem anfólitos em quantidade tal que assegure um valor de condutividade suficiente.

28³. - Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 27 caracterizado por estar ligado a correntes de entrada e de saída para renovação das soluções de electrólito dentro das duas câmaras catódica e anódica.

29³. - Aparelho electroforético de concentração isoeléctrica adequado para ser utilizado num processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 17, caracterizado por compreender uma câmara de corrente ligada directa ou indirectamente quer

a) a dois contentores, adequados para recolherem um gradiente de pH imobilizado, quer

b) a dois dispositivos para recolherem as duas membranas de pH imobilizadas, quer

c) a um contentor de acordo com a) anterior e a um dispositivo de acordo com b) anterior, estando um dos contentores ou dispositivos ligado pela outra extremidade à câmara anódica, e o outro contentor ou dispositivo ligado pela sua outra extremidade â câmara catódica.