JP7373923B2 - 生体物質回収方法 - Google Patents
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Description
本発明は、生体物質回収方法および生体物質回収装置に関する。
生体物質回収方法および生体物質回収装置を用いて、電気泳動により、幾つかの生体物質のうちから目的物質のみを高純度、高濃度の回収液として簡便に回収することが可能である。
ゲル電気泳動方法は、電荷を持った物質に電場を印加すると、物質が逆極性の電極方向へ移動する現象を利用して、核酸やたんぱく質などの生体物質を分析する手法である。一般に、生体物質の支持体として、アガロースゲルやアクリルアミドゲルなどの電気泳動ゲルが用いられる。生体物質の分子量によって電気泳動ゲル中の移動速度が異なるため、分子量毎に異なるバンドとして生体物質が分離される。ゲル電気泳動方法は、生体物質の分離に関し高い分解能を持つため、目的とする分子量の生体物質を他の分子量の生体物質から分離し、回収するためにも採用される。
目的とする分子量の生体物質の回収方法として、電気泳動により分離した目的のバンドに対し、周囲の電気泳動ゲルごと切除し、切除された電気泳動ゲルから生体物質を回収する方法が一般に採用される。しかし、切除された電気泳動ゲルから生体物質を回収する際に、生体物質の濃度が変化したり、切除のための工程が余計に必要になったりするという課題があった。
電気泳動ゲルを切除する必要がなく、電気泳動と同時に目的とする生体物質を回収する方法として、例えば特許文献１及び２には、予め電気泳動ゲルに生体物質の回収孔を設けることが開示されている。生体物質に回収孔を空ける方法は、目的生体物質よりも早く泳動する不要物が回収孔を通り抜けて泳動を続けることから、コンタミの可能性がなくなるという利点があるが、同様の理由から目的生体物質も回収孔を通り抜けやすく、目的生体物質の高回収率化がみこめないという問題があった。
なお、同様に、電気泳動と同時に目的とする生体物質を回収する方法として、例えば特許文献３には、電気泳動の流路が二股に分かれていて、電極のスイッチングによって目的生体物質のみを回収用チャンバに移動させる方法が開示されている。
しかしながら、従来の構成では、目的生体物質の回収率を向上させるのが困難であるという課題があった。
たとえば特許文献１及び２の構成は、ゲルの途中に孔が空いた構成のため、回収孔に到達した生体物質は回収孔以降にも電気泳動を続けるため、高効率に目的生体物質を回収することは困難である。
なお、特許文献３の構成では、電気的および物理的に分離された２個の回収用チャンバが必要で、その分必要な面積および体積が大きくなるという課題がある。
そこで、本発明は、簡素な構成で目的生体物質の回収率を向上させることができる、生体物質回収方法および生体物質回収装置を提供することを目的とする。
上記課題を解決するために、本発明の生体物質回収方法の一例は、
分離媒体および回収孔を有する電気泳動装置を用いた生体物質回収方法において、
目的生体物質を前記回収孔に向かって移動させる電圧の印加を開始する、電圧印加開始工程と、
前記電圧印加開始工程の後、前記目的生体物質が前記回収孔に到達する前に、前記回収孔内の緩衝液を除去する、緩衝液除去工程と、
前記緩衝液除去工程の後に、前記回収孔に溶媒を注入する、溶媒注入工程と、
前記溶媒注入工程の後に、前記回収孔に到達した前記目的生体物質を回収する、回収工程と、
を有する。
分離媒体および回収孔を有する電気泳動装置を用いた生体物質回収方法において、
目的生体物質を前記回収孔に向かって移動させる電圧の印加を開始する、電圧印加開始工程と、
前記電圧印加開始工程の後、前記目的生体物質が前記回収孔に到達する前に、前記回収孔内の緩衝液を除去する、緩衝液除去工程と、
前記緩衝液除去工程の後に、前記回収孔に溶媒を注入する、溶媒注入工程と、
前記溶媒注入工程の後に、前記回収孔に到達した前記目的生体物質を回収する、回収工程と、
を有する。
また、本発明の生体物質回収装置の一例は、
電場を用いて目的生体物質を分離し回収するための、生体物質回収装置であって、
前記生体物質回収装置は分離媒体を有し、
前記分離媒体において、前記目的生体物質が流出する流出部における、前記電場の向きと直交する平面による断面積は、前記目的生体物質が流入する流入部における、前記電場の向きと直交する平面による断面積よりも小さい。
電場を用いて目的生体物質を分離し回収するための、生体物質回収装置であって、
前記生体物質回収装置は分離媒体を有し、
前記分離媒体において、前記目的生体物質が流出する流出部における、前記電場の向きと直交する平面による断面積は、前記目的生体物質が流入する流入部における、前記電場の向きと直交する平面による断面積よりも小さい。
本発明に係る生体物質回収方法および生体物質回収装置によれば、簡素な構成で目的生体物質の回収率を向上させることができる。
本実施の形態を説明するための全図において、同一機能を有するものには同一の符号を付すようにし、その繰り返しの説明は省略する場合がある。また、本発明は、以下に示す実施の形態の記載内容に限定して解釈されるものではない。本発明は添付の特許請求の範囲によって定義されるが、その思想ないし趣旨から逸脱しない範囲で、その具体的構成を変更し得ることは当業者であれば容易に理解される。
図面等において示す各構成の位置、大きさ、形状、範囲などは、発明の理解を容易にするため、実際の位置、大きさ、形状、範囲などを表していない場合がある。このため、本発明は、必ずしも、図面等に開示された位置、大きさ、形状、範囲などに限定されない。
本明細書において単数形で表される構成要素は、特段文脈で明らかに示されない限り、複数形を含むものとする。
[第１の実施形態］
第１の実施形態に係る生体物質回収方法および生体物質回収装置について、図１、図２、図３、図４および図５を用いて説明する。
第１の実施形態に係る生体物質回収方法および生体物質回収装置について、図１、図２、図３、図４および図５を用いて説明する。
図１は、第１の実施形態に係る分離回収ワークフローを示すワークフロー図であり、生体物質回収方法の手順を示すフローチャートとしても解釈可能である。図２は、生体物質回収に用いられる分離回収システムを示す概略斜視図である。
図２に示すように、第１の実施形態に係る分離回収システムは、電気泳動システムとして実現される。この電気泳動システムは、電気泳動ユニット２１と、電気泳動装置２４を備える。電気泳動装置２４は、電圧制御部１６と、電源１５と、電気泳動槽１４と、正極１８と、負極１７とを有する。
電気泳動ユニット２１は、電場を用いて目的生体物質を分離し回収するための生体物質回収装置の例であり、本実施形態に係る生体物質回収方法を実行するために用いられる。
電圧制御部１６は、正極１８及び負極１７の間に印加する電圧を制御する。正極１８及び負極１７の間に電圧を印加することにより、電気泳動槽１４内に正極１８から負極１７に向かう電場が生じる。
電気泳動槽１４は、電気泳動ユニット２１、緩衝液１９、正極１８及び負極１７を収容する。正極１８及び負極１７は、電気泳動槽１４内において緩衝液１９に浸される。図２には正極１８及び負極１７の具体的構造をとくに図示しないが、当業者は適宜、正極１８及び負極１７を互いに絶縁しつつ電気泳動槽１４内に電場を発生させるよう配置することができる。
なお、以下において、回収の対象となる目的生体物質が核酸である場合を例に説明する。核酸は、マイナスに帯電しているため、電気泳動の方向は電場の方向と逆向きとなり、負極１７側から正極１８側に向かって電気泳動する。なお、プラスに帯電している生体物質を回収する場合は、電気泳動ユニット２１の向きを逆にするか、正極１８及び負極１７の配置を逆にする。
図３は電気泳動ユニット２１の上面図であり、図４は電気泳動ユニット２１の水平断面図であり、図５は電気泳動ユニット２１の電場の向きと平行な平面による垂直断面図である。
電気泳動ユニット２１は、電気泳動槽１４内において緩衝液１９に浸される。図３、図４及び図５に示すように、電気泳動ユニット２１は、ゲルを覆う絶縁部９と、ゲル１３（電気泳動ゲル）と、注入孔１０と、回収孔１１とを有する。
ゲル１３は、目的生体物質と不要物とを分離するために用いられる分離媒体の例である。ゲル１３として、例えばアガロースゲル又はポリアクリルアミドゲルなど公知のものを用いることができる。ゲル１３の厚みに特に限定はないが、電気泳動により得られる生体物質のバンドがシャープで視認しやすいという観点から、２～１８ｍｍであることが好ましい。なおゲル１３の厚みは一定でなくてもよい。図４および図５において、ゲル１３は略直方体であるが、その形状は限定されない。
ゲル１３に関連して、注入孔１０および回収孔１１が設けられる。注入孔１０は、様々な分子量を有する生体物質の混合物を注入するための構造である。注入孔１０は、本実施形態では、ゲル１３の一端またはその近傍において、上面に向かって開口する凹部として形成される。
生体物質は、緩衝液１９より比重の大きい液体と混合した注入液として、注入孔１０に注入される。生体物質が混合される溶媒として、例えば、グリセロール水溶液や砂糖水等が挙げられる。溶媒がグリセロール水溶液である場合には、グリセロール濃度を例えば６％とすることができる。注入液の粘度は、例えば１ｍＰａ・ｓとすることができる。
回収孔１１は、目的の分子量を有する生体物質（目的生体物質）を回収するための構成である。回収孔１１は、本実施形態では、ゲル１３の一端（ただし注入孔１０とは反対側の端）またはその近傍において、上面に向かって開口する凹部として形成される。
注入液は、注入孔１０からゲル１３に流入し、ゲル１３を通って泳動し、回収孔１１においてゲル１３から流出する。ゲル１３は、目的生体物質が流入する流入部と、目的生体物質が流出する流出部とを有する。流入部および流出部は、たとえば注入孔１０および回収穴１１にそれぞれ面するゲル１３の端面によって構成される。本実施形態では、図４および図５に示すように、流入部は注入孔１０の負極側周壁（または回収孔１１側の周壁）を構成するゲル１３の第一端面１３ａであり、流出部は回収孔１１の正極側周壁（または注入孔１０側の周壁）を構成するゲル１３の第二端面１３ｂである。
なお、本実施形態では流入部および流出部はいずれも平面であり、特に電場の向きに垂直に設けられるが、このような構成は必須ではない。また、目的生体物質の一部が、流入部および流出部以外の部分を介して流入または流出するような構成であってもよい。
注入孔１０及び回収孔１１の間隔は任意に設定することができるが、回収孔１１は、目的の分子量の生体物質がバンドとして現れる位置近傍に設けられることが好ましい。この位置は、分離媒体の組成（たとえばゲル濃度）、目的生体物質の分子量、不要物（たとえば目的生体物質とは区別して廃棄したい物質）の分子量、等に応じて適宜設計することができる。
本実施形態において、注入孔１０及び回収孔１１は略直方体であるが、その構造、形状、大きさ等は図示のものに限定されない。注入孔１０及び回収孔１１の構造、形状、大きさ等は、任意に設定することができる。図２において、注入孔１０及び回収孔１１の幅方向寸法（すなわち電場の向きと直交する水平方向の寸法）は等しいが、異なっていてもよい。
また、本実施形態では、図５に示すように注入孔１０の全周および底部はすべてゲル１３によって構成されているが、一部が絶縁部９または他の構成要素によって構成されてもよい。
さらに、本実施形態では、回収孔１１の周の一部（一面）がゲル１３の端面（すなわち第二端面１３ｂ）によって構成され、他の部分がゲル１３以外の構造によって構成される。具体的には、周の残部が絶縁部９（後述の膜１２を含む）によって構成され、底部も絶縁部９によって構成されている。しかしながら、回収孔１１の具体的構成はこれに限られず、たとえば回収孔１１の全周および底部をすべてゲル１３によって構成することも可能である。
注入孔１０及び回収孔１１を形成する方法として、例えば、ゲル１３を固める前にコームを差し込む方法、固まったゲル１３を切除して注入孔１０及び回収孔１１を形成する方法、固まったゲル１３に熱をかけて溶かすことにより注入孔１０及び回収孔１１を形成する方法、などが挙げられるが、特に限定はない。
絶縁部９は、注入孔１０の開口を形成する上部開口部２２と、回収孔１１の開口を形成する上部開口部２３とを有する。絶縁部９は、ゲル１３を覆う（たとえば、ゲル１３の少なくとも第一端面１３ａと第二端面１３ｂとの間の領域を覆う）絶縁性の容器として構成することができる。また、絶縁部９は、回収孔１１の周の一部を形成する膜１２を有する。膜１２は、回収孔１１に関してゲル１３の第二端面１３ｂと反対側に設けられる。
膜１２の材料は任意であるが、目的生体物質を透過させず、イオン（ただし目的生体物質以外のもの）を透過させる選択透過膜とすると、目的生体物質のみを効率的に回収する観点から好適である。
次に、図１を参照して、第１の実施形態に係る生体物質回収方法について説明する。本実施形態に係る電気泳動方法は、ステップ１～８の各工程を有する。
ステップ１は、ユーザーがゲル１３の注入孔１０に、目的生体物質を含む注入液を注入する工程である。
ステップ２は、電源１５および電圧制御部１６が注入孔１０及び回収孔１１を貫く電場を印加して電気泳動を行う工程である。このステップ２は、より詳細には、目的生体物質を回収孔１１に向かって移動させる電圧の印加を開始する工程（電圧印加開始工程）と、電圧印加開始工程の後に、電圧の印加を停止する工程（電圧印加停止工程）とを含む。
ステップ３は、目的生体物質が回収孔１１に到達する前に、回収孔１１内の緩衝液を除去する工程（緩衝液除去工程）を含む。また、場合によっては、ステップ３は、緩衝液除去工程の後に、洗浄液を用いて回収孔１１を洗浄する工程（洗浄工程）を含む。
このように、回収孔１１内の緩衝液を除去し洗浄することにより、不要物（たとえば目的外の生体物質）の除去性能が高くなる。これによって、回収される溶液中における目的生体物質の濃度を向上させることができる。
ステップ４は、ユーザーが回収孔１１に溶媒を注入する工程（溶媒注入工程）である。
ステップ３およびステップ４を実行するタイミングは、目的生体物質が回収孔１１に到達する前であれば、当業者が適宜設計することができる。たとえば、目的生体物質を予め染色しておき、目視によってタイミングを決定してもよい。または、目的生体物質が回収孔１１に到達する時間を予め測定または推定しておき、経過時間に基づいてタイミングを決定してもよい。濃度を効率的に向上させる観点からは、ステップ３およびステップ４は、目的生体物質が回収孔１１に到達する直前に行うと好適である。
ステップ５は、電源１５および電圧制御部１６が注入孔１０及び回収孔１１を貫く電場を再度印加して電気泳動を行う工程である。このステップ５は、より詳細には、上記ステップ２と同様に、目的生体物質を回収孔１１に向かって移動させる電圧の印加を開始する工程（電圧印加再開工程）と、電圧印加再開工程の後に、電圧の印加を停止する工程（電圧印加停止工程）とを含む。
ここで、ステップ５により、目的生体物質が回収孔１１内に到達する。なお、膜１２は目的生体物質を透過させないので、電圧印加の停止が遅れても（または電圧の印加が停止されなくても）目的生体物質は回収孔１１内に留まり、目的生体物質の回収効率が改善する。さらに、膜１２は目的生体物質以外のイオンを透過させるので、回収される溶液中における目的生体物質の濃度を向上させることができる。
ステップ６は、ユーザーが回収孔１１に到達した目的生体物質を回収孔１１から回収する工程（回収工程）である。たとえば、ユーザーは、回収孔１１内の試料溶液を取得することによって目的生体物質を回収する。
ステップ７は、他に目的生体物質があるかを決定する工程である。ステップ７にて他に目的生体物質がある場合には、ステップ８が実行される。ステップ８は、回収孔１１に緩衝液を注入する工程（緩衝液注入工程）である。ステップ８の後は、上記ステップ２に戻って各工程を繰り返す。すなわち、追加のステップ２（電圧印加開始工程および電圧印加停止工程）、追加のステップ３（緩衝液除去工程および洗浄工程）、追加のステップ４（溶媒注入工程）、追加のステップ５（電圧印加再開工程および電圧印加停止工程）、および追加のステップ６（回収工程）が実行され、さらに追加のステップ７において他の目的生体物質があるかを決定する。このような繰り返しにより、複数種類の目的生体物質を、分子量が小さい順に回収することができる。
このように、第１の実施形態に係る電気泳動ユニット２１および関連する生体物質回収方法によれば、従来の方法に比べて高効率に目的生体物質を分画及び回収することが可能となる。
また、そのような効果を簡素な構成で得ることができる。たとえば、従来の構成には分離媒体の流路を分岐させたものがあるが（特許文献３等）、そのような構成と比較すると、電気泳動ユニット２１および関連する生体物質回収方法では分離媒体の流路を一続きにできるため、一サンプルの処理に必要な体積を小さくすることができ、構成が簡素となる。
［第２の実施形態］
第２の実施形態は、第１の実施形態の電気泳動ユニット２１の構成を変更するものである。以下、図６、図７及び図８を参照して、第２の実施形態に係る生体物質回収方法と、生体物質回収装置すなわち電気泳動ユニット１２１とについて説明する。
第２の実施形態は、第１の実施形態の電気泳動ユニット２１の構成を変更するものである。以下、図６、図７及び図８を参照して、第２の実施形態に係る生体物質回収方法と、生体物質回収装置すなわち電気泳動ユニット１２１とについて説明する。
図６は電気泳動ユニット１２１の上面図であり、図７は電気泳動ユニット１２１の水平断面図であり、図８は電気泳動ユニット１２１の電場の向きと平行な平面による垂直断面図である。以下、第１の実施形態との相違を説明する。
電気泳動ユニット１２１は、ゲルを覆う絶縁部１０９と、ゲル１１３（電気泳動ゲル）と、注入孔１１０と、回収孔１１１とを有する。注入孔１１０は、たとえば第１の実施形態の注入孔１０と同一の構成とすることができる。また、ゲル１１３の流入部は、第一端面１１３ａであり、第１の実施形態の第一端面１３ａと同一の構成とすることができる。
一方、回収孔１１１の構造は第１の実施形態の回収孔１１とは異なり、とくに容積がより小さくなっている。とくに、本実施形態では、回収孔１１１の容積は注入孔１１０の容積よりも小さい。たとえば本実施形態では、第１の実施形態と比較して、回収孔１１１の幅（電場の向きに直交する水平方向の寸法）および深さ（鉛直方向の寸法）がそれぞれ小さくなっている。このように、回収孔１１１が小さく構成されることにより、回収される溶液の量が小さくなるので、回収される溶液中における目的生体物質の濃度が向上する。
また、回収孔１１１の周壁の一部は絶縁部１０９によって構成されるが、さらにその一部は円筒面１０９ａによって構成される。図７の例では、回収孔１１１の周壁のうち、ゲル１１３（第二端面１１３ｂ）によって構成される部分と、膜１２へと至る通路に対応する部分とを除いて、回収孔１１１の周壁の全体が円筒面１０９ａによって構成されている。このように円筒面を利用することにより、特定の一方向の寸法を極端に小さくせずに容積を小さくすることができる。このため、容積を小さくしてもピペットを挿入する操作が困難にならない。
また、図８に示すように、回収孔１１１の底部も絶縁部１０９によって構成され、とくに、円錐面１０９ｂを有してすり鉢状に形成されている。このような形状によれば、溶液が底部の中央に溜まるので、溶液が少量である場合にも回収が容易である。
また、ゲル１１３の流出部は第二端面１１３ｂであるが、第二端面１１３ｂの面積（すなわち、流出部における、電場の向きと直交する平面によるゲル１１３の断面積）は、第１の実施形態の第二端面１３ｂよりも小さい。また、第二端面１１３ｂの面積は、第一端面１１３ａの面積（同じく、流入部における、電場の向きと直交する平面による断面積）よりも小さい。このため、上記のように回収孔１１１の容積を注入孔１１０の容積よりも小さく構成することができ、回収される溶液中における目的生体物質の濃度が向上する。
本実施形態では、図７および図８に示すように、絶縁部１０９およびゲル１１３の形状が変更されている。とくに、絶縁部１０９の内部空間すなわちゲル１１３によって満たされる空間が、注入孔１１０から回収孔１１１に向かって狭まる構成となっている。また、ゲル１１３の少なくとも一部（とくに第二端面１１３ｂを含む領域）において、電場の向きと直交する平面によるゲル１１３の断面積は、第一端面１１３ａから第二端面１１３ｂに向かう方向に減少する（すなわち目的生体物質が泳動する向きに沿って減少する）。
このような構成とすることにより、比較的小さい第二端面１１３ｂに向かって目的生体物質を効率的に誘導することができる。とくに、図７および図８の例ではゲル１１３の断面積が連続的に減少するので、目的生体物質がゲル１１３の特定の部位にひっかかって滞留することがなく、目的生体物質の誘導がさらに効率的になる。
一般的に、電気泳動法において、回収孔の断面積を目的生体物質の分布断面積よりも小さくすることはできないが、本実施形態では目的生体物質の分布断面積が徐々に減少するので、回収孔１１１の断面積を小さく設計することができる。このため、回収する溶液の量を低減でき、したがって濃度を向上させることができる。
なお、図６に示すように、絶縁部１０９は、注入孔１１０の開口を形成する上部開口部１２２と、回収孔１１１の開口を形成する上部開口部１２３とを有する。上部開口部１２２の構成は、第１の実施形態の上部開口部２２と同一とすることができる。また、上部開口部１２３は、円筒面１０９ａの形状に沿って形成することができる。
以下、第１の実施形態の実施例について説明する。
（電気泳動ゲルの作製）
注入孔１０及び回収孔１１を有するアガロースゲルを作製した。アガロースゲルは、３％ＳｅａＫｅｍ（登録商標）ＧＴＧ－ＴＡＥ（Ｌｏｎｚａ社製）をプラスチック容器に流し入れて成型した。注入孔１０は、長さ１ｍｍ×幅５ｍｍ×深さ３ｍｍになるように、回収孔１１は、長さ２ｍｍ×幅５ｍｍ×深さ４ｍｍになるように、アガロースゲルが固まる前にコームを差し込むことで、それぞれ形成した。注入孔１０及び回収孔１１の距離は２０ｍｍとした。
（電気泳動ゲルの作製）
注入孔１０及び回収孔１１を有するアガロースゲルを作製した。アガロースゲルは、３％ＳｅａＫｅｍ（登録商標）ＧＴＧ－ＴＡＥ（Ｌｏｎｚａ社製）をプラスチック容器に流し入れて成型した。注入孔１０は、長さ１ｍｍ×幅５ｍｍ×深さ３ｍｍになるように、回収孔１１は、長さ２ｍｍ×幅５ｍｍ×深さ４ｍｍになるように、アガロースゲルが固まる前にコームを差し込むことで、それぞれ形成した。注入孔１０及び回収孔１１の距離は２０ｍｍとした。
（電気泳動）
作製したアガロースゲルを電気泳動装置（ミューピット（登録商標）、ミューピット社製）に水平に設置し、１×ＴＡＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ Ａｃｅｔａｔｅ ＥＤＴＡ Ｂｕｆｆｅｒ）を電気泳動槽１４に注ぎ、アガロースゲルの上面ぎりぎりまで満たした。注入孔１０及び回収孔１１の内部もＴＡＥ緩衝液で満たした。その後、種々の長さの核酸を含む試料溶液５μＬに、６×ＤＮＡ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｄｙｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）１μＬを混合して注入液とし、注入孔１０に注入した。
作製したアガロースゲルを電気泳動装置（ミューピット（登録商標）、ミューピット社製）に水平に設置し、１×ＴＡＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ Ａｃｅｔａｔｅ ＥＤＴＡ Ｂｕｆｆｅｒ）を電気泳動槽１４に注ぎ、アガロースゲルの上面ぎりぎりまで満たした。注入孔１０及び回収孔１１の内部もＴＡＥ緩衝液で満たした。その後、種々の長さの核酸を含む試料溶液５μＬに、６×ＤＮＡ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｄｙｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）１μＬを混合して注入液とし、注入孔１０に注入した。
注入液の注入後、１００Ｖの電圧を印加し電気泳動を行った。
次に目的長さの核酸が回収孔１１の直前にあるときに電圧を停止し、回収孔１１内の緩衝液を除去した。次に、蒸留水４０μＬを注入し、２０回ピペッティング後除去した。
次に、溶媒として蒸留水４０μＬを注入した。
再度１００Ｖの電圧を印加し、目的長さの核酸が回収孔に入った後電圧を停止し、核酸溶液を取得した。
取得した溶液は核酸定量装置ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ４２００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｌｔｄ．）を用いて定量した。定量結果から、目的核酸をコンタミなく８０％回収できていることを確認した。
次に、第２の実施形態の実施例について説明する。
（電気泳動ゲルの作製）
注入孔１１０及び回収孔１１１を有するアガロースゲルを作製した。アガロースゲルは、３％ＳｅａＫｅｍ（登録商標）ＧＴＧ－ＴＡＥ（Ｌｏｎｚａ社製）をプラスチック容器に流し入れて成型した。注入孔１１０は、長さ１ｍｍ×幅５ｍｍ×深さ３ｍｍになるように、回収孔１１１は、半径１．５ ｍｍの円筒形で、深さ３ｍｍになるように、アガロースゲルが固まる前にコームを差し込むことで、それぞれ形成した。注入孔１１０及び回収孔１１１の距離は２０ｍｍとした。
（電気泳動ゲルの作製）
注入孔１１０及び回収孔１１１を有するアガロースゲルを作製した。アガロースゲルは、３％ＳｅａＫｅｍ（登録商標）ＧＴＧ－ＴＡＥ（Ｌｏｎｚａ社製）をプラスチック容器に流し入れて成型した。注入孔１１０は、長さ１ｍｍ×幅５ｍｍ×深さ３ｍｍになるように、回収孔１１１は、半径１．５ ｍｍの円筒形で、深さ３ｍｍになるように、アガロースゲルが固まる前にコームを差し込むことで、それぞれ形成した。注入孔１１０及び回収孔１１１の距離は２０ｍｍとした。
（電気泳動）
作製したアガロースゲルを電気泳動装置（ミューピット（登録商標）、ミューピット社製）に水平に設置し、１×ＴＡＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ Ａｃｅｔａｔｅ ＥＤＴＡ Ｂｕｆｆｅｒ）を電気泳動槽１４に注ぎ、アガロースゲルの上面ぎりぎりまで満たした。注入孔１１０及び回収孔１１１の内部もＴＡＥ緩衝液で満たした。その後、種々の長さの核酸を含む試料溶液５μＬに、６×ＤＮＡ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｄｙｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）１μＬを混合して注入液とし、注入孔１１０に注入した。
作製したアガロースゲルを電気泳動装置（ミューピット（登録商標）、ミューピット社製）に水平に設置し、１×ＴＡＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ Ａｃｅｔａｔｅ ＥＤＴＡ Ｂｕｆｆｅｒ）を電気泳動槽１４に注ぎ、アガロースゲルの上面ぎりぎりまで満たした。注入孔１１０及び回収孔１１１の内部もＴＡＥ緩衝液で満たした。その後、種々の長さの核酸を含む試料溶液５μＬに、６×ＤＮＡ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｄｙｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）１μＬを混合して注入液とし、注入孔１１０に注入した。
注入液の注入後、１００Ｖの電圧を印加し電気泳動を行った。
次に目的長さの核酸が回収孔１１１の直前にあるときに電圧を停止し、回収孔１１１内の緩衝液を除去した。次に、蒸留水２０μＬを注入し、２０回ピペッティング後除去した。次に、溶媒として蒸留水２０μＬを注入した。
再度１００Ｖの電圧を印加し、目的長さの核酸が回収孔に入った後電圧を停止し、核酸溶液を取得した。
取得した溶液は核酸定量装置ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ４２００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｌｔｄ．）を用いて定量した。定量結果から、目的核酸をコンタミなく８０％回収できていることを確認した。
第１および第２の実施形態において、以下のような変形を施すことができる。
第１および第２の実施形態では、ステップ２およびステップ５が電圧印加停止工程を含むので、目的生体物質の泳動を一時的に停止させることができ、洗浄等の作業を急がずに実行することができる。しかしながら、電圧印加停止工程を省略することも可能である。すなわち、電圧の印加を継続したままステップ３、ステップ４、ステップ６等を実行することもできる。なお当然ながら、いずれかの電圧印加停止工程を省略する場合には、直後の電圧印加開始工程（または電圧印加再開工程）は不要となる。
第１および第２の実施形態では、ステップ２およびステップ５が電圧印加停止工程を含むので、目的生体物質の泳動を一時的に停止させることができ、洗浄等の作業を急がずに実行することができる。しかしながら、電圧印加停止工程を省略することも可能である。すなわち、電圧の印加を継続したままステップ３、ステップ４、ステップ６等を実行することもできる。なお当然ながら、いずれかの電圧印加停止工程を省略する場合には、直後の電圧印加開始工程（または電圧印加再開工程）は不要となる。
第１および第２の実施形態において、目的生体物質が１種類である場合等には、ステップ７およびステップ８を省略してもよい。その場合には、生体物質回収方法の実行ごとに、ステップ２～６がそれぞれ一度ずつ実行されることになる。
第１および第２の実施形態において、膜１２は省略してもよい。その場合には、回収孔１１の全周をゲルで覆ってもよいし、膜１２に代えて任意の周壁構造を用いてもよい。また、目的生体物質を回収孔にとどめる必要がない場合（回収タイミングを精度良く設計できる場合等）には、膜１２を選択透過膜とする必要はない。
第１および第２の実施形態において、ゲルにおける電場の向きを正確に制御できる場合等には、絶縁部は省略してもよい。
第１および第２の実施形態において、注入孔および回収孔の形状は任意に変更可能である。とくに、第２の実施形態において、ピペット操作の容易性が問題にならない場合には、回収孔１１１が円筒面１０９ａまたは円錐面１０９ｂを有しない形状としてもよく、たとえば薄い直方体形状状としてもよい。
２…ステップ（電圧印加開始工程、電圧印加停止工程）
３…ステップ（緩衝液除去工程、洗浄工程）
４…ステップ（溶媒注入工程）
５…ステップ（電圧印加再開工程、電圧印加停止工程）
６…ステップ（回収工程）
９，１０９…絶縁部
１０９ａ…円筒面
１０９ｂ…円錐面
１０，１１０…注入孔
１１，１１１…回収孔
１２…膜
１３，１１３…ゲル（分離媒体）
１４…電気泳動槽
１５…電源
１６…電圧制御部
１７…負極
１８…正極
１９…緩衝液
２１，１２１…電気泳動ユニット
２２，２３，１２２，１２３…上部開口部
２４…電気泳動装置
１３ａ，１１３ａ…第一端面（流入部）
１３ｂ，１１３ｂ…第二端面（流出部）
３…ステップ（緩衝液除去工程、洗浄工程）
４…ステップ（溶媒注入工程）
５…ステップ（電圧印加再開工程、電圧印加停止工程）
６…ステップ（回収工程）
９，１０９…絶縁部
１０９ａ…円筒面
１０９ｂ…円錐面
１０，１１０…注入孔
１１，１１１…回収孔
１２…膜
１３，１１３…ゲル（分離媒体）
１４…電気泳動槽
１５…電源
１６…電圧制御部
１７…負極
１８…正極
１９…緩衝液
２１，１２１…電気泳動ユニット
２２，２３，１２２，１２３…上部開口部
２４…電気泳動装置
１３ａ，１１３ａ…第一端面（流入部）
１３ｂ，１１３ｂ…第二端面（流出部）
Claims (6)
- 電気泳動装置を用いた生体物質回収方法において、
前記電気泳動装置は、電場を用いて目的生体物質を分離し回収するための、生体物質回収装置を備え、
前記生体物質回収装置は分離媒体および回収孔を有し、
前記分離媒体において、前記目的生体物質が流出する流出部における、前記電場の向きと直交する平面による断面積は、前記目的生体物質が流入する流入部における、前記電場の向きと直交する平面による断面積よりも小さく、
前記生体物質回収方法は、
目的生体物質を前記回収孔に向かって移動させる電圧の印加を開始する、電圧印加開始工程と、
前記電圧印加開始工程の後、前記目的生体物質が前記回収孔に到達する前に、前記回収孔内の緩衝液を除去する、緩衝液除去工程と、
前記緩衝液除去工程の後に、洗浄液を用いて前記回収孔を洗浄する洗浄工程と、
前記洗浄工程の後に、前記回収孔に溶媒を注入する、溶媒注入工程と、
前記溶媒注入工程の後に、前記回収孔に到達した前記目的生体物質を回収する、回収工程と、
を有する、生体物質回収方法。 - 請求項１に記載の生体物質回収方法において、前記回収工程の後に、
前記回収孔に緩衝液を注入する、緩衝液注入工程と、
追加の前記緩衝液除去工程と、
追加の前記溶媒注入工程と、
追加の前記回収工程と
を有する、生体物質回収方法。 - 請求項１に記載の生体物質回収方法において、
前記電圧印加開始工程と、前記緩衝液除去工程との間に、前記電圧の印加を停止する、電圧印加停止工程を有し、
前記溶媒注入工程と、前記回収工程との間に、前記電圧の印加を開始する、電圧印加再開工程を有する、
生体物質回収方法。 - 請求項１に記載の生体物質回収方法において、
前記生体物質回収装置は、前記目的生体物質を回収するための回収孔と、選択透過膜とを有し、
前記選択透過膜は、前記回収孔に関して前記流出部と反対側に設けられ、
前記選択透過膜は、前記目的生体物質を透過させず、イオンを透過させる、
生体物質回収方法。 - 請求項１に記載の生体物質回収方法において、
前記生体物質回収装置は、前記分離媒体の、前記流入部と前記流出部との間の領域を覆う絶縁性の容器を有する、生体物質回収方法。 - 請求項１に記載の生体物質回収方法において、
前記分離媒体の少なくとも一部において、前記電場の向きと直交する平面による断面積は、前記流入部から前記流出部に向かう方向に減少する、生体物質回収方法。
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