CN101896250A - 提纯分子的装置 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于在分离步骤之后俘获并收集被分离的生物分子的设备。本发明提偶那个一种包括分离设备和收集腔的装置。所述收集腔包括:适配成接收所述分离设备端部的进入端口;包括俘获介质的排出端口和位于所述进入端口和排出端口之间的存取端口,其中,通过调节所述分离设备相对于所述存取端口处于所述进入端口的深度来调节所述收集腔的容积。
Description
优先权要求
本申请要求2007年10月9日提交的美国临时申请No.60/978,507的权益,该临时申请通过引用而全文包含在本文中。
技术领域
本发明涉及用于在分离步骤之后俘获并收集被分离的生物分子的设备。本发明还涉及使用该设备的方法。
背景技术
分析生物分子,诸如蛋白质、多核酸、脂类和碳水化合物,通常需要一种分离和/或提纯装置。因此,在分离和提纯过程之后,必须收集感兴趣的样本并将其转移到后续分析平台诸如色谱仪。许多方法可以用来进行分离,包括色析分离和电泳分离。不同类型的分离过程背后的原理是使得各种生物分子移动,以不同速率经过分离介质,以便复杂样本中的各种分子在分离过程中从空间上分开。因此,一旦分离过程结束,如何保持空间分辨力就成为一个问题,因为样本离开分离介质并准备转移到下一步骤(例如,另一个分离步骤或分析步骤)。
利用提供高分辨力、再现性和回收率的优选系统进行分离对于蛋白质组分析来说至关重要。在蛋白质学中,基于MS的肽序列策略在分析之前采用熟知的分离技术来降低样本复杂性(Washburn,et al.,2001)。在完整蛋白质水平,二维电泳法继续被广泛采用,但仍然与无可匹敌的分辨力程度相去甚远(Gorg,et al.2004),但是二维电泳法无法提供分离系统的众多期望特征(Gygi,et al.2000)。
近来由Brunner等描述蛋白质学“定靶”散弹方案的报告示出了完整蛋白质预先分馏来改善分析的重要性(Brunner,et al.,2007)。逐渐受到欢迎的顺选蛋白质分析同样点燃了对有效蛋白质分离策略的需求。虽然如此,除了一些有名的个案之外(Nilsson and Davidsson,2000;Shi,et al.,2004;Wang andHanash,2005;Lubman,et al.,2002),优化并开发完整水平的蛋白质组分离新方案仍然是未开发的领域。
发明内容
本发明涉及在分离步骤之后俘获并收集生物分子的装置和方法。
在第一方面,本发明提供一种包括分离设备和收集腔的装置。所述收集腔包括:适配成接收所述分离设备端部的进入端口;包括俘获介质的排出端口和位于所述进入端口和排出端口之间的存取端口,其中,通过调节所述分离设备相对于所述存取端口处于所述进入端口的深度来调节所述收集腔的容积。在一种实施方式中,所述分离设备包括电泳分离设备。该实施方式的所述分离设备可以具有长度为10cm以下的分离路径和/或包括含有二聚丙烯酰胺或琼脂的分离介质。在特定实施方式中,所述分离设备包括聚丙烯酰胺凝胶,所述凝胶包括高度为6cm以下且直径大约为0.2-1.0cm的溶解凝胶。
在另一种实施方式中,所述装置的收集腔包含一个或多个可拆卸的俘获器。所述俘获器可以包括疏水俘获器、亲水俘获器、离子交换俘获器、分子量截止俘获器、亲和性俘获器或者它们的组合。在包含一个以上俘获器的实施方式中,所述俘获器可以串联排列。
在另一种实施方式中,所述收集腔内的所述存取端口进一步包括阀。
在另一种实施方式中,所述收集腔内的所述排出端口中的所述俘获介质包括分子量截止值大约为1kDa到大约10kDa的膜。
在额外的实施方式中,所述装置包括两个或更多个收集腔。
所述收集腔可以用单独一块材料构造。此外,所述存取端口之间的间隔可以设计成容纳标准多通道吸移管管理器。所述存取端口可以设计成容纳标准吸移管末端。
在另一种实施方式中,所述装置包括两个以上的分离设备和两个以上的收集腔。所述分离设备的数目可以等于所述收集腔的数目,并且每个收集腔紧接在分离设备的下游设置。所述分离设备和所述收集设备可以并排排列。所述多分离设备和收集腔的结构可以为平面状。所述复用设备还可以配置成弧形、半圆、半椭圆或管形。所述管形结构可以是柱状或椭圆状。各分离设备可以并排排列,或者形成另一种结构,诸如块体,取决于所述复用装置中的单元数目。所述复用装置可以包括8个分离设备和8个收集腔。
在另外的实施方式中,所述装置进一步包括设置在所述分离设备上游的上部腔室和设置在所述收集腔下游的下部腔室。
在第二方面,本发明提供一种利用本发明的装置从一个或多个样本中提纯多种分子或分子分馏物的方法,所述方法包括步骤:(1)提供一个或多个样本;(2)利用所述装置的分离设备分离分子;和(3)经由所述收集腔中的所述存取端口依次收集多种分馏物。
在第二方面的一种实施方式中,所述方法进一步包括步骤:向所述分离设备施加样本,其中所述设备的装载端抬高到与水平方向的夹角大于10度。在另一种实施方式中,所述方法进一步包括步骤:允许所述样本向所述分离设备中迁移,然后放下所述设备,使其与水平方向的夹角小于10度。
在第二方面的另一种实施方式中,所述分离步骤在停止并运行的循环中实施,在每个收集步骤中暂时停止分离步骤,随后在完成每次收集步骤之后,重新启动分离步骤。
在第二方面的另一种实施方式中,在所述装置处于水平位置的同时,实施所述分离步骤和收集步骤。
在另一种实施方式中,所述方法进一步包括步骤:通过调节所述分离设备处于所述收集腔中的所述进入端口中的深度来调节所述收集腔的容积。
在另外一种实施方式中,被收集的分馏物中的分子较之它们在样本中的浓度,具有相同或更大的浓度。在另一种实施方式中,所述分馏物包括可拆卸的俘获器。所述分馏物还可以在所述收集腔内包括可拆卸的俘获器和溶液。
在另一种实施方式中,所述样本包括粗细胞提取出、局部提出的提取物、或者先前通过等电子聚焦或其他方法分离的样本。
在额外的实施方式中,所述装置使用电泳分离设备,其中利用大于240伏特的电压对分子进行分离。在进一步的实施方式中,所述分离和收集步骤在大约100分钟内实施。被分离的分子可以是蛋白质,介于大约5kDa到大约200kDa之间,并且分子量偏差大约5kDa的分子被有效地分离。
在另一种实施方式中,所述方法进一步包括步骤:在每次收集步骤之后,向所述收集腔添加缓冲剂。
附图说明
图1是所述设备一种实施方式的截面图;
图2是所述设备一种实施方式的俯视图;
图3是收集腔的三维视图;
图4是收集腔的侧视截面图;
图5是收集腔的截面图;
图6示出了所述设备一种实施方式的照片,示出了在聚丙烯酰胺凝胶上运行的预染色蛋白质分离过程;
图7是复用设备一种实施方式的俯视图;
图8是复用设备收集腔的三维视图;
图9是复用设备收集腔的侧视截面图;
图10是复用设备收集腔的截面图;
图11示出了从1cm和3cm长的溶解SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离的枯草芽孢杆菌蛋白质收集的分馏物的银染色凝胶;
图12示出了染色聚丙烯酰胺凝胶的照片,指示出从收集腔回收的蛋白质量;
图13示出了染色聚丙烯酰胺凝胶的照片,指示出了利用GeIFrEE(凝胶分馏物俘获电泳)设备进行的3次独立的分离过程。
具体实施方式
本发明的装置和方法相对于在分离步骤之后俘获并收集被分离的生物分子的其他装置和方法来说,提供众多优势。首先,本发明的装置将生物分子分离与从分离介质隔离直接耦接。第二,所述装置和方法用于与隔离同步浓缩生物分子。第三,所述装置和方法用于高效回收生物分子,即使在低至μg以下水平。第四,生物分子分离与洗脱和隔离整合,在节省时间、减少所需的步骤并减少所述装置所需的空间方面为使用者带来显著的优势。第五,所述装置可以容纳多种不同的分离设备和分离介质。第六,所述装置可以与其他分离和分析设备整合,以实现多维度平台,这种平台可以全面并有针对性地分析生物分子。
Ⅰ装置
本发明的装置包括收集腔,分离设备可以直接与该收集腔接合。
A.收集腔
本发明的装置的收集腔设计成俘获腔室内的生物分子。所述收集腔还设计成在被分离的样本离开所述分离设备之后,保持所述被分离样本的空间分辨度。为了实现这一目的,所述收集腔直接与所述分离设备接合。所述收集腔包括进入端口、排出端口和存取端口。所述存取端口允许直接存取被俘获的样本,以便于样本收集。
1.进入端口
所述收集腔的进入端口允许直接与所述分离设备接合。所述进入端口设计成适应所述分离设备端部的尺寸。因此,所述进入端口包括圆形、椭圆形或矩形孔,或者柱状、椭圆管或实心矩形,以允许所述分离设备的端部直接耦接到所述收集腔。所述进入端口可以任选包含膜,所述膜可以是分子量截止膜。在一种实施方式中,所述膜是将分离介质保持在分离设备中的膜,以便所述分离介质不会进入所述收集腔。在另一个实施方式中,所述膜可以是具有较高分子量截止值的膜,诸如500kDa。可以提供用于密封所述分离设备的部件,以防止所述分离设备与所述收集腔的结合部发生流体渗漏。所述密封部件取决于分离介质,并且可以使用也可以不使用。例如,对于凝胶电泳法来说,密封部件可以包括橡胶O形环和夹板。分离设备与收集腔经由进入端口耦接,允许收集多个被分离的分馏物。
所述进入端口还设计成让所述收集腔的容积可以通过控制所述分离设备进入所述进入端口的深度而方便地调节。
2.排出端口
所述收集腔的排出端口提供离开所述收集腔的通道,并位于所述进入端口下游。所述排出端口包括俘获介质,所述俘获介质对于溶剂以及特定溶质(例如,盐、缓冲成分,可能还有不想要的生物分子)具有选择渗透性。所述俘获介质可以包括众多俘获介质中任意种类。在一种实施方式中,所述俘获介质是分子量截止膜。所述膜可以是众多膜中的任意种类,包括但不限于透析膜、硝酸纤维素膜、超滤膜或其他分子量截止膜。所述截止分子量应该小于感兴趣的最小样本成分的分子量,例如1-10kDa。分子量截止膜或其他俘获介质,有选择地允许一些分子诸如分子量较小的分子通过。这种选择性允许在隔离生物分子的同时将它们浓缩。
3.存取端口
所述存取端口包括所述收集腔中位于所述进入端口和排出端口之间的开口。所述开口可以具有任何结构和尺寸,包括但不限于圆形、椭圆形或矩形开口,或者包括柱状管、椭圆管或实心矩形的开口。在一种实施方式中,所述开口包括置于所述腔中的液体液位以上的孔。在该实施方式中,所述分离设备在水平位置运行,或者在水平位置和垂直位置之间的位置运行。在另一个实施方式中,所述存取端口容纳标准吸移管末端。在另一种实施方式中,所述存取端口允许分子俘获器插入和取出。因此,所述存取端口允许方便地存取,用于管理和收集被分离的分馏物,无论它们被俘获在俘获设备中还是处于溶液中。
所述存取端口可以包括阀。如果所述分离设备以垂直位置工作,则阀特别有用。所述阀可以是简单阀,诸如旋塞阀、勒尔锁、端面密封或侧面密封阀。所述阀还可以是单向阀,所述单向阀在打开时仅允许液体向一个方向流动。单向阀的示例包括但不限于止回阀,诸如在Kim和Bee(2007)的文章中描述的止回阀;或者Cheung和Morioka(1990)的文章中描述的单向阀。其他单向阀的示例包括那些用在医疗设备中的阀替代品的阀。
4.内部
所述收集腔的内部允许保持分馏物,无论处于溶液相还是固相。所述内部由所述收集腔的壁所述限定。所述收集腔可以具有任何结构,包括但不限于柱形、球形、正方形和其他结构。在一种实施方式中,所述收集腔的内部为柱形,直径大约等于柱状分离设备的外径。
所述收集腔的内部还可以容纳俘获设备,诸如疏水性俘获器、亲水性俘获器、分子量截止俘获器、离子交换俘获器(阴离子和/或阳离子)、亲和俘获器或者它们的组合。所述俘获器可以包括俘获具有特定物理属性的分子,所述物理属性诸如尺寸、电荷、疏水性、亲水性、对配体的亲和性或者它们的组合。所述介质可以包含在允许分子进入并离开所述俘获器的腔室中。例如,俘获器可以包含离子交换树脂。在另一个示例中,不作为限制,所述俘获器可以是保护柱插件诸如Phenomenex(Torrance,California)提供的保护插件。在一种实施方式中,所述收集腔可以容纳一种以上的俘获器,以便可以同时俘获不同类型的分子。所述俘获器还可以在所述收集腔中依次排列。
在另一个实施方式中,一个以上的所述收集腔存在于包括一个分离设备的装置中。在该实施方式中,所述收集腔可以排列在所述分离设备下游。以这种方式对齐的收集腔在它们之间具有不同的分子量截止膜。在另一种实施方式中,所述收集腔可以包括不同的分子俘获器。
B.分离设备
本发明的装置还包括用来分离生物分子的分离设备。所述分离设备包括分离介质和包含所述分离介质的壳体。
所述分离介质包括任何用于分离生物分子的介质。所述介质包括但不限于根据分子的尺寸和质量分离生物分子的介质。
这些介质包括但不限于凝胶过滤材料,诸如葡聚糖凝胶和琼脂糖以及用于根据分子尺寸进行电泳分离的材料,包括聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶。其他分离介质包括离子交换材料,包括阳离子和阴离子交换树脂;亲和材料,包括普通亲和材料诸如磷酸纤维素、羟基磷灰石和蓝色葡聚糖。也包括更为专用的亲和材料,诸如携带配体的材料,特定的生物分子键合到所述配体。所述配体包括但不限于,抗体、蛋白质、肽、核酸序列、碳水化合物和其他配体。所述分离介质还包括根据疏水性而分离生物分子的疏水材料和亲水材料。
所述分离介质容纳在设备中,所述设备通常具有上游端和下游端。所述设备可以表现为任何形式,包括标准圆柱体。另一种形式是实心矩形,例如为板条聚丙烯酰胺凝胶。用于分离介质的壳体的尺寸可以显著变化,取决于分离介质和样本尺寸。对于圆柱体来说,尺寸可以从短小的毛细管柱体变化到用于大型分离的非常巨大的柱体,通常用于商业分离。还包括固定相填充柱。实心矩形壳体可以类似地从非常小的壳体变化到非常大的壳体。
所述收集腔的进入端口以及在一些实施方式中,所述收集腔的尺寸设计成容纳分离设备壳体。
需要驱动力来移动生物样本通过分离介质。所述分离设备利用驱动力让溶质向收集腔的方向移动,所述驱动力诸如,但不限于,电泳作用、压力、重力渗透、温度梯度、盐度梯度或者它们的组合。
在驱动力(诸如高压)导致发热的情况下,可以使用热传递设备或冷却设备来冷却所述设备。
C.附件
所述设备一般包括位于所述分离设备上游和所述收集腔下游的腔室。所述腔室可以包含移动生物分子通过所选分离介质所需的缓冲剂。
所述设备还可能要求密封所述装置以防止泄露的装置。所述密封装置可以包括橡胶垫片和夹板或螺母和螺栓,以及本领域技术人员已知的用于密封的其他装置。所述密封装置还用于密封所述收集腔排出端口处的所述分子量截止膜。
D.材料
所述设备还可以由相对刚性的支撑材料形成,所述刚性材料不会和与其接触放置的材料发生反应。所述材料也可以是不导电的。材料包括但不限于,聚甲基丙烯酸酯、塑料、聚丙烯、聚碳酸酯、PTFE、TEFLON或者其他不反应的或化学惰性的材料。此外,可以使用一种以上的材料来制作所述设备。
E.聚丙烯酰胺电泳
当蛋白质洗脱顺序以可预测的方式发生时,蛋白质组分离最为有益。这种可预测性允许隔离特定的蛋白质或者蛋白质类(例如,PTM蛋白质富集),并且还协助识别过程(Pal,et al.,2006)。蛋白质的分子量恒定,且清楚地提供一种明显不受样本或溶剂条件影响的确定参数。与电荷和疏水性两者正交,蛋白质的分子量提供一种非常令人期待的分离模式。不幸的是,建立起来的根据尺寸来分离蛋白质的基于溶液的系统非常少有。膜过滤和超滤策略固有地劳动量大,并且分辨度较低。尺寸排阻色谱法已经耦接到其他分离平台(Bushey and Jorgenson,1990;Opiteck and Jorgenson,1997;Lecchi,et al.,2003),但是在蛋白质组学方面尚未具有广泛应用,原因是其峰值容量相对较低。分辨度、处理能力以及样本回收率高的基于尺寸的蛋白质分离平台将给出更为令人期待的系统。
十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS PAGE)是可论证的用于根据尺寸分离蛋白质的最佳方法。有意思的是,SDS PAGE最严重的局限涉及通常在吸收之后从凝胶中回收蛋白质,而不是涉及分离过程本身(Rabilloud,2002)。SDS的存在可以对MS(质量光谱)分析带来迫在眉睫的限制。但是,SDS的好处在于实现了根据尺寸可预测地分离,以及协助蛋白质溶解作用,可论证地超出其缺陷。鉴于此,最好是利用SDS PAGE对于分子量分离的高分辨能力,同时避免繁重的污点切除、凝胶内吸收以及肽提取工作。
作为溶剂提取的替代方案,在SDS PAGE之后,将蛋白质从凝胶中电泳隔离。Bio-Rad提供的Whole Gel Eluter在整个凝胶范围内采用电洗脱策略。Davidsson等人已经使用这种系统来分馏并分析人体脑脊髓液中的蛋白质(Davidsson,et al.2001)。虽然这种设备实现了广泛的基于尺寸的分离,但是这种设备可以获得的分馏物数量受到限制,制约了优化分辨度的灵活性。此外,样本装载能力受到板条凝胶的尺寸限制。此外,Whole Gel eluter也难于实现复用,并且不容易整合到基于多维度溶液的平台中。
作为制备凝胶电泳法的不同策略,可以通过连续施加分离电场,从凝胶“柱体”的端部洗脱蛋白质,其中蛋白质被分子量膜俘获并随后被收集(Lewisand Clark,1963;Racusen and Calvanico,1964;Jovin,et al.,1964;Shain,,et al.,1992)。这种技术一般称为连续洗脱管凝胶电泳法。虽然其良好地建立了以极高的分辨度提纯蛋白质的能力(Masuoka,et al.,1998),但是利用这种方法分馏完整的蛋白质组的能力仍然存在问题(Rose and Opitek,1994;Meng,et al.2002;Du,et al.,2004)。一般来说,建立在这种方案基础上的系统偏向于分子量较低的蛋白质(Meng,et al.,2002;Du,et al.,2004,Zerefos,et al.,2006;Xixi,et al.,2006)。目前系统的其他严重局限包括较长的分离时间;样本装载量低时回收率不良;和分离过程中不可接受的大量稀释样本,特别是在高分子量时。在连续洗脱电泳技术可以普遍用于全面、广泛的大量蛋白质组分离之前,需要克服这些困难。
若干技术可以用于根据分子量来分离蛋白质和其他材料,包括超速离心法、膜过滤法、凝胶过滤色谱法和毛细(凝胶)电泳法。但是,在全部技术中,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法无疑提供最高程度的分辨力。传统形式的薄分析板条凝胶不仅允许简单而有效地散热,而且在分离之后可以方便地存取凝胶用于样本切除。历史上,PAGE在管状凝胶中实现。简单地通过增加冷却设备,电泳柱体的柱状形状可以放大,以实现更高的装载容量,用于分离较大质量范围的蛋白质组。
与本发明的装置一起使用的制备凝胶电泳法改型方案具有多种优势。首先,适应较宽质量范围的蛋白质分离。第二,允许在大约6kDA到大约200kDA的分子量范围内迅速分馏蛋白质组。第三,在分离之后,随着样本被收集而浓缩蛋白质。第四,允许对低至亚微克水平的样本装载量实现较高的回收率。第五,允许全面、可重复的分离复杂蛋白质提取物。第六,可以适用于隔离并利用质谱分析识别极高MW的蛋白质组分馏物。
在一种实施方式中,所述装置包括小于2cm的短小聚丙烯酰胺柱体。使用短凝胶的优势在于分离更快,因为洗脱时间与凝胶长度成正比。较短的柱体也意味着被洗脱的分馏物随着时间被较轻微地稀释。此外,可以使用更高的电压,因为发热较少。一方面,所述分离设备包括小于2或3cm的短小的聚丙烯酰胺溶解凝胶和任选的2-3cm的积层凝胶。溶解凝胶可以具有百分比较高的交联剂(大约12到15%),对于较短的凝胶而言,可以利用240伏特电压在一次90分钟的运行过程中,溶解从10kDa以下到250kDa的分子。凝胶的尺寸可以放大,以实现更高的装载容量。
较之SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法,根据分子重量分离蛋白质的不带凝胶的平台一般分辨力较低,并且不适用于较宽的质量范围。因此,本发明的一种实施方式优化制备凝胶电泳法技术,以适应在微克范围内迅速、较宽质量范围的蛋白质组分离。随着从凝胶柱体端部发生电泳迁移,蛋白质分馏物最终收集在溶液相中,产生术语后期不带凝胶的电泳法。本发明的这种实施方式,称为凝胶分馏物俘获电泳法或者GeIFrEE,因此为蛋白质组分馏提供了一种替代或补充分离工具,这种分离工具也能根据可预测并可重复的分离特性提供有关样本的有价值的固有信息。由于其设计紧凑且结构简单,所以GeIFrEE设备容易与复用技术相适应。
F.复用装置
本发明装置设计简单,允许复用该设备。复用设备包括两个或更多个收集腔,所述收集腔耦接到两个或更多个分离设备。每个收集腔和每个分离设备包括相同的部件,作为带有一个收集腔和一个分离设备的设备。
复用设备的原理是为了适应分离大量样本,每个样本位于其各自分离设备中,并且位于各自收集腔中。在一种实施方式中,收集腔的存取端口可以隔开,以便分馏物或样本可以利用标准多通道吸移管管理器收集,以便多个收集腔中的全部溶液可以同时转移。在另一种实施方式中,所述收集腔相连,并以相同的材料块制作。示例在图8中示出。
在另一种实施方式中,收集腔的数目少于分离设备。在一种实施方式中,两个分离设备洗脱到一个收集腔中,在另一种实施方式中,3个或更多个分离设备洗脱到一个收集腔中。
在另一种实施方式中,对于每个分离设备存在一个以上的收集腔。在一种实施方式中,所述收集腔排列在分离设备下游。例如,所述装置包括两个分离设备A和B以及6个收集腔1-6。收集腔1紧接在分离设备A下游,而收集腔2紧接在收集腔1下游,而收集腔3紧接在收集腔2下游。而且,收集腔4紧接在分离设备B下游,收集腔5紧接在收集腔4下游,而收集腔6紧接在收集腔5下游。以这种方式排列的收集腔可以在它们之间具有不同的分子量截止膜。在另一种实施方式中,它们可以包括不同的分子俘获器。
在另一种实施方式中,存在包含多条通道的一个分离设备,以适应一个以上的样本。例如,但不作为限制,所述分离设备可以是带有例如8通道的板条聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶。每个通道连接到收集腔。在这种实施方式中,所述收集腔可以用一块材料制成,或者每个收集腔可以用一块材料制成。
连接到收集腔的每个分离设备可以并排排列成不同结构,包括但不限于平面结构、弧形、半圆、板椭圆或者管状结构。所述管状结构可以是柱状管、椭圆管、矩形管或其他结构。
耦接到复用设备的收集腔的分离设备数目可以从2到20以上,取决于实际需要。在一种实施方式中,所述复用设备包括耦接到8个收集腔的8个分离设备。
复用装置中的每个分离设备可以与复用装置中的其他分离设备具有相同的结构并包含相同的分离介质。作为可选方案,每个分离设备可以具有相同结构,但是包含不同于同一复用装置中的其他分离设备的分离介质。另一种可选方案是,对于每个分离设备来说,具有不同于同一装置中的其他分离设备的结构,但是包含与其他分离设备相同的分离介质。第四种可选方案是,每个分离设备具有不同于同一装置中的其他分离设备的结构,且包含不同于其他分离设备的分离介质。这些不同的可选方案可以适应同一复用装置的不同分离设备上运行的不同样本,或者在同一复用装置的不同分离设备上运行的不同量的样本。
所述分离设备可以连接到一个上游腔室或每个分离设备具有其自身的上游腔室。例如,复用装置可以包括8个分离设备,它们全部连接到一个上游腔室,类似于图7所示的设备。作为可选方案,复用装置中的每个分离设备可以具有其自身上游腔室,以便对于带有8个分离设备的装置来说,存在8个上游腔室,每个上游腔室位于每个分离设备的上游。类似地,所述收集腔室可以经由它们的排出端口连接到一个下游腔室,类似于图7所示的设备,或者每个收集腔室连接到其自身的下游腔室。
G.与其他分离设备或分析设备接合
所述设备可以连接到并行设备,以提高生产能力并允许同时分离和收集。所述并行设备可以包括在本发明的装置的分离设备上分离之前或之后实现的分子分离步骤,或者分析步骤,诸如质谱分析、气相色谱分析、HPLC,或者本领域技术人员已知的多种其他分析步骤。本发明的装置可以制作地结构紧凑,这使得其更容易连接到并行设备,当然较大型的本发明的装置也可以连接到其他设备。
所述复用设备还有能力与用于多维分离平台的其他分离设备整合,其中来自第一维分离的每种“分馏物”装载到复用系统的其中一个分离通道中。第一维分离示例包括但不限于,溶液等电子聚焦、反相HPLC和离子交换色层分离。
在一种实施方式中,包括8个聚丙烯酰胺分离凝胶的复用设备可以整合到溶液等电子聚焦设备中。两个设备组合可以提供类似二维蛋白质凝胶电泳法的基于溶液的分离技术。在使用短小聚丙烯酰胺凝胶时,诸如小于2cm的凝胶,上述组合可以提供类似于可以在3小时的总运行时间内完成的2D凝胶的基于溶液的分离技术。
Ⅱ.方法
使用所述装置来分离并收集生物分子的方法包括以下步骤:(1)提供样本或多个样本;(2)利用分离设备分离所述样本;和(3)经由收集腔收集来自分离设备的生物分子分馏物。
A.样本
样本包括生物分子。包括生物分子的任何样本都可以利用本发明的装置进行分离。例如,所述样本可以表现为粗细胞提取物形式、部分提纯的提取物形式或样本与细胞分馏物形式,诸如但不限于,膜分馏物、核分馏物、线粒体分馏物和细胞质分馏物。样本也可以包括来自任何生命形式的体液,或者组织或器官提取物。部分提纯分馏物也可以利用所述装置分离。在一种实施方式中,样本包括待分离蛋白质,而在另一种实施方式中,样本包括核酸。样本还可以包括合成分子,诸如合成肽、蛋白质、核酸等。
样本可以针对分离步骤进行制备。制备取决于分离设备和分离设备中的材料。例如,如果分离设备包括SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法,则样本通常在包含SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲剂中煮沸而变性,并添加随着缓冲剂前锋迁移的染料。如果分离设备中的材料包括琼脂,例如,所述样本制备成包括缓冲剂,凝胶在所述缓冲剂中运行。
B.分离
分离步骤包括将样本或多个样本装载到分离设备中,并运行所述分离设备,以允许样本中的生物分子分离。
样本可以通过对特定分离所采用的标准方式装载到分离设备上。例如,对于聚丙烯酰胺凝胶电泳法来说,液体样本施加到凝胶上的容积中。在一种实施方式中,使用收集腔的排出端口不带阀的装置,所述设备抬高到与水平方向的夹角大于10度的角度,以允许样本借助重力流向分离介质的顶部。驱动力,诸如用于聚丙烯酰胺介质的电压或用于离子交换或凝胶过滤介质的压力启动,直到样本迁移到分离设备的介质中为止,此时,所述设备抬高的角度可以落下,也可以不落下。
接下来利用驱动力进行分离,移动样本中的生物分子通过分离介质。如果收集腔的存取端口不具有阀,则将所述设备保持在水平位置或倾斜位置,以便材料不会从收集腔通过存取端口泄漏出来。如果收集腔的存取端口具有防止泄漏的阀,则所述设备可以在垂直位置、水平位置或倾斜位置运行。
C.收集
借助收集腔收集被分离的分馏物以取决于分离设备的方式实施。但是,对于所有设备来说,通过调节收集设备处于收集腔的进入端口中的深度来调节收集腔的容积。可以在样本装载到收集腔之前或者此后的任何时间实施这项工作。
在分离过程中,借助收集腔上的存取端口实施分馏物收集。可以在驱动力操作的同时进行分馏物收集,或者可以在收集每一种分馏物的时候切断驱动力。如果在收集每种分馏物的时候切断驱动力,则分离步骤以停止和运行的循环进行操作,在每个收集阶段过程中存在分离暂停,随后在完成每个收集步骤之后,重新启动分离步骤。
分馏物可以在相等的时间间隔之后收集,或者收集每一种分馏物之间的时间可以变化。本发明的装置允许使用者控制收集每种分馏物的时间,这相对于其他设备而言具有优势。在一种实施方式中,在收集过程之间设置较短的时间间隔,以便于更快速地洗脱溶质,设置较长的时间间隔以便更长时间地洗脱溶质。控制收集时间导致对于较长时间地洗脱介质来说稀释程度较轻。因为收集腔保持恒定容积而非恒定流量,所以溶质也会浓缩而不是稀释。因此,随着分离步骤的进行,连续收集过程之间的时间逐渐加长,以适应移动缓慢的种类。例如,在使用根据尺寸来分离蛋白质介质时,蛋白质越大,则需要越长的时间将该特定蛋白质带从分离介质中洗脱。为了保持相同分馏物中该特定蛋白质的总量,则需要通过加长收集时间来适应这种情况。由于排出端口处存在俘获器(例如,分子量截止膜),所以样本中的分子保持被俘获在腔室中,直到它们被收集或除去的时刻为止。
收集腔不仅用作收集样本的腔室,还用作预浓缩腔室,在该腔室中,溶质的绝对量随着时间增加。这是因为收集腔保持在恒定容积而非恒定流量。因此,在样本装载量处于亚微克水平时,容积可调的收集腔也可以允许回收率更高。例如,如果装载量处于亚微克水平,则可以通过增大分离设备进入收集腔进入端口的深度而将收集腔的容积调节到较小容积。容积较小的收集腔允许从亚微克样本中更多地回收少量被分离的分子,因为分子在收集腔中浓缩。
上述分子俘获器可以在分离步骤之前或过程中放置于收集腔中。这样允许使用者收集保持固相,即吸收到俘获设备上的被分离分馏物。在使用收集腔中的俘获设备时,也可以随着分子俘获而同时收集液体分馏物。在该实施方式中,在每一个时间点,收集两种分馏物:一种包括分子俘获器,包括处于分子俘获器中的分子;另一种处于溶液中,包括没有被分子俘获器截留的分子。在另一种实施方式中,可以针对分离步骤中收集的一些但不是全部分馏物放置并收集分子俘获器。可以在分离步骤中,经由存取端口以新鲜的俘获设备依次替换所述俘获设备。
在一些是实施方式中,需要在收集每个样本之后,替换收集腔中的缓冲剂。例如,如果分离设备是聚丙烯酰胺凝胶电泳设备,则需要在收集每种液体分馏物之后向收集腔添加缓冲剂。
收集分馏物可以手工实施,或者可以借助分馏物收集器或者本领域技术人员已知的其他设备自动进行收集。
对于复用系统来说,所述使用方法类似于带有单一分离设备和收集设备的系统。
在一种实施方式中,分离介质是聚丙烯酰胺、琼脂或类型相似的凝胶。这种实施方式,称为GeIFrEE(凝胶分馏物俘获电泳法),表示根据质量分离样本,诸如蛋白质、核酸或其他生物分子。本发明的这种复用设备可以在单次运行中容纳多个样本。电压应用条件相同,其他条件也是一样,诸如温度和溶剂缓冲剂组分。相同的样本可以运行多次,以重复数据,或者独立的样本也可以同时运行。在一种实施方式中,复用设备用于实施多维分离。
对于单样本分离和复用分离而言,从第一次分离收集的分馏物可以利用形式独立的分离步骤进行额外的分馏。例如,对于蛋白质分析而言,最常用的多维分离形式是2D凝胶电泳技术,这种技术组合使用等电子聚焦(维度1)和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(维度2)。虽然这种技术有其优点,但是2D凝胶电泳存在若干已知的问题,使得研究者希望更好的替代方案。
在一个方面,IEF方案与SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳相结合。在一种实施方式中,产生8种样本分馏物且容积为每样本300μL级别的IEF设备,与利用本发明的装置进行的聚丙烯酰胺凝胶电泳以及样本收集(GeIFrEE)耦接。本发明包括与8个收集腔耦接的8个分离设备的复用设备与上述IEF产生的8个样本工作良好。通过这种方式,IEF与利用本发明的设备进行的分离与收集耦接的方案,2D凝胶实现的蛋白质分离可以利用本发明的复用装置在溶液相实现。
Ⅲ.按照附图的实施方式
在附图中例示以及在说明书中描述的特定设备和过程仅仅是附带的权利要求书所限定的本发明构思的示例实施方式。因此,与文中公开的实施方式相关的具体尺寸和其他物理特征不应该认为是限制,除非权利要求中明确表明。
图1示出了本发明设备一种实施方式的截面图。图2示出了该实施方式的俯视图。附图标记10一般指代图1所示设备实施方式。收集腔20设置在分离设备30下游。收集腔包括进入端口22、排出端口24和存取端口26。收集腔还包括分子量截止膜28。分离设备30经由进入端口22与收集腔20接合。在该实施方式中,进入端口22包括位于收集腔20上游端的孔或柱体。排出端口24将收集腔与下游腔室50连接。在排出端口24处,存在分子量截止膜28。收集腔还包括存取端口26,所述存取端口包括孔或阀,可以通过所述孔或阀存取收集腔内容物。
图3、4和5示出了收集腔视图。图3示出了包含收集腔的块体的三维视图,示出了排出端口24和存取端口26。图4是收集腔的侧视截面图,示出了进入端口22、排出端口24和存取端口26。图5是收集腔块体的正视截面图,示出了存取端口26和位于进入端口和排出端口之间的收集腔内部23。
图1中的分离设备30包括分离介质34,所述分离介质包括积层介质或凝胶33和分离凝胶或介质35。分离介质34可以是聚丙烯酰胺凝胶、琼脂或其他分离介质。分离设备30包括柱状管38和包含在该管内的分离介质34。柱状管38可以由玻璃、硅化玻璃或透明塑料制成。
图1和2中的设备10还包括上游腔室40和下游腔室50。分离设备30的柱状管38的上游端32经由其排出端口42连接到上游腔室40。类似地,分离设备30的柱状管38的下游端36经由其进入端口52连接到下游腔室50。上游腔室40和下游腔室50还包括电极44、54和端口46、56。腔室40和50通常包含适合用于分离介质的缓冲剂。
设备10还包括各上游密封装置和下游密封装置60和70。上游密封装置60包括垫片62,所述垫片通常由橡胶制成;和位于垫片62任一侧的板件64和66。下游密封装置70还包括通常以橡胶制成的垫片72,和位于垫片72上游端的板件74。所述设备可以借助夹板或螺母例如78和螺栓67、77密封以防泄漏,如图2所示。
图6示出了设备10一种实施方式的照片。
在操作中,设备10组装起来,并且密封设备30位于进入端口22内或收集腔20内的深度调节成设定收集腔的容积。为了在凝胶柱体周围形成密封件,还使用了橡胶垫片。样本置于分离设备30的柱状管38的上游端32内,并允许其流向积层介质或凝胶33的上游端。实现这种目的的一种方法是倾斜装置10,与水平方向形成大约30°的夹角,并允许样本借助重力向积层介质33的上游端迁移。在上游电极44和下游电极54之间施加电势,允许样本迁移到积层介质33中。接下来可以任选将所述装置下落到水平位置或者保持与水平方向成30°夹角。如下述这样收集样本:首先,暂停在电极44和54之间施加电势。第二,利用吸移管经由存取端口26存取所述收集腔,将收集腔20的全部容积转移到洁净玻璃瓶中。第三,经由存取端口26将一部分新鲜缓冲剂装载到收集腔中。第四,重新在电极44和54之间施加电势,以继续分离过程。在分离过程中重复步骤1-4,在步骤1-4的每个循环过程中收集分馏物。步骤1-4的每个循环之间的时间可以在分离过程中调节。可以在步骤2和3之间进行调节分离设备30处于进入端口22内的深度的额外步骤。
复用设备的实施方式在图7中示出,图7是该设备的俯视图。注意,图7是放大视图,目的是便于观察复用设备的部件。在操作中,例如收集腔120和下游腔室150之间的空间关闭。附图标记110一般指代图7所示设备实施方式。类似于图1和2所示的设备,包括收集腔120的块体设置在分离设备130下游。每个收集腔包括进入端口122、排出端口124和存取端口126。每个收集腔还包括分子量截止膜128。分离设备130经由进入端口122与收集腔120接合。排出端口124将收集腔与下游腔室150连接。在排出端口124处,存在分子量截止膜128,所述膜在复用设备的该实施方式中是覆盖全部排出端口124的膜。在其他实施方式中,每个排出端口具有单独的分子量截止膜。在另一些实施方式中,每个收集腔的每个排出端口可以具有尺寸不同的分子量截止膜。收集腔还包括存取端口126,所述存取端口126包括孔或阀,可以通过所述孔或阀存取收集腔内容物。在图7所示实施方式中,收集腔以一块材料制备。在其他实施方式中,收集腔可以分别单独制备,并与分离设备130排列起来。
图7中的分离设备130包括两个或更多个分离设备。在所示实施方式中,每个分离设备包括柱状管138,所述柱状管包含分离介质134。分离介质134可以是聚丙烯酰胺凝胶、琼脂或其他分离介质。柱状管138可以用玻璃、硅化玻璃或透明塑料或者其他透明刚性材料制成。图7示出了分离设备彼此相通。在其他实施方式中,柱状管可以具有不同直径和/或包含不同的分离介质。图7还示出了连接到6个收集腔的6个分离设备。分离设备和收集腔的数目可以低至两个,或者高至200个,或者取决于实际需要。在另一种实施方式中,分离设备和收集设备的数目为8个,以适应多通道吸移管。
图7中的设备110还包括上游腔室140和下游腔室150。分离设备130的柱状管138的上游端经由其排出端口142与上游腔室140连接。类似地,分离设备130的柱状管138的下游端经由其进入端口152连接到下游腔室150。上游腔室140和下游腔室150还包括电极144和154。腔室140和150通常包含适合分离介质的缓冲剂。图7所示实施方式具有一个上游腔室和一个下游腔室,全部分离设备连接到它们。在其他实施方式中,每个分离设备连接到单独的上游腔室和下游腔室。就是说,如果存在8个分离设备,则存在8个上游腔室和8个下游腔室。
设备110还分别包括上游和下游密封装置160和170。上游密封装置160包括通常以橡胶制成的垫片162和位于上游腔室140上游的板件164和位于垫片162下游的板件166。下游密封装置170还包括通常以橡胶制成的垫片172;和位于垫片172上游端的板件172;和位于下游腔室150下游的第二板件176。垫片162和172在本实施方式中为一片橡胶。在其他实施方式中,垫片可以包括橡胶环,每个分离设备有两个橡胶环(上游和下游)。所述设备借助螺母168和178以及螺栓167和177密封以防泄漏。所述设备还可以利用夹板密封。
图8、9和10示出了收集腔的视图。图8示出了包含收集腔的块体的三维示出,示出了排出端口124和存取端口126。图9是收集腔的侧视截面图,示出了进入端口122、排出端口124和存取端口126。图10是收集腔块体的正视截面图,示出了存取端口126和位于进入端口和排出端口之间的通道123。
复用设备的操作类似于单用设备。装置110组装起来,并且调节分离设备130处于收集腔120的进入端口120内的深度,以设定收集腔的容积。每个分离设备130处于进入端口122内的深度对于每个分离设备和进入端口相同,因此为每个收集腔120设定相同的容积。作为可选方案,每个分离设备130处于其各自进入端口122内的深度相对于每个分离设备和进入端口可以不同,因此为一个或多个收集腔120设定不同的容积。样本置于分离设备130的柱状管138的上游端132内,并允许其流向分离介质134的上游端。实现这一目的的一种方式是倾斜装置110,与水平方向成30°的夹角,并允许样本借助重力向积层介质134的上游端迁移。在上游电极144和下游电极154之间施加电势,允许样本向分离介质134迁移。接下来可以任选将所述装置放下到水平位置,或者保持与水平方向成30°的夹角。如下所述收集样本:首先,暂停在电极144和154之间施加电势。第二,利用吸移管或多通道吸移管经由存取端口126存取所述收集腔,将收集腔120的全部容积转移到洁净玻璃瓶或多井板中。第三,经由存取端口126将一部分新鲜缓冲剂装载到收集腔中。第四,重新在电极144和154之间施加电势,以继续分离过程。在分离过程中重复步骤1-4,在步骤1-4的每个循环过程中收集分馏物。步骤1-4的每个循环之间的时间可以在分离过程中调节。可以在步骤2和3之间进行调节分离设备130处于进入端口122内的深度的额外(任选)步骤。
在操作过程中,所述设备包含在箱体内,所述箱体用来保护使用者免受高压应用损害。
Ⅳ.示例
文中所述的示例、实验和结果仅用于例述本发明,并不能以任何方式理解为限制本发明的范围。
示例1:材料
Milli-Q级的水提纯到18.2mω/cm。所有用于凝胶电泳的反应剂利用Bio-Rad(Mississauga,Ontario)获得。3.3kDa分子量截止渗透膜从FisherCanada(Mississauga,Ontario)采购。所有的蛋白质,包括胰岛素(TPCK treated,cat.T8802)、冻干的枯草芽孢杆菌和其他化学品从Sigma(Oakville,Ontario)采购。
示例2:样本制备
枯草芽孢杆菌冻干细胞悬浮在纯水中并在French压力机中在8000psi下进行细胞溶解。溶解的细菌以13000xg进行离心,并收集上层浮液。样本存放在-20℃,直到准备使用。标准蛋白质根据重量制备成接近浓度。为了保持一致,200μL的样本装载到设备中,组合180μL的样本与20μL的5x装载凝胶的缓冲剂(0.25M Tris-HCl pH 6.8,10%w/v SDS,50%丙三醇,0.5%w/v溴酚蓝)。在装载到柱体之前,样本加热到95℃,持续5分钟。
示例3:分离和收集设备
除了所述柱体,这些示例中的GeIFrEE设备以Teflon构造,并且如图6所示。所述设备包括4个主要部件:阴极腔室、凝胶柱体、收集腔和阳极电解腔。
本例中所用分离设备是聚丙烯酰胺凝胶柱体,该凝胶柱体浇铸在0.8cm(外径)x6.0cm的玻璃管中。除了另外指出,凝胶柱体由1.0cm高、浇铸成15%T、2.67%C的溶解凝胶以及1.5cm高、含4%T、2.67%C的积层凝胶构成。凝胶利用浇铸分析用板条凝胶的标准程序制备(Lamelli,1970)。样本装载到玻璃管的空白容积中,位于积层凝胶上方。
制备工作完成后,在收集腔中俘获并回收样本。收集腔由圆形腔构成,其直径匹配包含凝胶柱的玻璃管的外径。3.5kDa分子量截止渗透膜夹置在收集腔和阳极电解腔之间,并且随着所述腔室夹紧在一起而借助压力密封(参见图6A)。存取端口钻设在所述腔室的顶部,允许在不拆解所述设备的情况下,取出分馏物。可以通过控制插入收集腔的凝胶柱体深度来调节收集腔的容积。
示例4:操作条件
所述设备的操作分3个不同阶段进行描述:(1)样本装载;(2)分离;和(3)收集。对于样本装载来说,所述设备的电解腔以及凝胶柱体上方的空白容积完全以运行的缓冲剂填充(0.192M丙三醇,0.025M Tris,0.1%SDS)(Laemmli,1970)。100μL的运行缓冲剂也引入收集腔中。为了便于装载样本,所述设备的阴极(装载)端抬高到30°角,以便样本借助重力流向积层凝胶头部。在所述系统上恒定施加240V电压的情况下进行分离。在样本完全迁移到凝胶(~10分钟)之后,将所述设备放平,用于剩余的分离步骤。在染料前锋可见地进入收集腔的时候,开始收集过程。在收集过程中,暂停电力供应,并利用吸移管将收集腔的全部容积转移到干净玻璃瓶中。将100μL新鲜运行缓冲剂装载到收集腔中,并且接通电源,以继续分离步骤。在分离程序中重复这一过程,在每个停止并运行的循环中收集分馏物。
图6B示出了在240V时,在该设备中,在0.6cm直径的丙烯酰胺凝胶上分离预先染色的MW蛋白质的梯度。照片是在进入分离过程之后大约15分钟时拍摄的,并且在向系统第一次施加电压时进行测量。相对于较低电压(120V)分离(结果未示出)而言,较高的电压应用(高至240V)用于更快速地分离,而且不会损害带条的分辨力。而且,6mm直径的管状凝胶,与长度至少为样本塞头两倍的积层凝胶耦接,允许装载至多200μL并与所述设备有效叠置,相对于体积较小的样本装载量而言,没有明显的分辨力损失。从图6中,可以看到蛋白质清楚地分离,类似于在传统分析板条凝胶中观察到的情形。从图6B可以看到,最小的蛋白质(7kDa)在通过大约1cm的溶解凝胶迁移之后,从染料前锋完全溶解出来。
示例5:溶解凝胶柱体
GeIFrEE(凝胶分馏物俘获电泳)分馏物利用带有15%T溶解板条凝胶的不连续SDS PAGE进行分析。为此,20μL的GeIFrEE分离的分馏物与5μL的5x凝胶装载的缓冲剂混合,并且20μL的这种混合物连同适当的标准样品装载到凝胶的各通道上。凝胶进行银染色(Shevchenko,et al.1996)或考马斯(coomassie)染色,并在平台式扫描仪上扫描。
图11A示出了从利用浇铸成15%T的1cm长的(溶解)凝胶柱体200μg枯草芽孢杆菌中的蛋白质组提取物分离过程中收集的分馏物。溶解凝胶的成分(即,%T)是考虑给定质量范围内的分离分辨力时的重要参数。一般来说,浇铸成较低%T的凝胶对于高质量种类提供优化的分辨力,而较高%T有利于较低质量范围。虽然可以在狭窄的范围上进行优化,但是在本例中,利用GeIFrEE设备实现了较宽质量范围的蛋白质组分离。为了分馏质量下限延伸到10kDa以下的蛋白质,需要最小15%T的凝胶。低于该值,蛋白质连同缓冲剂前锋一起洗脱,因此无法分离。利用15%T的凝胶,即使对于分子量差异小至2kDa的情况,也可以进行部分分离。
从图11A可以看出,从初始施加电压起90分钟时收集的最后蛋白质分馏物包含近似分子量介于150kDa到200kDa(从Rf值测量)的蛋白质。分子量大于100kDa的蛋白质容易在1小时的运行过程中收集。快速分离是在短小凝胶柱体上采用大电场强度时进行的运行过程的结果。因此,图11表明了在单独一组操作条件下,在较宽质量范围内对基本上全部蛋白质进行的迅速分离。
在制备电泳法中使用极短的溶解凝胶看起来不同寻常。但是,由于蛋白质的分散性质,这种性质有助于带条在凝胶电泳中加宽,所以较长的凝胶可能不能必然提供较高的总体分辨力,特别是在样本的全部质量范围内(Yarmola and Charmbach,1998)。而且,假设电场恒定,则较长的凝胶需要成正比的较长的分离时间。图11B示出了在3cm凝胶上实施的同等分离分布图。较长凝胶的分离时间延长到3小时,注意上部质量范围也达到了1cm凝胶分离的上部质量范围。此外,为了从收集腔回收样本的原因,在3cm凝胶上运行产生大约3倍于分离过程分馏物的分馏物。如图11所暗示,这种较长凝胶的分辨力增益并没有显著不同,特别是在超过30kDa的质量范围内。此外,因为在收集大质量蛋白质的过程中增加了样本稀释,所以复合了工作负载增加,因为它们开始穿过多个分馏物洗脱。
1cm凝胶柱体实际上在全部蛋白质组范围内提供了令人印象非常深刻的分辨列,同时因总分离时间最小而保持了生产能力最大。图11中分离过程类似地表示在连续洗脱凝胶电泳设备中溶解的最大质量范围,特别是在这种有利的分解时间下。
示例6:俘获,收集腔的独特特征
通过逐渐增大后续分馏物收集过程之间的分离时间间隔,实现了明显线性化的分离过程,如SDS PAGE所显示,(这实际上表示一种对数分子量分离)。时间是从图11中表示的总表示分离时间中推算出来的。因此,GeIFrEE分馏法容易克服连续洗脱电泳设备中所遭遇的样本稀释问题。换句话说,由于连续洗脱系统采用恒流液体流从俘获腔提取样本,所以分子量较大的种类无可避免地收集在较大的容积中,因此被稀释。这种情况来源于分子量较大的种类移动性下降,这样将增大蛋白质带条的洗脱窗口,所述窗口因分离过程中的分散和其他处理而具有有限的宽度。利用GeIFrEE装置,即便洗脱时间加长,也能在洗脱和样本收集过程中保持恒定容积。收集时间间隔仅增加到匹配分子量较大的蛋白质加大的洗脱窗口。在所述实验中,200μL的样本装载量导致样本浓度可能增大两倍,因为蛋白质分馏物以100μL的间隔收集。因此,由于避免了样本过度稀释,所以所述设备可以在非常大的质量范围进行收集,这对于低至亚微克的装载量来说,特别有好处。从所述设备进行样本回收的过程将在以下段落中详细描述。
示例7:从收集腔进行回收
GeIFrEE收集腔的一项重要特征就是3.5kDa分子量截止膜的俘获效率。再生醋酸纤维素具有3.5的等电离点(Pontie,1998)。在pH为8的操作缓冲剂中,所述膜将被负充电(Pincet,1995),因此应该排斥结合SDS的蛋白质,防止结合到所述膜。实际上,在2.5μg/μL的BSA溶液装载到收集腔中(经过所述柱体)的时候,在实验误差范围内,在240V的情况下,进行30分钟的俘获之后,观察到可量化的回收率。蛋白质损失的风险预期随着蛋白质浓度下降而升高,因此类似的实验利用50ηg/μL BSA(100μL总装载量)来实施。用于分析样本的考马斯染色凝胶分布图给出在俘获间隔从5到15分钟的范围内,观察到了较高的回收率,表示俘获膜并没有显著影响该设备的样本损失。在30分钟的俘获时间处,凝胶中的带条强度与一些样本损失一致。因此,对于给定的分馏物来说,俘获时间间隔在整个实验中保持低于15分钟,以便防止在在收集腔内进行的更长时间的俘获过程中样本损失到所述膜。
示例8:GeIFrEE设备的装载容量
已经描述了在连续洗脱制备电泳法中从聚丙烯酰胺凝胶回收的蛋白质取决于样本装载量,随着所述设备上的装载量从每平方厘米凝胶3mg下降到100μg,而产率从90%下降到60%的(Chrambach and Rodbard,1971)。在一定的样本装载量范围上探索了GeIFrEE设备的样本回收率(0.3cm2凝胶柱体),从亚毫克到微克量。收集腔俘获并浓缩样本的效率提供了从所述设备较高的样本回收率。利用细胞色素C作为单一目标蛋白质,装载0.5μg(在200μL中)并从GeIFrEE实验进行回收,随后在银染色分析板条凝胶上显示。结果在图12A中示出,并表示对从GeIFrEE分离中总收集分馏物的1/5进行分析。在该凝胶中最大装载10ηg细胞色素C接近银染色的检测极限,而在GeIFrEE分离中,容易在单一分馏物中观察到蛋白质,这表示分离窗口为2分钟。在更大的样本装载量(高至200μg细胞色素C),在不存在明显分辨力损失的情况下,观察到较高的回收率(图12B)。但是,在1mg装载量时,分辨力开始削弱,正如考马斯染色凝胶中所显示的那样(图12C)。由于有效的叠加和样本收集,对于蛋白质组混合物来说,0.6cm的i.d.的凝胶柱体可以适应高至2.5mg的样本装载量。图13A、B和C分别示出了在蛋白质总装载量为1mg、0.5mg和0.1mg时,对于5个蛋白质标准混合物来说,分辨力保持不变。此外,与蛋白质标准通道进行带条强度比较,暗示出在该质量范围以及在所述样本装载量的情况下,全部蛋白质的回收率较高。要注意,图13中的标准通道考虑了来自样本装载量与收集之间容积减小而产生的两倍样本富集因素。通过以较高分辨力回收蛋白质(即,在单一分馏物中),并通过避免蛋白质从凝胶柱体洗脱之后不必要的稀释,使得样本损失最小化。因此,这样的结果表明GeIFrEE样本分馏以及收集如何在一定范围的样本装载量上提供极高的蛋白质回收率。
示例9:再现性
GeIFrEE过程的再现性高度取决于运行缓冲剂以及浇铸凝胶柱体的一致性。凝胶的成分(%T、%C、聚合过程),以及柱体长度,必须保持,以提供恒定的洗脱时间。图13A和B显示了利用相同的条件以及相同的收集时间通过GeIFrEE分离的5种蛋白质混合物的凝胶曲线。图像揭示出被收集蛋白质的体积在相同的被收集分馏物中大致相同,或者换句话说,这些蛋白质在相同的时间周期内从凝胶柱体洗脱。图13C表示同等的5种蛋白质混合物分离,除了分馏物收集时间较之前述图像向后偏移一分钟。预期观察到蛋白质的分馏数量更低。这表明收集时间的较小变化(通常90分钟的运行中的1分钟)对于样本洗脱分布图的强烈影响。虽然如此,在受控的一组操作条件下,GeIFrEE设备提供了再现性高的分离过程。较高的再现性最终允许使用者直接根据给定一组条件下的运行时间来预测洗脱蛋白质的分子量范围。对于有目的的收集分子量已知的蛋白质来说,这特别有用。这种特点还给出而来固有的分子量信息,以协助识别蛋白质。
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其他实施方式
应该理解,虽然已经针对本发明的详细描述说明的本发明,但是前述描述的目的是例述而非限制本发明的范围,本发明的范围有附带的权利要求书的范围限定。其他方面、优势和改动都落入以下权利要求书的范围内。
文中引用的全部参考文献全文包含在本文中。
Claims (40)
1.一种装置,包括:
a)分离设备;和
b)收集腔,所述收集腔包括:
i)适配成接收所述分离设备端部的进入端口;
ii)包括俘获介质的排出端口;和
ii)位于所述进入端口和排出端口之间的存取端口,其中,通过调节所述分离设备相对于所述存取端口处于所述进入端口中的深度来调节所述收集腔的容积。
2.如权利要求1所述的装置,其特征在于,所述分离设备包括电泳分离设备。
3.如权利要求2所述的装置,其特征在于,所述分离设备包括分离路径长度为10cm以下的分离设备。
4.如权利要求2或3所述的装置,其特征在于,所述分离设备包括含有二聚丙烯酰胺或琼脂的分离介质。
5.如权利要求1至4任一项所述的装置,其特征在于,所述分离设备包括聚丙烯酰胺凝胶,所述凝胶包括高度为6.0cm以下且直径大约为0.2-1.0cm的溶解凝胶。
6.如权利要求1至4任一项所述的装置,其特征在于,所述收集腔包含可拆卸的俘获器。
7.如权利要求6所述的装置,其特征在于,所述收集腔包括两个以上的可拆卸的俘获器。
8.如权利要求6或7所述的装置,其特征在于,所述俘获器包括疏水俘获器、亲水俘获器、离子交换俘获器、分子量截止俘获器、亲和性俘获器或者它们的组合。
9.如权利要求6至8任一项所述的装置,其特征在于,所述俘获器头对头布置。
10.如权利要求1所述的装置,其特征在于,所述收集腔内的所述存取端口进一步包括阀。
11.如权利要求1所述的装置,其特征在于,所述俘获介质包括分子量截止值大约为1kDa到大约10kDa的膜。
12.如权利要求1所述的装置,其特征在于,所述装置以基本上化学惰性的、非导电的材料构成。
13.如权利要求1至12任一项所述的装置,其特征在于,所述装置包括两个或更多个收集腔。
14.如权利要求13所述的装置,其特征在于,所述收集腔用单独一块材料构造。
15.如权利要求13所述的装置,其特征在于,所述存取端口之间的间隔设计成容纳标准多通道吸移管管理器。
16.如权利要求13至15任一项所述的装置,其特征在于,所述存取端口设计成容纳标准吸移管末端。
17.如权利要求11所述的装置,其特征在于,所述收集腔设置在彼此的下游,与所述分离设备成一列。
18.如权利要求13所述的装置,进一步包括两个以上的分离设备。
19.如权利要求11所述的装置,其特征在于,所述分离设备的数目等于所述收集腔的数目,并且每个收集腔紧接在分离设备的下游设置。
20.如权利要求18或19所述的装置,其特征在于,所述分离设备和所述收集设备并排排列。
21.如权利要求20所述的装置,其特征在于,包括并排排列的分离设备和收集腔的所述装置成平面状结构。
22.如权利要求20所述的装置,其特征在于,包括并排排列的分离设备和收集腔的所述装置配置成弧形、半圆或半椭圆形。
23.如权利要求20所述的装置,其特征在于,包括并排排列的分离设备和收集腔的所述装置配置成管状结构。
24.如权利要求23所述的装置,其特征在于,所述管形结构是柱状或椭圆状。
25.如权利要求13至16或18至24任一项所述的装置,其特征在于,所述装置进一步包括设置在所述分离设备上游的上部腔室和设置在所述收集腔下游的下部腔室。
26.如权利要求13至16或18至25任一项所述的装置,其特征在于,所述装置包括8个分离设备和8个收集腔。
27.一种利用上述权利要求任一项所述的装置从一个或多个样本中提纯多种分子或分子分馏物的方法,所述方法包括步骤:
a)提供一个或多个样本;
b)利用所述分离设备分离分子;和
c)经由所述收集腔中的所述存取端口依次收集多种分馏物。
28.如权利要求27所述的方法,进一步包括步骤:向所述分离设备施加样本,其中所述设备的装载端抬高到与水平方向的夹角大于10度。
29.如权利要求28所述的方法,进一步包括步骤:允许所述样本向所述分离设备中迁移,然后放下所述设备,使其与水平方向的夹角小于10度。
30.如权利要求27所述的方法,其特征在于,所述分离步骤在停止并运行的循环中实施,在每个收集步骤中暂时停止分离步骤,随后在完成每次收集步骤之后,重新启动分离步骤。
31.如权利要求27所述的方法,其特征在于,在所述装置处于水平位置的同时,实施所述分离步骤和收集步骤。
32.如权利要求27所述的方法,进一步包括步骤:通过调节所述分离设备处于所述收集腔的所述进入端口中的深度来调节所述收集腔的容积。
33.如权利要求27至32任一项所述的方法,其特征在于,被收集的分馏物中的分子较之它们在样本中的浓度,具有相同或更大的浓度。
34.如权利要求27所述的方法,其特征在于,所述分馏物包括可拆卸的俘获器。
35.如权利要求34所述的方法,其特征在于,所述分馏物包括所述收集腔内的可拆卸的俘获器和溶液。
36.如权利要求27所述的方法,其特征在于,所述样本包括粗细胞提取物、局部提纯的提取物、或者先前通过等电子聚焦或其他方法分离的样本。
37.如权利要求27所述的方法,其特征在于,所述装置是权利要求3至9任一项所述的装置,并且利用大约240伏特的电压对分子进行分离。
38.如权利要求37所述的方法,其特征在于,所述分离和收集步骤在大约100分钟内实施。
39.如权利要求38所述的方法,其特征在于,被分离的分子是蛋白质,介于大约5kDa到大约200kDa之间,并且分子量偏差大约5kDa的分子被有效地分离。
40.如权利要求27所述的方法,进一步包括步骤:在每次收集步骤之后,向所述收集腔添加缓冲剂。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20101124 |