FI97893C - Isoelektrinen fokusointimenetelmä ja laite mainitun menetelmän suorittamiseksi - Google Patents

Description

. 97893

Isoelektrinen fokusointimenetelmä ja laite mainitun menetelmän suorittamiseksi - Isoelektriskt fokuseringsförfarande samt anordning för att utföra förfarandet Tämä keksintö koskee uutta ja keksinnöllistä menetelmää kemiallisten yhdisteiden, esim. peptidien ja proteiinien, joilla nettosähkövaraus on nolla ja jotka ovat neutraaleja käytetyissä koeoloissa, erottamiseksi muista amfoteerisista tai ei-amfoteerisista kemiallisista yhdisteistä, esim. muista peptideistä, proteiineista ja/tai suoloista, joilla on nettosähkövaraus mainituissa samoissa koeoloissa, elektroforeesilla, erityisesti preparatiivisella isoelektrisellä fokusoinnilla ja uusia välineitä, t.s. laitetta mainitun menetelmän suorittamiseksi.

Preparatiivinen elektroforeesi on tunnettu menetelmä ja erilaisia elektroforeesilaitteita on esitetty sekä analyyttisiin että preparatiivisiin tarkoituksiin. Itse asiassa pre-paratiiviset elektroforeesilaitteet ja -periaatteet voidaan jakaa neljään pääluokkaan käytetyn elektroforeesiperiaatteen mukaisesti [vrt. A.T.Andrews, Electrophoresis: Theory, Techniques, and Biochemical and Clinical Applications, Clarendon Press, Oxford 1986]: a) disc-elektroforeesi b) liikkuvarintamaelektroforeesi (vapaa elektroforeesi) c) isotakoforeesi ja d) isoelektrinen fokusointi [vrt. P.G.Righetti, Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and Applications, Elsevier, Amsterdam, s. 204-207 (1983)].

Yleensä disc-elektroforeesi ja isotakoforeesi suoritetaan hydrofiilisessä väliaineessa, joko jatkuvana (agaroosi ja polyakryyliamidi) tai epäjatkuvana (granuloidut täytteet, kuten Sephadex®). Niille on tunnusomaista suuri erotuskyky, mutta niissä voidaan käyttää vain pieniä näytemääriä. Liik- 2 97893 kuvarintamaelektroforeesi, jossa käytetään yleensä jatkuvia puskureita, suoritetaan vapaassa nestefaasissa ja sille on tunnusomaista jatkuvasti virtaava ohut puskurikalvo, johon syötetään jatkuvasti näytettä. Periaatteessa tämä menetelmä tarjoaa mahdollisuuden käsitellä suurta näytemäärää, mutta sen resoluutio on pieni. Lisäksi johtuen proteiinien korkeammasta diffuusiokertoimesta tämä menetelmä sopii parhaiten vahingoittumattomien solujen tai solunsisäisten (subcellu-lar) organellien puhdistamiseen.

Isoelektrinen fokusointi (IEF) voidaan suorittaa joko neste-väliaineissa (tiheysgradientit) tai geeliväliaineessa, joko jatkuvassa tai granuloidussa. Itse asiassa IEF-tekniikka aloitettiin preparatiivisena menetelmänä, jossa käytettiin pystysuoria lasikolonneja, jotka oli täytetty sakkaroositi-heysgradientilla. Suhteellisen suuria näytemääriä voitiin käsitellä suurella erotuskyvyllä (pH-yksikön pl = 0,02; pl = isoelektrinen piste), joka kuitenkin huomattavasti väheni, kun kolonnia tyhjennettiin alakautta keräyssuppiloon. Tämän tekniikan on käytännössä nykyään pääosin syrjäyttänyt IEF gelatiinitukiaineessa (useimmiten agaroosi- tai polyak-ryyliamidimatriisit). Viimeksi mainittu tekniikka tarjoaa suuren erotuskyvyn mutta sallii ainoastaan kohtuulliset pro-teiinikuormat. Lisäksi kaikissa preparatiivisissa menetelmissä, joissa käytetään virtaamattomana väliaineena hydro-fiilisia geelejä, on ongelmana puhdistetun proteiinin talteenotto matriisista. Tämä vaatii lisäkäsittelyvaiheita, esim. halutun vyöhykkeen toteamisen, sen leikkaamisen ja eluoimisen diffuusiolla tai elektroforeettisen talteen-ottamisen. Tässä on kaksi suurta haittatekijää: a) alhaiset saannot, koska jokainen matriisi pyrkii irreversiibelisti adsorboimaan proteiineja ja b) kontaminoitumismahdollisuus geelimateriaalista (erityisesti kun kyseessä ovat synteettiset väliaineet, kuten polyakryyliamidi, kontaminaatio reagoimattomista monomeereista ja lyhyistä, oligomeerisista po- 3 97893 lyakryyliamidikierukoista, jotka eivät ole kovalenttisesti liittyneet täytematriisiin).

Tämän keksinnön perustana on tehtävä menetelmän esittämiseksi, jolla kemialliset yhdisteet, joilla kuten peptideillä on isoelektrinen piste tai jotka ovat varauksettomia käytetyissä oloissa, puhdistetaan elektroforeesilla, jossa ei haluttu tuote vaan ainoastaan ei-toivotut sivutuotteet ja epäpuhtaudet tulevat kosketukseen matriisin kanssa ja jolla menetelmällä saadaan haluttu tuote erinomaisilla saannoilla hyvin puhtaassa muodossa.

Sekä itse mainittu tehtävä käsitteenä että sen ratkaisu sisältävät keksinnöllisiä vaiheita.

Seuraavassa keksintöä kuvataan viittauksilla liitteenä oleviin kuviin, joista: kuva l on kaavamainen yleiskuva laitteesta, jota voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisen elektroforeesimenetelmän suorittamiseksi, kuva 2 on kaavamainen osiin hajotettu kuva kuvan 1 laitteesta, kuva 3 on kaavamainen osiin hajotettu kuva tämän keksinnön mukaisen laitteen vaihtoehtoisesta suoritusmuodosta, kuva 4 on kaavamainen kuva laitteen, jota voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisen menetelmän suorittamiseksi, erään toisen vaihtoehtoisen suoritusmuodon kaikkein olennaisimmis-ta osista, kuva 5, kuva 6 ja kuva 7 ovat graafisia esityksiä, jotka kuvaavat tämän keksinnön mukaisen menetelmän elektroforeettis-ten erotusten tulosta, kuva 8 on läpileikkauskuva tämän keksinnön mukaisen laitteen kolmannesta vaihtoehtoisesta suoritusmuodosta, kuva 9 on alhaalta päin kuva revitetystä levystä, joka on kuvassa 12 esitetyn laitteen osa.

4 97893 kuva 10 on ylhäältä päin kuva mainitusta levystä, kuva 11 on poikkileikkauskuva pitkin kuvassa 9 esitettyä linjaa XI-XI ja kuva 12 on poikkileikkauskuva tämän keksinnön mukaisen laitteen eräästä suoritusmuodosta.

Tämä keksintö koskee isoelektristä fokusointielektroforeesi-menetelmää siihen soveltuvaan liuottimeen liukenevan amfo-teerisen tai neutraalin kemiallisen yhdisteen erottamiseksi ja puhdistamiseksi yhdestä tai useammasta sähköisesti varautuneesta, mainittuun liuottimeen liukenevasta kemiallisesta yhdisteestä, jolloin tämä menetelmä suoritetaan käyttäen eletroforeesilaitetta, jossa sähkövirtaus, t.s. sähkökenttä, joka kulkee elektroforeesimatriisin läpi, on kytketty hydrauliseen virtaukseen 7, 8 ja 11 (vrt. kuvat), jolloin kyseisen sähkövirtauksen suunta on eri kuin mainitun hydraulisen virtauksen, ja hydraulinen virtaus muodostuu kyseisen yhdisteen liuoksesta mainitussa liuottimessa ja matriisi jaetaan kahteen osaan, joista toinen osa, 5 tai 25, sijoittuu mainitun sähkövirtauksen katodiselle puolelle ja toinen, 12 tai 26, sijoittuu sen anodiselle puolelle, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että kyseinen amfoteerinen tai neutraali kemiallinen yhdiste pidetään isoelektrisessä tai varauksettomassa tilassa hydraulisessa virtauksessa ja sähkö-virtaus poistaa mainitun varautuneen kemiallisen yhdisteen (yhdisteet) hydraulisesta virtauksesta ainakin yhteen matriisin mainituista osista, tai ainakin yhden mainitun osan kautta ainakin yhteen elektrolyyttiliuossäiliöistä 3 ja 14, mainittujen osien tarkoittaessa, toisistaan riippumatta, im-mobilisoituja pH-gradientteja 5 ja 12, joilla kummallakin on sähkönjohtokyky ja sekä puskuri- että titrauksen standardi-liuoskapasiteetti (titrant capacity) pH-vaihteluvälillään, tai amfoteerisia isoelektrisiä immobilisoituja pH-membraa-neja 25 ja 26, joilla kummallakin on sähkönjohtokyky ja sekä puskuri- että titrauksen standardiliuoskapasiteetti tietyllä pH-arvolla.

s 97893

Keksintö koskee myös laitetta, joka on sopiva käytettäväksi tässä kuvatussa isoelektrisessä fokusointielektroforeesime-netelmässä, mainitun laitteen muodostuessa virtauskammiosta 8, joka on liitetty suoraan tai epäsuoraan joko a) kahteen säiliöön 5 ja 12, joista kumpaankin voidaan laittaa immobilisoitu pH-gradientti, tai b) kahteen laitteeseen, joihin voidaan laittaa immobilisoi-dut pH-membraanit 25 ja 26, tai c) yhteen edellä esitetyn kohdan a) mukaiseen säiliöön ja yhteen edellä esitetyn kohdan b) mukaiseen laitteeseen, toisen säiliöistä tai laitteista ollessa liitettynä toisesta päästään tai reunastaan anodikammioon 14 ja toisen säiliön tai laitteen ollessa liitetty toisesta päästään tai reunastaan katodikammioon 3.

Amfoteerinen tai neutraali yhdiste, joka pidetään isoelektrisessä tai varauksettomassa tilassa, on kemiallinen yhdiste, jolla ei ole sähköistä nettovarausta tai joka on neutraali puhdistusmenetelmän olosuhteissa ja sinä aikana, jolloin erottaminen ei-toivotusta, mukana olevasta kemiallisesta yhdisteestä (yhdisteistä) varsinaisesti tapahtuu. Se on mieluimmin proteiini, entsyymi tai pienempi peptidi, jossa on ainakin kaksi aminohappoa, tai yhdiste, joka sisältää peptidi- tai proteiiniosan, esim. glykoproteiini mutta myös nukleiinihappo, kompleksinen lipidi tai kompleksinen hiilihydraatti .

Sitä vastoin sähköisesti varautunut kemiallinen yhdiste on kemiallinen ryhmä, jolla on sähkövaraus puhdistusmenetelmän olosuhteissa ja sinä aikana, jolloin erottaminen halutusta kemiallisesta yhdisteestä varsinaisesti tapahtuu, esim. se on proteiini, entsyymi tai pienempi peptidi, joka on varautunut, t.s. ei-isoelektrinen ja myös suola, esim. alkalime-tallisuola, esim. natriumkloridi.

6 97893

Liuotin, joka on sopiva tämän keksinnön mukaiseen menetelmään, on mikä tahansa liuotin, joka liuottaa halutun kemiallisen yhdisteen ja tekee mahdolliseksi tarpeellisen sähkö-virtauksen, esim. vesi tai veden seos sopivan alkoholin, esim. alempialkanolin, esimerkiksi metanolin tai etanolin kanssa tai vesipitoinen liuos, joka sisältää ureaa, deter-genttejä tai mitä tahansa muuta veteen sekoittuvaa orgaanista tai proottista liuotinta.

SShkövirtaus tuotetaan teholähteellä 1. Voidaan käyttää mitä tahansa jännitettä, jonka systeemi kestää, esim. 100 - 10000 volttia, erityisesti 500 - 10000 volttia, mieluimmin 500 -5000 volttia, esim. 500, 1000, 5000 tai jopa 10000 volttia, edellyttäen, että kehittynyt lämpö voidaan poistaa sopivalla jäähdytyksellä. Tasapainossa tyypilliset arvot ovat esim. 1000 volttia, 3 mA ja 3 W tai 500 volttia, 10 mA ja 5 W.

Elektroforeesimatriisi on elektroforeettisen erotuksen kan-toaine.

Hydraulinen virtaus synnytetään esim. pumpulla, sekoittamalla tai pyörittämällä virtauskammiota 8 sopivan akselin ympäri ja se on nestemäisenä faasina oleva liuos, joka sisältää seoksen.

Hydraulisen virtauksen suunta on mikä tahansa sopiva kulma, esim. 5 " - 90 ", erityisesti 30 0 - 90 e, mieluimmin se on suunnilleen kohtisuora (ortogonaalinen) sähkövirtauksen suuntaan nähden.

Immobilisoitu pH-gradientti, joka on esim. sylintereissä 5 tai 12, sisältää pysyvän pH-funktion elektroforeesimatrii-silla, esim. geelillä. Immobilisoidut pH-gradientit sisältävät pH-vaihteluvälin, joka muodostetaan sinänsä tunnetulla tavalla, esim. ylikuormitetun tiheysgradientin ja polyme- 7 97893 roinnin avulla (vrt. Application Note 321, päivätty elokuussa 1982, LKB-Produkter AB, Box 305, S-16126 Bromma, Sweden), esim. sekoittamalla yhtä suuret tilavuudet kahta lähtöaine-liuosta A ja B, jotka jäljempänä kuvataan, gradienttisekoit-timessa, esim. "MicroGrad Gradient Maker"-laitteessa, valmistaja LKB-Produkter AB, mainitun sekoittimen ulossyötön ollessa liitettynä sylinteriin 5 tai 12. Lähtöliuos A on hapan, tiheä liuos ja sisältää puskuroivat Immobiline't (rekisteröity tavaramerkki, käytetään seuraavassa ilman viittausta), tai tämän ekvivalentin, ei-puskuroivat Immobiline't tai tämän ekvivalentin, Ampholine't (rekisteröity tavaramerkki, käytetään seuraavassa ilman viittausta) tai sen ekvivalentin, akryyliamidin, N,N'-metyleeni-bis-akryyliamidin, glyserolin, vettä ja sopivia polymerointikatalysaattoreita. Lähtöliuos B on emäksinen, kevyt liuos, joka sisältää puskuroivia Immobiline'ja, ei-puskuroivia Immobiline'ja, Ampholi-ne'ja, akryyliamidia, N,N'-metyleeni-bis-akryyliamidia, vettä ja sopivia polymerointikatalysaattoreita mutta ei glyserolia.

Amfoteeriset isoelektriset immobilisoidut pH-membraanit eroavat immobilisoiduista pH-gradienteista siinä, että ne eivät sisällä pH-vaihteluväliä vaan niillä on sama pH-arvo membraanin läpi. Membraanien valmistaminen on samanlaista mutta vielä yksinkertaisempaa kuin pH-gradienttien valmistus, koska minkäänlaista gradienttisekoittajaa ei tarvita eikä glyseroli ole tarpeen tiheysgradientin valmistamiseksi.

Membraanit valmistetaan polymeroimalla, mieluimmin suunnilleen neutraalissa pH-arvossa 50 eC:ssa paineilmastoidussa uunissa 1 tunnin ajan monomeerien (yleensä 10-15 % T ja 3-4 % C) liuosta, joka sisältää vaihtelevat määrät puskurointi- ja titrauksen standardiliuos-Immobiline'ja suhteissa, jotka tarvitaan halutun isoelektrisen pisteen saavuttamiseksi, yhdessä Ampholine-yhdisteiden, sopivien polymeroin- 8 97893 tikatalysaattoreiden ja veden kanssa. On olennaista, että membraaneilla on hyvä puskurikapasiteetti niiden isoelektri-sessä pisteessä, jotta estetään elektroendo-osmoosi, mikä merkitsee kokonaisnestevirtausta membraanin läpi, jonka aiheuttaa nettosähkövarauksen olemassaolo tai sen saavuttaminen. Kuitenkaan Immobiline-molaarisuuden ei tulisi membraa-nissa mielellään millään lmmobiline'llä ylittää 50 mM.

Ampholine't ovat pienen molekyylipainon omaavia amfoteerisia aineita, t.s. amfolyyttejä, jotka päinvastoin kuin Immobi-line't eivät ole kiinnittyneet akryyliamidi/Ν,Ν'-metyleeni-bis-akryyliamidipolymeeriin ja pystyvät sen vuoksi avustamaan sähkönjohtokykyä. Monien amfoteeristen aineiden, kuten aminohappojen ja peptidien ja eräiden amfoteeristen ja ei-amfoteeristen puskurikomponenttien seokset voivat toimia sopivina amfolyytteinä. Kuitenkin suuri osa isoelektrisistä fokusointikokeista suoritetaan kaupallisten amfolyyttiseos-ten avustuksella. Näistä kaikkein laajimmin käytetty on LKB Produkter AB:n markkinoima tavaramerkkinimi Ampholines. Ne muodostuvat polyaminopolykarboksyylihappojen, joilla mole-kyylipainot suurimmaksi osaksi alueella 300-600, synteettisistä seoksista. Voidaan käyttää muita tuotteita, jotka sisältävät sulfoni- tai fosfonihapporyhmittymiä amino-ja kar-boksyylihapporyhmien lisäksi. Näitä tuotteita (Servalyts®, Serva-Feinbiochemica GmbH; Biolytes®, Bio-Rad Laboratories; Pharmalytes®, Pharmacia AB) on viime aikoina verrattu Ampho-lines-valmisteisiin ja niillä on todettu olevan samanlainen teho.

Immobiline't ovat akryyliamidijohdannaisia, joilla on ylei-

0 H

Il I

nen rakenne CH2=CH-C-N-R, jossa R sisältää joko karboksyyli-happo- tai tertiäärisen aminoryhmän. Immobiline't on suunniteltu kopolymerointiin akryyliamidin ja N,N'-metyleeni-bis-akryyliamidin kanssa immobilisoitujen pH-gradienttien vai- 9 97893 mistamiseksi. Jokaisella johdannaisella on määrätty ja tunnettu pK-arvo. Akryyliamidi voidaan korvata esim. metakryy-liamidilla ja N,N'-metyleeni-bis-akryyliamidi voidaan korvata jollain muulla sopivalla ristiinkytkentäaineella, esim. sopivilla muilla akryyliamidijohdannaisilla. N-(3-dimetyyli-aminopropyyli)-metakryyliamidi, jonka pK-arvo on 9,5, voidaan mainita esimerkkinä metakryyliamidijohdannaisesta, joka vastaa Immobiline'a. Kopolymeroitumisen jälkeen Immobiline't ovat kovalenttisesti sitoutuneet, t.s. immobilisoituneet eivätkä avusta mitenkään pH-gradientin tai pH-membraanin sähkönjohtokykyä. Kuitenkin Immobiline't vaikuttavat puskuri- ja titrauksen standariliuoskapasiteettiin.

Mieluimmin pH-gradientit ja pH-membraanit säädetään johonkin arvoon pH-alueella, joka on noin 3 - noin 10, riippuen saatavissa olevista Immobiline'ista ja Ampholine'ista. Jos haluttu yhdiste on amfoteerinen, pH-arvot geelin molemmissa päissä, jotka ovat virtauskammion 8 molemmin puolin, tulee säätää juuri mainitun amfoteerisen aineen isoelektrisen pisteen yläpuolelle ja alapuolelle tai samaksi, sellaisella tarkkuudella, joka vaaditaan pitämään mainittu yhdiste isoelektrisessä tilassa koko ajan. Mainittu tarkkuus ja ero mainittujen geelin päiden pH-arvojen välillä, t.s. mainittujen geelin päiden välinen leveys pH-yksiköissä, riippuu tarvittavasta erotustehosta, t.s. epäpuhtauksien, joiden tulee mennä sisään geeliin, t.s. ainakin ohittaa geeli, isoelekt-risistä pisteistä. Jotta saavutetaan suurin mahdollinen ero-tusteho, pH-arvot mainituissa geelin päissä voivat olla samat ja yhtäsuuret kuin on halutun yhdisteen isoelektrinen piste. Tässä tapauksessa on edullista estää halutun yhdisteen menetykset, mikä saattaisi tapahtua diffuusiolla, liittämällä eräitä sopivia mekaanisia laitteita, esim. sopiva millipore-suodatin geelin ja hydraulisen virtauksen välille. Jos haluttu yhdiste on neutraali, pH-arvot mainituissa geelin päissä valitaan niin, että epäpuhtauksien täytyy mennä 10 97893 sisään geeliin. Mainitut epäpuhtaudet voivat jäädä geeliin tai poistua siitä taas ja kerääntyä anodi- ja katodikammioi-hin 14 ja 3.

Sopivia polymerointikatalysaattoreita ovat esim. Ν,Ν,Ν',Ν'-tetrametyylietyleenidiamiini (TEMED) ja ammoniumpersulfaat-ti. Mainitut katalysaattorit lisätään juuri ennenkuin aloitetaan edellä mainitun tiheän ja kevyen liuoksen sekoittaminen. Muut keinot polymerointiin ovat esim. riboflaviini yhdessä ultraviolettivalon tai gamma-säteilytyksen kanssa.

Gradienttisekoittimessa emäksinen, kevyt liuos sekoitetaan happamaan, tiheään liuokseen, joka samanaikaisesti johdetaan gradienttisekoittimen ulossyöttöön, joka on liitetty säiliöön 5 tai 12. Tällä tavoin saadussa tiheysgradientissa vaihtuu koko ajan pH-gradientti. Säiliöiden 5 ja 12 alaosat on tilapäisesti suljetut, esim. parafilmillä. Sen jälkeen, kun polymerointiprosessi on päättynyt, parafilmi poistetaan. Jos mainitun säiliön sisähalkaisija on liian pitkä, voi olla tarpeen lisätä jokin tuki, esim. rei'itetty levy, jota ei poisteta, säiliön alaosaan. Ainakin ne säiliön osat, jotka joutuvat kosketukseen polymeerin kanssa, täytyy valmistaa sellaisesta materiaalista, johon polymeeri hyvin tarttuu, esim. lasista, jotta vältetään nesteen kulkeutuminen säiliön seinän ja polymeerin välistä. Säiliöt 5 ja 12, jotka sisältävät immobilisoidut pH-gradientit, rakennetaan tämän keksinnön mukaiseen laitteeseen, esim. kuten kuvassa 1 ja 2 on esitetty. Myöhemmin gradientit pestään huolellisesti ei-toivottujen aineiden, esim. sitoutumattomien Immobiline-ke-mikaalien, katalysaattoreiden ja liittymättömien monomeerien poistamiseksi. Muussa tapauksessa johtuen geelin keskiosan hyvin alhaisesta sähkönjohtokyvystä sekä heikot sitoutumattomat anionit että kationit elektroforeettisesti tyhjenevät, kaksi suolarintamaa, jotka kerääntyvät anodista ja katodista geelialuetta kohti, eivät koskaan pysty poistumaan geelistä.

11 97893

Hyvän fokusoinnin saavuttamiseksi primäärinen Immobiline-gradientti peitetään sekundäärisellä, kantoaineamfolyyttiä ohjaavalla pH-gradientilla. Tämän keksinnön mukaista laitetta käytetään tavallisesti virtauskammio täynnä nestettä usean tunnin ajan, esim. noin viisi tuntia kunnes saavutetaan pysyvä tila ennen näytteen syöttöä. Myöhemmin virtaus-kammio 8 ja tarvittaessa kaikki muut säiliöt, jotka joutuvat kosketukseen hydraulisen virtauksen kanssa, esim. näytesäi-liö li, tyhjennetään polymeeristä uuttuneen haitallisen aineen kuten liittymättömien monomeerien poistamiseksi ja täytetään puhdistettavalla näytteellä.

Tämän keksinnön mukaisen koko menetelmän kuluessa näyteliuos-ta sekoitetaan voimakkaasti elektrodekantoitumisen estämiseksi ja lämpötila pidetään vakiona. Säiliöiden 5 ja 12 pH-gradientit pidetään myös vakiolämpötilassa. Käytetty lämpötila riippuu ennen muuta liuottimesta, halutun aineen sta-biilisuudesta ja liukoisuudesta. Vedessä pidetään tavallisesti vakiolämpötila, joka on noin 1-20 eC, esim. 2 °C.

Tämän keksinnön peruskäsite on preparatiivinen sekatekniikka, jossa käytetään nestetäytettä, joka voi olla lyhyt ja joka on liitetty kahteen geelifaasiin, jotka rajoittavat sen ja jota kuvataan seuraavassa proteiinin puhdistusesimerkis-sä. Haluttua proteiinia pidetään isoelektrisessä tilassa nestefaasissa, esim. pienessä kiertotislauskammiossa 8, kun taas siihen liittyvät epäpuhtaudet ajetaan pois joko kohti katodia 2 tai anodia 13 ja mahdollisesti (mutta ei välttämättä) fokusoidaan geelifaaseihin 5 ja 12, jotka edustavat pH-gradientteja (numerot viittaavat kuviin). pH-gradientit voidaan korvata pH-membraaneilla. Täten tässä muunnetussa isoelektrisessä fokusointitekniikassa haluttua proteiinia ei ajeta elektroforeettisesti geelimatriisiin (josta se olisi otettava talteen lisäpuhdistusvaiheella) vaan se pidetään isoelektrisessä tilassa nestevirtauksessa (hydraulinen vir- 12 97893 taus) 7, 8 ja 11, joka muodostaa näytteen syötön, ja ainoastaan (sähköisesti varautuneet) epäpuhtaudet pakotetaan fokusoitumaan geelifaaseihin 5 ja 12, jotka rajaavat nestemäisen näytteensyötön, tai ne kerätään toiseen tai molempiin elekt-rolyyttisäiliöistä 3 ja 14. Mieluimmin pH-arvo hydraulisessa virtauksessa vastaa halutun yhdisteen isoelektristä pistettä. Koska elektroforeettinen erotus suoritetaan pH-gradien-tissa (isoelektrinen fokusointi), kaikki aineet, joiden iso-elektrinen piste on pH-gradientin 5 tai 12 rajoissa, jänni-tegradientti ajaa tietylle vyöhykkeelle, jossa niillä on nettovaraus nolla ja jossa ne pysyvät paikoillaan niin kauan kuin sähkökenttä on voimassa. Ero verrattuna tunnettuihin menetelmiin on ennen muuta siinä, että lähtöolosuhteet on järjestetty siten, että haluttu yhdiste on isoelektrinen jo virtauskammiossa 8, joka muodostaa systeemin näytteensyötön. Sen vuoksi haluttua yhdistettä ei pakoteta kulkemaan sähkö-virtauksen mukana. Sen sijaan, että käytettäisiin tavanomaista isoelektristä fokusointi(IEF)-systeemiä, joka perustuu amfoteerisiin puskureihin [vrt. P.G.Righetti, Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and Applications, Elsevier, Amsterdam, s. 204-207 (1983)], tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään sen paljon edullisempaa muunnosta immobilisoitua pH-gradienttitekniikkaa (IPG) [vrt.

P.G.Righetti, J.Chromatogr. 300, 165-223 (1984)].

Tavanomainen isoelektrinen fokusointi(IEF)-systeemi ei olisi sopiva tämän keksinnön mukaiseen menetelmään seuraavista syistä: a) IEF ei ole pysyvä ajan mittaan, itse asiassa pH-gradientti vähenee ja on alttiina progressiiviselle hapotuk-selle (kulkeutuminen katodin suuntaan) [vrt. P.G.Righetti ja J.W.Drysdale, Ann.N.Y.Acad.Sei. 209, 163-186 (1973)] niin, että haluttu proteiini ei pysyisi nestefaasissa vaan mahdollisesti siirtyisi geelimatriisiin, b) koska pH-gradientit muodostuvat ainoastaan likimääräisellä tavalla tavanomaisissa lEF-systeemeissä, olisi mahdotonta säätää virtauskammion i3 97893 8 molemmin puolin olevien kahden geelin pään reunaolosuhtei-ta sillä tarkkuudella, joka vaaditaan pitämään isoelektrisen pisteen omaava haluttu kemiallinen yhdiste juuri isoelektri-sessä tilassa koko ajan, jolloin estetään sen poistuminen nestefaasista [hydraulinen virtaus: 7, 8 ja 11]. Sitä vastoin immobilisoiduilla pH-gradienteilla (IPG:t) ja pH-memb-raaneilla on useimmissa tapauksissa mahdollista asettaa reu-naolosuhteet niin, että geelin anodisessa päässä, joka on näytevirtaa vasten, on pH-arvo juuri alle halutun yhdisteen isoelektrisen pisteen (pl), kun taas vastaavassa geelin katodisessa päässä on pH-arvo säädetty juuri halutun yhdisteen pl-arvon yläpuolelle. Tietysti sopivien IPG:den valmistaminen voi olla vaikeata suhteellisen harvoissa tapauksissa, joissa halutulla aineella on erittäin korkea tai alhainen pl. Mainittu kemiallinen yhdiste, jolla on isoelektrinen piste, on näin ollen isoelektrinen tällä kapealla pH-alueel-la, jota rajaavat kaksi immobilisoitua pH-gradienttia tai pH-membraania. Jos haluttu yhdiste on amfoteerinen, tämä alue on tavallisesti 0,05 - 0,2 pH-yksikköä, kuitenkin alueet, jotka ovat alle 0,001 pH-yksikköä, voidaan myös saavuttaa. On myös mahdollista, että alue on 0 pH-yksikköä, t.s. pH-arvot mainituissa geelin päissä vastaavat halutun yhdisteen isoelektristä pistettä. Tämä tarkoittaa, että ei ole mitään pH-aluetta vaan ainoastaan nestealue kahden gee-lifaasin välillä. Jos haluttu yhdiste on neutraali, pH-arvo-ja geelin päissä ei valita huomioonottaen haluttu yhdiste vaan huomioidaan ei-toivotut amfoteeriset tai varautuneet yhdisteet siten, että mainituilla ei-toivotuilla yhdisteillä ei olisi isoelektristä pistettä mainitulla pH-alueella. Neutraali yhdiste ei koskaan mene sisään pH-gradientteihin riippumatta reunaolosuhteista geelin päissä, jotka ovat virtaus-kammioon 8 päin. Tämän reunaolosuhteiden asettamisen tarkkuuden lisäksi johtuen IPG:den rajoittamattomasta pysyvyydestä ajan suhteen, on ilman muuta varmaa, että pH-gradient-ti ei koskaan liiku siten, että isoelektriset olosuhteet 14 97893 puhdistuksen aikana olisivat kemialliselle yhdisteelle vakio hydraulisessa virtauksessa, erityisesti virtauskammiossa 8 eikä muuallakaan, esim. anodisessa tai katodisessa geelifaa-sissa 12 ja 5.

Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä on ainakin seuraavat huomattavat edut: a) erittäin korkeat näytteen saannot, lähes 100 %, koska kemiallinen yhdiste (esim. proteiini) puhdistuksen aikana ei koskaan mene sisään geelifaasiin vaan pidetään varauksettomana, t.s. isoelektrisessä tilassa koko puhdistusvaiheen ajan nestefaasissa, b) suuret näytemäärät, koska puhdistettavan yhdisteen, esim. proteiinin syöttöä voidaan ylläpitää kierrättämällä erillisen säiliön 11 ja virtauskammion 8 välillä ja ainoastaan pienien määrien tarvitsee olla annetun ajan sähkökentässä, c) suuri erotuskyky, joka riippuu siitä kuinka kapea pH-vaihteluväli valitaan halutun yhdisteen, esim. proteiinin isoelektrisen pisteen (pl) molemmin puolin, d) mitkä tahansa suolat tai puskurit, jotka ovat halutun yhdisteen (esim. peptidin tai proteiinin) mukana, poistuvat automaattisesti, joka tarkoittaa, että tätä menetelmää voidaan käyttää myös elektrodialyysiin (suolan-poistomenetelmä). Erityisesti vahvojen happojen tai emästen yksiarvoisten ionien, esim. Na+ ja Cl- poistaminen on hyvin helppoa. Heikkojen happojen ja emästen yksiarvoisten ionien, esim. ammoniumin ja asetaatin poistamiseksi on edullista käyttää jäljempänä kuvattuja amfoteerisia isoelektrisiä Immobiline-membraaneja tai verraten lyhyitä pH-gradientteja, t.s. gradientteja, joilla on ainoastaan suhteellisen pieni pH-alue, esim. 0,5-1,0 pH-yksikköä, joka olennaisesti eroaa vastaavien heikkojen happojen ja emästen pK-arvoista. useam-piarvoisten ionien, esim. sulfaatin, fosfaatin ja sitraatin poistaminen kestää kauemmin, johtuen mahdollisesti näiden Immobiline-matriisin kanssa tapahtuvasta vuorovaikutuksesta ja on parasta suorittaa ulkopuolisen pH-kontrollin alaisena, esim. käyttäen pH-mittaria, koska muuten johtuen yksiarvoi- 15 97893 sen vastaionin nopeammasta poistumisesta liuos kammiossa 8 voi tulla melko happamaksi tai alkaliseksi. Proteiininäyt-teiden nopea suolanpoistaminen erilaisiin tarkoituksiin, esim. entsyymireaktioihin tai ligandisitoutumistutkimuksiin on yksi biokemiassa viime aikoina eteen tulleista ongelmista.

Vähäinenkin suolapitoisuus näytteensyötössä (jo 1 mM kon-sentraatio) estää ei-isoelektristen proteiinien siirtymisen ehkä sen vuoksi, että ionien itsensä aikaansaama virtaus-fraktio on paljon suurempi kuin proteiineja vastaan oleva. Lisäksi suuret suolapitoisuudet näytesäiliössä voivat muodostaa katodisia tai anodisia ionirajoja, jotka ovat aikalisiä ja vastaavasti happamia, mikä voi estää proteiinin kulkeutumisen ja jopa indusoida denaturoitumisen. Segmentoiduissa (kuten myös tavanomaisissa) IPG-geeleissä käytännössä mikä tahansa näytevyöhykkeessä esiintyvä suolapitoisuus estää sen elektroforeettisen siirtymisen. Sen vuoksi paras tapa, jolla tehokkaasti eliminoidaan proteiiniepäpuhtaudet isoelektrisestä komponentista, on käyttää segmentoidun IPG-laitteen syötössä proteiinia, josta suola on jo poistettu. Kuitenkin proteiiniepäpuhtauksien eliminoiminen voidaan tehdä, vaikkakin hitaammin, myös silloin, kun suoloja esiintyy näytteessä. Viimeksi mainitussa tapauksessa suolapitoisuudet tulisi pitää minimissä yhteensopivana proteiiniliukoisuuden kanssa (esim. 5 mM tai alle) ja ulkoinen pH-kontrolli tulisi suorittaa (esim. pH-mittarilla), jotta estetään näytteen syötössä voimakkaat pH-muutokset, joita aiheuttavat suola-aineiden aikaansaamien rajojen muodostumiset. Aivan muutamissa tapauksissa minimisuolakonsentraatiota saatettaisiin tarvita näytefaasissa elektroforeesin aikana proteiinikasau-tumisen ja saostumisen estämiseksi, joka johtuu liian alhaisesta ionivahvuudesta isoelektrisessä pisteessä tai sen lähellä. Tätä varten käytetään ulkoista hydraulista virtausta, jolla täydennetään suolamenetystä, joka johtuu yhdistetyistä 16 97893 sähkö- ja diffuusiomassasiirroista (kuten Riihen muuttumattoman reoelektrolyysin malli, H.Rilbe, J.Chromatography 159, 193-205 [1978]).

Kaikki menetelmässä käytettävät elektroforeesilaitteet periaatteessa sisältävät virtauskammion 8, joka on liitetty kahteen säiliöön 5 ja 12, joista kumpikin on täytetty, toisistaan riippumatta, immobilisoidulla pH-gradientilla tai tämä on korvattu immobilisoidulla pH-membraanilla, joista gra-dienteista tai membraaneista toinen on toisesta päästään tai reunastaan liitetty virtauskammioon 8 isoelektrisessä pisteessä, joka on juuri alle puhdistettavan yhdisteen iso-elektrisen pisteen tai sama kuin se ja toisesta päästään tai reunastaan se on liitetty anodikammioon 14 ja toinen pH-gradientti tai pH-membraani on toisesta päästään tai reunastaan liitetty virtauskammioon 8 isoelektrisessä pisteessä, joka on juuri yli puhdistettavan kemiallisen yhdisteen iso-elektrisen pisteen tai sama kuin se ja toisesta päästään tai reunastaan se on liitetty katodikammioon 3.

Erään keksinön mukaisen elektroforeesilaitteen kaaviokuva on esitetty kuvassa 1. Virtauskammio 8 on liitetty näytesäiliöön 11, joka periaatteessa voi olla tilavuudeltaan mikä tahansa ja josta pumpun 9 kautta kierrätetään syöttö sähkökenttään, yleensä pumppu 9 käy maksinopeudella, esim. 5 ml/min. Kohtisuoraan hydraulista virtausta 7 vastaan aktivoidaan kahden levyn 2 ja 13 välille, jotka mieluimmin valmistetaan platinasta, sähkökenttä, joka toimii elektroforeettisesti poistaen virtauskammiosta 8 minkä tahansa ionin tai ei-isoelektrisen amfoteerisen yhdisteen. Virtauskammio 8 liitetään esim. ylemmällä tai alemmalla O-rengassulkijalla 6 ja 10 kahteen polyakryyliamidigeelisylinteriin 5 ja 12, joita pidetään lyhyissä lasiputkissa, jotka on varustettu vaipoilla 19 jäähdytysainevirtausta 18 varten [19 ja 18 ei ole esitetty kuvassa 1 vaan kuvassa 2]. Ylempi putki on liitetty, esim.

.· an t liiti i.i t ma · i7 97893 vesitiiviilia O-rengassulkijalla 4 katodikammioon 3, joka yleensä sisältää laimean emäksen (esim. 50 mM NaOH tai eta-noliamiini, etyleenidiamiini, isoioninen lysiini tai argi-niini) kuten tavallisesti tavanomaisessa isoelektrisessä fokusoinnissa (IEF). Alemman putken 12 toinen pää on anodikam-miossa 14, joka yleensä sisältää laimennetun (vahvan tai heikon) hapon, kuten etikkahappo-, fosforihappo- tai rikkihappo- tai isoionisen asparagiini- tai glutamiinihappoliuok-sen, aivan kuten tavanomaisesti käytetään standardi-IEF:ssä. Ilmeisesti O-rengassulkijat voidaan korvata jollain muulla sopivalla osalla laitteen eri osien liittämiseksi.

Tämän fraktiointitekniikan uutena piirteenä on, että vir-tauskammiota 8 rajaavat alemman ja ylemmän, immobilisoituja pH-gradientteja tai pH-membraaneja edustavan polyakryyliami-digeelin päät. Mainitut pH-gradientit ovat sylintereissä 12 ja 5, jotka mieluimmin valmistetaan lasista tai jostain muusta sopivasta materiaalista, johon geeli pystyy tarttumaan adheesiovoimilla. Järjestämällä näiden kahden virtaus-kammiota 8 rajoittavan geelisegmentin päät siten, että niillä on isoelektriset pisteet (pl) juuri alle (anodisella puolella) tai sama ja juuri yli (katodisella puolella) tai sama kuin halutun yhdisteen, esim. proteiinin isoelektrinen piste puhdistuksen aikana, tämä yhdiste käytännössä titrautuu pl-arvoonsa eikä siten pysty poistumaan hydraulisesta virtauksesta 8, 7 ja 11. Sitä vastoin kaikki epäpuhtaudet, joilla on eri pl, esim. proteiinipitoiset epäpuhtaudet, jotka liittyvät yhdisteeseen puhdistuksen aikana, automaattisesti [virtauskammiossa 8 vallitsevassa pH-arvossa] ovat joko yli tai alle niiden asianomaisen pl-arvon ja siten pakotetut lähtemään kammiosta 8 ja hakeutumaan immobilisoidun polyak-ryyliamidigeelin joko alemmalle tai ylemmälle segmentille 12 tai 5 tai kerääntymään anodi- tai katodikammioon 14 tai 3. Antamalla riittävä kiertoaika jännitegradientissa kaikki epäpuhtaudet poistuvat virtauskammiosta 8 ja puhdas yhdiste, 18 97893 esim. isoelektrinen proteiini otetaan talteen virtauskammi-osta 8 ja näytesäiliöstä 11, jotka alunperin sisälsivät syötettävän aineen. Mitään lisätoimenpiteitä tai näytteen uuttamisia ei tarvita, koska haluttu yhdiste, esim. proteiini pysyy koko ajan nestefaasissa eikä siirry geeliin.

Laite, joka kootaan esim. pystysuoraan tai mieluimmin vaakasuoraan, muodostuu anodi- ja katodikammiosta 14 ja 3, geeli-sylintereistä 12 ja 5, sulkijoista 10, 6 ja 4 ja virtauskam-miosta 8, liitetään voimalähteeseen 1. Tasapainossa tyypilliset arvot ovat 1000 V, 3 mA ja 3 W, mikä tahansa arvo on sopiva erotuksiin edellyttäen, että syntynyt lämpö voidaan poistaa sopivalla jäähdytyksellä. Näytevirtauskammio 8 varustetaan laitteilla, joilla se pidetään vakiolämpötilassa ja/tai syöttö pidetään suuremmassa, vaipalla varustetussa säiliössä 11, joka on kytketty jonkinlaisella putkituksella 15 termostaattiin 17. On edullista pitää näyteastiaa li jatkuvassa, hiljaisessa sekoituksessa, muutoin ajan mittaan tiheämpi kerrostuma voisi erottu kevyemmästä. Mitä tahansa pumppulaitetta 9, esim. peristalttista pumppua käytetään kierrätykseen, joka tavallisesti suoritetaan maksiminopeudella (esim. 5 ml/min) niin, että näyte on niin lyhyen aikaa kuin mahdollista virtauskammiossa 8, jolloin vältetään läm-pödenaturoitumisriski. Tämä on yksi kaikkein yksinkertaisimmista rakennelmista käyttöä varten. Periaatteessa mikä muu tahansa koe- tai mittauslaite voidaan rakentaa tarvittaessa tämän laitteen ympärille, esim. biosensorien detektiolaite, immunoelektroforeettinen laitteisto, laser-viritetty fluore-senssidetektiolaitteisto, mikä tahansa haluttu automaattinen systeemi, laite, esim. virtauselektrodi pH-mittauksia ja -kontrollia varten, laite radioisotooppien tarkkailemiseksi ja/tai tarvittaessa laite esim. virtauskyvetti sähkönjohtokyvyn tarkkailemiseksi. On ilmeistä erityistarkoituksissa, että näytevirtausta 7 voidaan myös tarkkailla UV- tai näkyvässä valossa tai fluoresenssitarkastelulla kromatografisiin 19 97893 kolonneihin kytketyllä standardilaitteella, seoksen joidenkin komponenttien poistumisnopeuden seuraamiseksi.

Kuvassa 2 esitetään kaavamaisesti ositettuna sama laite, joka on kuvattu kuvassa 1, ilman virtalähdettä 1, sekoittajaa 16 ja termostaattia 17, jotka on esitetty kuvassa 1, mutta siinä on esitetty kuvan 1 lisäksi jäähdytysnestevirtausta 18 varten olevat vaipat 19 sylintereiden 5 ja 12 ympärillä sekä eri komponentit 3, 5, 6, 8, 10, 12 ja 14 oikeassa asemassa koottavaksi mutta niitä ei ole vielä koottu. Jäähdytys-nestevirtaus 18 liitetään termostaattiin, esim. 17, jota ei ole esitetty kuvassa 2. Vaikka kuvassa 2 ei ole esitetty (vrt. kuva 1) näytesäiliö 11 tulisi myös pitää vakiolämpöti-lassa, esim. 2 eC, koska isoelektriset pisteet riippuvat lämpötilasta. Haluttaessa virtauskammio 8 voi myös olla varustettu vaipoilla jäähdytysnestevirtausta varten. Kuvassa 2 esitetään myös, kuvan 1 lisäksi, edullisen muotoinen virtauskammio 8, hydraulisen virtauksen 7 sisäänsyöttö ja ulos-syöttö on taivutettu, toinen kohti sylinteriä 12 ja toinen kohti sylinteriä 5. Säiliö 12, vaikkakin se on kuvattu kahdella ruuvikierreliitoksella voidaan upottaa suoraan ano-lyyttiseen liuokseen elektrodikammiossa 14.

Kuvassa 3 on laite, joka soveltuu, sen jälkeen kun sen osat on kasattu, kahden amfoteerisen yhdisteen, esim. kahden proteiinin, joilla on erilaiset isoelektriset pisteet, puhdistamiseen samassa laitteessa ja samanaikaisesti. Näytesäiliöt 11a ja llb sisältävät syötettävän lähtöaineen, joka voi olla samanlainen tai erilainen. Näytesäiliö lla on liitetty eräänlaisen putkilon 7a välityksellä kahdesta virtauskammi-osta toiseen, joka on 8a. Näytesäiliö llb on liitetty toisen putkilon 7b välityksellä toiseen virtauskammioon 8b. Vir-tauskammiot 8a ja 8b on erotettu toisistaan välissä olevalla sylinterillä 20, joka sisältää immobilisoidun pH-gradientin. Mainitun välillä olevan pH-gradientin siinä päässä, joka on 20 9789 3 virtauskammiota 8b kohti, on pH-arvo vähän korkeampi, esim. +0,05 pH-yksikköä, kuin kammiossa 8b olevan halutun yhdisteen isoelektrinen piste tai sillä on sama pH-arvo kuin halutulla yhdisteellä. Mainitun välillä olevan pH-gradientin siinä päässä, joka on virtauskammiota 8a kohti, on pH-arvo vähän alle, esim. -0,05 pH-yksikköä, virtauskammiossa 8a olevan halutun yhdisteen isoelektrisen pisteen tai sillä on sama pH-arvo kuin halutulla yhdisteellä. IEF-menetelmän lopussa halutut puhdistetut yhdisteet, esim. proteiinit kerätään kammioista 8a/lla ja 8b/llb, kaikki varautuneet epäpuhtaudet on poistettu.

Analyyttisiin tarkoituksiin voidaan käyttää kuvan l mukaista laitetta, jossa kuitenkin virtauskammio 8 on suljettu, koska sitä ei liitetä näytesäiliöön 11. Tässä tapauksessa laite voidaan rakentaa vaaka-asentoon, upottaa samaan jäähdytys-nesteeseen ja pyörittää akselinsa ympäri. Sen sijaan, että koko laitetta pyöritetään, voidaan sekoittaa näytettä virtauskammiossa esim. magneettisauvalla.

Ei ainoastaan edellä mainitussa suljetun virtauskammion tapauksessa vaan myös tavallisen "avoimen" virtauskammion, jossa on hydraulisen virtauksen sisään- ja ulossyöttö, ollessa kyseessä on edullista käyttää elektrofokusointilaitet-ta vaakasuorassa asemassa mainittujen sisään- ja ulossyöttö-jen sijaitessa pystysuorassa siten, että ulossyöttö on sisäänsyötön yläpuolella. Pystysuorassa järjestelyssä ilmakuplat pyrkivät kerääntymään virtauskammion ylempään osaan.

Tämä johtaa epäpuhtauksien epätasaiseen siirtymiseen ja estää sähkövirtauksen. Ilmakuplien poistamiseksi laite on purettava ja sijoitettava vaakasuoraan kuplien poistamiseksi kokonaan ulosjohdetun virran kautta. Lisäksi alempi IPG-segmentti, joka on upotettu alempaan elektrolyyttisäiliöön (yleensä anodi), tahtoo turvota. Tämä pakottaa geelin työntymään suojaputkesta ja jopa irrottamaan lasiseinistä ja pur- 97893 21 suamaan yli sen reunojen. Nämä ongelmat eliminoidaan vaakasuoralla laitteella, esim. kuten esitetään kuvassa 8, joka on varustettu suodattimilla 21 IPG-segmenttien kaikissa rajapinnoissa Immobiline-geelifaasien salpaamiseksi in situ. Suodattimet 21 venytetään in situ O-renkaalla, joka liitetään ulommassa putkessa olevaan rengasmaiseen ulkonemaan.

Kuvissa 1-3 immobilisoidut geelisäiliöt 5 ja 12 sijaitsevat vastapäätä toisiaan. On kuitenkin myös mahdollista sijoittaa ne vierekkäin kuten kuvassa 4 esitetään. Tällainen järjestys on erityisen sopiva suuressa mittakaavassa tapahtuvaan puhdistukseen, koska useampia kuin kaksi säiliötä 5 ja 12, esim. 4, 6 jne. voidaan upottaa virtauskammioon 8.

Useimpia tarkoituksia varten menetelmää ja laitetta voidaan parantaa korvaamalla ainakin yksi pH-gradienteista amfotee-risella isoelektrisellä immobilisoidulla pH-membräänillä. Mainittuja membraaneja voidaan pitää hyvin lyhyinä pH-gradi-entteina, jotka kattavat ainoastaan hyvin kapean pH-vaihte-luvälin. Teoreettisesti mainittu pH-vaihteluväli on nolla pH-yksikköä. Edelleen pH-gradienttien tai pH-membraanien, jotka rajoittavat virtauskammiota 8, päiden tai reunojen välisten pH-arvojen erotus voi olla myös alennettu nollaan, t.s. virtauskammio voi olla rajoitettu esim. kahdella membraanilla, joilla on sama pH-arvo, joka on identtinen halutun yhdisteen isoelektrisen pisteen kanssa. Tämä seikka on yllättävä ja tekee mahdolliseksi menetelmän, jossa voidaan valmistaa kaksi identtistä membraania kahden toisistaan eroavan membraanin sijasta. pH-membraanien käytöllä pH-gradien-ttien sijasta on lisäetuna halpa hinta. Edelleen muodostunut lämpö voidaan poistaa helpommin. Sen tähden pH-membraanit 25 ja 26 ovat useimmissa tapauksissa edulliset suoritettaessa suuressa mittakaavassa tapahtuvia puhdistuksia.

Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä rajoittamatta sitä millään tavoin.

22 97893

Lyhenteet: A: ampeeri C: (jos käytetty kuvaamaan geelikoostumusta) ristiinkyt- kentäaineen N,N'-metyleeni-bis-akryyliamidin, jonka kaava on CH2=CH-CO-NH-CH2-CO-CH=CH2, prosenttiosuus (painosta) kokonaismonomeerista T (vrt. jäljempänä) IPG: immobilisoitu pH-gradientti pl: isoelektrinen piste T: akryyliamidin ja N,N'-metyleeni-bis-akryyliamidin ko- konaiskonsentraatio [g/100 ml, t.s. paino/tilavuus-%] TEMED: N,N,Ν' N'-tetrametyylietyleenidiamiini V: voltti W: Watti

Esimerkki l: Proteilnlseoksen puhdistaminen

Koejärjestely kuten kuvassa 1 ja 2. Alemman IPG-segmentin 12 kokonaistilavuus on 26 ml sen sisältäessä pH-alueen 3,5-7,2 omaavan (7 % T, 4 % C)-matriisin ja 1 % kantoaineamfolyytte-jä suunnilleen samalla pH-vaihteluvälillä ja se valmistetaan happamasta tiheästä liuoksesta ja emäksisestä kevyestä liuoksesta sopivan gradienttisekoittimen avulla seuraavalla tavalla:

Hapan tiheä liuos valmistetaan seoksesta, jossa on 685 /ui pK 3,6, 223 /Ui pK 4,6, 226 /Ui pK 6,2, 118 /Ui pK 7,0 ja 154 /ui pK 8,5 Immobiline'a (0,2 M varastoliuoksista), 0,6 ml Ampholine'a® pH 3,5-7,0, 3,1 ml varastoi 30 % T, 4 % C)-akryyliamidia ja 3,6 ml glyserolia, lisäämällä vettä 13 ml. Emäksinen kevyt liuos valmistetaan seoksesta, jossa on 124 /Ui pK 3,6, 511 /Ui pK 4,6, 347 /Ui pK 6,2, 139 /Ui pK 7,0, 310 /Ui pK 8,5 ja 238 /ui 9,3 Immobiline'a, 0,6 ml Ampholine'a pH 3,5-7,0 ja 3,1 ml varasto(30 % T, 4 % C)-akryyliamidia, lisäämällä vettä 13 ml.

Heti kun on siirretty sopivaan kaksikammioiseen gradientti-sekoittimeen, lisätään kumpaankin edellä mainittuun liuokseen 10 /ui TEMED'iä ja 13 /ui 40%:ista ammoniumpersulfaat-

:l : Mt:t mu l.l 4 UI

23 9 7 8 9 3 tia.

Gradienttisekoittimen ulossyöttö liitetään kammioon 12, jonka alaosa suljetaan tilapäisesti, esim. parafilmillä kunnes polymerointiprosessi on tapahtunut. Polymerointi kestää noin 1 tunnin 50 eC:ssa (tai 2 tuntia 37 eC:ssa).

Ylempi IPG-segmentti 5 (kokonaistilavuus 26 ml) sisältää pH-alueen 7,4-10,0 omaavan (7 % T, 4 % C)-matriisin ja 1 % kan-toaineamfolyyttejä samalla pH-alueella ja se valmistetaan jäljempänä mainituista liuoksista a) ja b) seuraavalla tavalla: a) Hapan tiheä liuos (pH 7,4) valmistetaan seoksesta, jossa on 506 /ui pK 3,6, 387 /ui pK 7,0, 361 /ui pK 8,5 ja 46 /ui pK 9,3 Immobiline'a (0,2 M varastoliuoksista), 0,6 ml Ampho-line'a pH 7-10, 3,1 ml varasto(30 % T, 4 % C)-akryyliamidia ja 3,6 ml glyserolia, lisäämällä vettä 13 ml.

b) Emäksinen kevyt liuos (pH 10) valmistetaan seoksesta, jossa on 93 /ui pK 3,6, 335 /ui pK 7,0, 362 /ui pK 8,5 ja 289 /ui pK 9,3 Immobiline'a, 0,6 ml Ampholine'a pH 7-10 (kaikki Ampholine't 40%:isistä varastoliuoksista) ja 3,1 ml varastoi 30 % T, 4 % C)-akryyliamidia, lisäämällä vettä 13 ml.

Heti kun on siirretty gradienttisekoittimeen, liuoksiin a) ja b) lisätään kumpaankin katalysaattorit (TEMED ja ammo-niumpersulfaatti tässä järjestyksessä) kuten edellä.

Tämän gradienttisekoittimen ulossyöttö liitetään kammioon 5, jonka alaosa on tilapäisesti suljettu.

Sen jälkeen kun polymeroituminen on täysin tapahtunut, kammioiden 5 ja 12 tilapäiseksi sulkemiseksi käytetyt esteet poistetaan ja mainitut kammiot, jotka sisältävät näin valmistetut iPG-geelit, liitetään elektroforeesilaitteeseen, joka on esitetty kuvassa 1. Kaikki ei-amfoteeriset ionit (sitoutumattomat Immobiline't, katalysaattorit, puskurit, jne.) poistetaan geelistä ennen näytteen syöttöä, ajamalla 5 24 97893 tuntia 5 w/1000 v. Näin virtauskammio 8 rajoitetaan kapealle pH-vaihteluvälille (pH 7,2-7,4), keskipisteen ollessa aikaihmisen hemoglobiinin pl-arvo (7,30) (aikaihmisen hemoglobiini A:n [HbA] tyypillinen pl-arvo iPG-geelissä 10 eC:ssa). 70 mg kokonaislysaattia, joka on peräisin aikaihmisen hemoglobiini C:stä [HbC] (sisältäen noin 60 % HbA:ta ja 40 % HbCrtä), liuotettuna 25 ml:aan 0,5%:ista kantoaineamfolyyt-tiä pH 6-8, kierrätetään esifokusoidussa laitteessa 1000 voltin vakiojännitteellä. 30 minuutin aikavälein otetaan 30 /ui näytettä ja pidetään 4 eC:ssa analyysiä varten. Koe päättyy viimeisellä näyte-erällä 23 tunnin kuluttua. Erät analysoidaan (5 % T, 4 % C)-IPG-geelissä pH-alueella 6,5- 8,5. Tulokset, jotka saadaan HbA:n ja HbC:n piikkien densi-tometrijuovista laserdensitometrilla (toimittaja LKB), on esitetty kuvassa 5, jossa x-akselilla on aika [tunnit] ja y-akselilla HbA:n ja HbC:n määrä [mg]. Käyrä I (kolmiot) vastaa HbA:ta ja käyrä II vastaa HbC:tä. Nähdään, että HbA:n pysyessä vakiona kokeen kestäessä, HbC:tä poistuu progressiivisesti 23 tunnin kuluessa, kunnes sitä ei enää voida havaita. 12 tunnin kierrätyksen jälkeen HbA on ainakin 95%:isesti puhdasta kun taas 23 tunnin kuluttua se on yli 99,5%:isesti puhdasta.

Esimerkki 2: väriaineiden poistaminen proteiinista

Kuvassa 1 esitetyn laitteen käytön arvioimiseksi elektrodia-lyysiyksikkönä arvioidaan värillisten väriaineiden (suolojen muodossa) poistumiskinetiikka proteiiniseoksesta. Anodisella puolella 12 polymeroidaan IPG pH 3,5-7,1 - geeli ja katodisella puolella 5 IPG pH 7,4-10 - geeli. Näin syöttö pidetään pH:ssa 7,2-7,4. Syötettävä näyte sisältää liuoksen, jossa on 40 mg aikaihmisen puhdistettua hemoglobiini A:ta 0,5%:isessa Ampholine pH 6-8:ssa, johon on lisätty 10 mg hapanta väriainetta (bromifenolisinistä) ja 10 mg emäksistä väriainetta (toluidiinisinistä) (kokonaistilavuus 25 ml). Mainittujen 25 97 893 väriaineiden poistaminen suoritetaan 1000 voltin vakiojännitteellä, näytteitä otetaan 30 /Ui annetuin ajanjaksoin näytesäiliöstä ja arvioidaan jäännösmäärät spektrofotometri-sellä mittauksella aallonpituudella 600 nm. Tulokset on esitetty kuvassa 6, jossa x-akselilla on aika [tunnit] ja y-akselilla on kahden väriaineen määrät [mg]. Käyrä I (kolmiot) osoittaa toluidiinisinisen katodisen kulkeutumisen ja käyrä II vastaa bromifenolisinisen anodista kulkeutumista. Kuten kuvasta 6 nähdään 2 tunnin kuluttua olennaisesti kaikki väriaineet on poistettu virtauskammiosta, jäljelle on jäänyt hemoglobiininäyte, josta suolat on poistettu. Poistu-misnopeus näyttää noudattavan ensimmäisen asteen kineettistä reaktiota, koska käyrä, jossa on log konsentraatio per aika (ei esitetty) on lineaarinen. Toluidiinisinisen käyrä I on muodoltaan aluksi jyrkempi kuin bromifenolisinisen mutta mittauksia vaikeuttaa se, että tämä väriaine näyttää koostuvan kolmen komponentin muodostamasta perheestä, koska ylemmässä geelissä nähdään kolmen sinisen vyöhykkeen kulkeutuminen .

Esimerkki 3; Suolan poistaminen proteiinista 30 ml aikaihmisen hemoglobiini A (HbA)-liuosta laitetaan 50 mM NaClrää ja kierrätetään kuvassa 1 esitetyssä laitteessa 10 W vakioteholla ja 2 °C:ssa. Kierrätyskammiota rajoittaa alhaalta pH 7,2 ja ylhäältä pH 7,4. Kierrätysnopeus on 10 ml/min. Annetuin aikavälein otetaan talteen 2 ml:n erät, termostoidaan 25 °C:ssa ja tarkastellaan analyyttisellä kontrollisähkönjohtokykymittarilla 101, joka on varustettu Orion-sähkönjohtokykykyvetillä. Sähkönjohtokykymittaukset muutetaan NaCl:n jäännösmillimooleiksi. Suolan poistuminen tapahtuu pääasiallisesti täysin kahdessa tunnissa. HbA:n suolan poistumisen kinetiikka on esitetty kuvassa 7, jossa x-akselilla on aika [tunnit] ja y-akselilla natriumkloridin määrä [millimooli].

26 97893

Esimerkki 4: N-asetyyll-Eqllinl C:n puhdistaminen a) A-asetyyli-Egliini C:n (pH = 5,5) isoelektrinen piste määritetään Ampholine PAG-levyillä pH 3,5-9,5 , 5%T, 3 % C, 2,2 % Ampholine-konsentraatio.

Jokaiseen taskuun (tilavuudet aina 20 ui:aan asti) laitetaan noin 350 /ug kokonaisproteiinia ja sen jälkeen fokusointi suoritetaan 10 W:n raja-arvolla, 10 mA ja 1000 V tasapainossa. Analyyttiset ajot yleensä päättyvät 2 tunnissa, jonka jälkeen geelit kiinnitetään ja värjätään Coomassie'n sinisellä .

Kiinnitysliuos valmistetaan liuottamalla 15 g trikloorietik-kahappoa kahteen kertaan tislattuun veteen ja lisäämällä kahteen kertaan tislattua vettä niin paljon, että kokonaistilavuudeksi tulee 100 ml.

värjäysliuos valmistetaan liuottamalla 0,46 g Coomassie'n sinistä R 250 400 mitään jäljempänä mainittua värinpoisto-liuosta. Saatu liuos kuumennetaan 60 eC:seen ja suodatetaan ennen käyttöä. Edellä mainittu värinpoistoliuos valmistetaan siten, että lisätään kaksi kertaa tislattua vettä 500 mitään etanolia niin, että kokonaistilavuudeksi tulee 1000 ml (liuos I), lisätään kahteen kertaan tislattua vettä 80 mitään etikkahappoa niin, että kokonaistilavuudeksi tulee 1000 ml (liuos II) ja sekoitetaan liuokset I ja II suhteessa 1:1 (til./til.) ennen käyttöä.

b) Kahden amfoteerisen, isoelektrisen Immobiline-membraanin, pH 5,5, valmistamiseksi sekoitetaan 10,512 ml Immobiline pK 4,6tn 0,2 M liuosta ja 9,664 ml Immobiline pK 9,3tn 0,2 M liuosta ja laimennetaan kahteen kertaan tislatulla vedellä niin, että kokonaistilavuudeksi tulee 30,0 ml. Näin saadun liuoksen pH-arvoksi määritetään pH-mittarin avulla 5,5. Mai- 97893 27 nittuun liuokseen lisätään 40,0 ml liuosta A (vrt. jäljempänä), 1,5 ml Ampholine pH 5-7:ää, 96 /ui TEMED'iä, 120 /ui liuosta B (vrt. jäljempänä) ja kahteen kertaan tislattua vettä niin, että kokonaistilavuudeksi tulee 120,0 ml. Edellä mainittu liuos A valmistetaan liuottamalla 28,8 g akryyli-amidia ja 1,2 g N,N'-metyleeni-bis-akryyliamidia kahteen kertaan tislattuun veteen ja lisäämällä vettä niin, että kokonaistilavuudeksi tulee 100 ml. Edellä mainittu liuos B valmistetaan liuottamalla 400 mg ammoniumpersulfaattia 880 /ulraan kahteen kertaan tislattua vettä.

Kumpikin kahdesta jäljempänä kuvatusta laitteesta (vrt. C) täytetään 60,0 ml:11a edellä saatua liuosta ja polymeroidaan 50 °C:ssa yksi tunti.

c) Edellä mainittu laite, jota käytetään membraanien valmistamiseksi, muodostuu levystä, joka on valmistettu inertistä materiaalista, esim. polytetrafluorietyleenistä (Teflon®), joka ei tartu kiinni tai ainoastaan mitättömässä määrin tarttuu polymeeriin. Mainitulle levylle asetetaan ympäri rei'itetty kiekko (22), joka erotetaan levystä renkaan muotoisella tiivisteellä (23), jonka läpimitta on 9 cm ja korkeus 1 mm. Kuvassa 9 on esitetty kuva mainitun kiekon alapuolelta katsottuna, kuva 10 sama ylhäältä katsottuna ja kuva 11 on poikkileikkaus pitkin linjaa XI-XI, joka on esitetty kuvassa 9. Polymeroitava liuos täytetään rei'itetyn kiekon reikien 24 läpi.

d) Membraanit, jotka saadaan edellä kuvatun menetelmän mukaisesti, yhdessä rei'itettyjen kantolevyjen 22 kanssa liitetään sen jälkeen sylinteriin, jonka sisähalkaisija on noin 9,5 cm ja korkeus membraanien välillä noin 3 cm. Mainittuun sylinteriin liitetään hydraulista virtausta 7 varten sisäänsyöttö 31 ja ulossyöttö 30, jotka ovat toisiinsa nähden vastakkaisilla puolilla, ja sitä käytetään virtauskammiona 8.

28 97893

Haluttaessa millipore-suodatin (8 /um), joka on valmistettu selluloosa-asetaatista tai 6,6-polyamidista (nylon) tai jokin vastaava, esim. polypropyleenisuodatin, voidaan asettaa pH-membraanien 25 ja 26 ja hydraulisen virtauksen 7 välille, jolloin estetään puhdistettavan yhdisteen (esim. N-asetyyli-Egliini C:n) suora kosketus isoelektristen membraanien kanssa. Koko elektrofokusointilaite kootaan, jolloin edellä mainittu sylinteri sisäänrakennettunne membraaneineen korvaa virtauskammion 8 ja immobilisoidut pH-gradientit 5 ja 12. Mieluimmin mainittua sylinteriä käytetään vaakasuorassa asennossa, jolloin hydraulista virtausta 7 varten oleva sisään- ja ulossyöttö ovat pystysuorassa asennossa, ulossyötön sijaitessa sisäänsyötön yläpuolella. Mainitun vaakasuoran järjestelyn etuna pystysuoraan laitteeseen nähden on, että ilmakuplat poistuvat itsestään.

Kuvassa 12 on esitettu kootun laitteen poikkileikkauskuva. Sylinterin muotoinen putki on jaettu tuetuilla pH-membraa-neilla 22 katodikammioksi 3, virtauskammioksi 8 ja anodikam-mioksi 14. Katodi 2 ja anodi 13 on liitetty pistokkeiden 32 avulla voimalähteeseen 1 [ei esitetty]. Hydraulinen virtaus 7 tulee virtauskammioon 8 sisäänsyötön 31 kautta ja poistuu ulossyötön 30 kautta. Elektrolyyttiliuos katodi- ja anodi-kammiossa voidaan uudistaa sisään- ja ulossyötön 27 ja 28 kautta. Laitteen eri osat pidetään yhdessä neljän kierrepul-tin 29 avulla, jotka asetetaan reikien 33 läpi.

e) Koottua elektrofokusointilaitetta esiajetaan 1 tunti 500 V, 25 mA ja 10 W kylmähuoneessa (+5 eC) virtauskammion ollessa täynnä nestettä mutta ajo suoritetaan ilman puhdistettavaa N-asetyyli-Egliini C-näytettä. Sen jälkeen virtaus-kammio tyhjennetään ja täytetään puhdistettavalla näytteellä.

f) 1 g näytettä, joka sisältää yhdistelmä-DNA-N-asetyyli-Egliini C:tä (puhtaus 80 %, valmistettu eurooppalaisen pa- 97893 29 tenttihakemuksen nro 146 785 mukaan), liuotetaan 100 ml:aan 0,2%:ista kantoaineamfolyyttiä pH 5-7 ja kierrätetään (20 ml/min) esifokusoidussa laitteessa 500 voltin vakiojännitteellä ja 10 mA/5 W kylmähuoneessa (+5 °C). 30 minuutin välein otetaan 100 /ul:n näytteet ja pidetään 4 °C:ssa analyysin ajan. Kokeen päättää viimeinen näyte 5 tunnin kuluttua. Erät analysoidaan Ampholine PAG-levyllä pH 3,5-9,5, 5 % T, 3%C, 2,2% Ampholine-konsentraatio. Voidaan todeta, että kaikki epäpuhtaudet ovat poistuneet 3 tunnin kierrätyksen jälkeen.

Haluttaessa liuokset katodikammiosta 3 ja anodikammiosta 14 voidaan pumpata poistolinjaan nopeudella, joka on esim. 5 ml/min, ja regeneroida suurista säiliöistä.

Esimerkki 5: Membraanit, joilla erilainen puskurikapasi-teetti

Esimerkissä 4 esitettyjen pH = 5,5 membraanien analogit valmistetaan ja niihin lisätään 10 mM:n, 40 mM:n tai 100 mM:n konsentraatiot Immobiline'ja.

Kun 10 mM:n ja 40 mM:n "membraaneilla" on oikeat elektro-osmoottiset ominaisuudet ja niillä saavutetaan paikkansapitävät kokeelliset pl-arvot, 100 mM:n pinnalla on paljon suurempi dispersio ja saadaan tavallisuudesta poikkeavat vir-tauskäyttäytymiset pH-alueella, joka on pl-arvon lähellä. Näin ollen näyttää järkevältä asettaa "membraanissa" jokaisen Immobiline'n ylemmäksi molaarisuusrajaksi noin 50 mM.

Claims (26)

1. 97893 30 Patenttivaatimukset;
2. 1. Isoelektrinen fokusointielektroforeesimenetelmä siihen soveltuvaan liuottimeen liukenevan amfoteerisen tai neutraalin kemiallisen yhdisteen erottamiseksi ja puhdistamiseksi yhdestä tai useammasta sähköisesti varautuneesta, mainittuun liuottimeen liukenevasta kemiallisesta yhdisteestä, jolloin tämä menetelmä suoritetaan käyttäen elektroforeesilaitetta, jossa sähkövirtaus, joka kulkee elektroforeesiroatriisin läpi, on kytketty hydrauliseen virtaukseen, jolloin kyseisen sähkövirtauksen suunta on eri kuin mainitun hydraulisen virtauksen, ja hydraulinen virtaus muodostuu kyseisen yhdisteen liuoksesta mainitussa liuottimessa, ja matriisi jaetaan kahteen osaan, joista toinen osa (5) tai (25) sijoittuu katodiselle puolelle ja toinen (12) tai (26) anodiselle puolelle, tunnettu siitä, että mainittu amfoteerinen tai neutraali kemiallinen yhdiste pidetään isoelektrisessä tai varauksettomassa tilassa hydraulisessa virtauksessa (7)> (8) ja (il) ja sähkövirtaus poistaa mainitun varau tuneen kemiallisen yhdisteen (yhdisteet) hydraulisesta virtauksesta ainakin yhteen matriisin mainituista osista, tai ainakin yhden mainitun osan kautta ainakin yhteen elektrolyyttiliuossäiliöistä (3) ja (14), mainittujen osien tarkoittaessa, toisistaan riippumatta, immobilisoi-tuja pH-gradientteja (5) ja (12), joilla kummallakin on sähkönjohtokyky ja sekä puskuri- että titrauksen standar-diliuoskapasiteetti pH-vaihteluvälillään, tai amfoteeri-sia, isoelektrisiä immobilisoituja pH-membraaneja (25) ja (26), joilla kummallakin on sähkönjohtokyky ja sekä puskuri- että titrauksen standardiliuoskapasiteetti tietyllä pH -arvolla.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen isoelektrinen fokusoin-tielektroforeesimenetelmä siihen soveltuvaan liuottimeen liukenevan amfoteerisen tai neutraalin kemiallisen yhdisteen erottamiseksi ja puhdistamiseksi yhdestä tai useam- 97893 31 masta sähköisesti varautuneesta, mainittuun liuottimeen liukenevasta kemiallisesta yhdisteestä, tunnettu siitä, että sähkövirtaus kytketään hydrauliseen virtaukseen, jonka suunta eroaa sähkövirtauksen suunnasta, ja että haluttu amfoteerinen tai neutraali kemiallinen yhdiste pidetään isoelektrisenä tai varauksettomana hydraulisessa virtauksessa (7), (8) ja (11), kun taas varautuneet kemialliset yhdisteet poistetaan hydraulisesta virtauksesta sähkövirtauksella ainakin yhteen immobilisoi-duista pH-gradienteista (5) ja (12) tai mainitun pH-gra-dientin kautta ainakin yhteen elektrolyyttiliuossäiliöis-tä (3) ja (14).
4. 3. Patenttivaatimuksien 1 tai 2 mukainen menetelmä amfo-teerisen kemiallisen yhdisteen erottamiseksi ja puhdistamiseksi yhdestä tai useammasta amfoteerisesta kemiallisesta yhdisteestä, joiden isoelektriset pisteet eroavat riittävästi halutun yhdisteen, joka pidetään isoelektrisenä hydraulisessa virtauksessa, isoelektrisestä pisteestä .
5. 4. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä amfoteerisen kemiallisen yhdisteen erottamiseksi ja puhdistamiseksi yhdestä tai useammasta suolasta.
6. 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että suolat ovat yksiarvoisten happojen ja emästen suoloja.
7. 6. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puhdistettava kemiallinen yhdiste on peptidi, proteiini tai yhdiste, joka sisältää peptidi- tai proteiiniosan, joista jokaisen iso-elektrinen piste on välillä pH 3-10.
8. 7. Patenttivaatimuksen 3 tai 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puhdistettavan amfoteerisen yhdis- 97893 32 teen ja poistettavien ei-toivottujen amfoteeristen yhdisteiden isoelektriset pisteet eroavat ainakin 0,001 pH-yksiköllä.
9. 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että mainitut isoelektriset pisteet eroavat ainakin 0,05 pH-yksiköllä.
10. 9. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitut isoelektriset pisteet eivät eroa enemmällä kuin 0,2 pH-yksiköllä.
11. 10. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hydraulisen virtauksen suunta on kohtisuora sähkövirtauksen suuntaan nähden.
12. 11. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hydraulisen virtauksen (7) suunta on sellainen, että ilmakuplat poistuvat virtauskammiosta (8).
13. 12. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että immobilisoiduilla pH-gradienteilla on sekä puskuri- että titrauksen standardi liuoskapasiteetti pH-vaihteluvälillään ja ne sisältävät saman pH-vaihteluvälin omaavaa amfolyyttiä määrän, joka varmistaa riittävän sähkönjohtokyvyn.
14. 13. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että immobilisoiduilla pH-gradienteilla ja pH-membraaneilla on kontrolloitu puskuri- ja titrauksen standardiliuoskapasiteetti, pH-arvo ja sähkönjohtokyky ja jotka voidaan valmistaa toistettavalla tavalla. 1 Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-13 mukainen 97893 33 menetelmä, tunnettu siitä, että haluttu yhdiste on vesipitoisessa liuoksessa.
15. 15. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 3-14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isoelektriset pisteet pH-gradienttien päissä tai membraanien reunoilla virtauskammion (8) vieressä, ovat samat tai juuri alle puhdistettavan amfoteerisen kemiallisen yhdisteen iso-elektrisen pisteen (anodipuoli) ja samat tai juuri yli puhdistettavan mainitun amfoteerisen kemiallisen yhdisteen isoelektrisen pisteen (katodipuoli).
16. 16. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 3-15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pH-arvo hydraulisessa virtauksessa vastaa halutun yhdisteen isoelektristä pistettä.
17. 17. Isoelektrinen fokusointielektroforeesilaite, joka on sopiva käytettäväksi minkä tahansa patenttivaatimuksista 3-16 mukaisessa menetelmässä ja joka muodostuu virtaus-kammiosta (8), joka on liitetty suoraan tai epäsuoraan joko a) kahteen säiliöön (5) ja (12), joista kumpikin on sopiva täytettäväksi immobilisoidulla pH-gradientilla, tai b) kahteen laitteeseen, joihin immobilisoidut pH-membraa-nit (25) ja (26) voidaan laittaa, tai c) yhteen edellä esitetyn kohdan a) mukaiseen säiliöön ja yhteen edellä esitetyn kohdan b) mukaiseen laitteeseen, joista säiliöistä tai laitteista yksi on liitetty toisesta päästään tai reunastaan anodikammioon (14) ja toinen säiliö tai laite on liitetty toisesta päästään tai reunastaan katodikammioon (3). 1 Patenttivaatimuksen 17 mukainen isoelektrinen fo- 97893 34 kusointielektroforeesilaite, joka on sopiva minkä tahansa patenttivaatimuksista 3-16 mukaisen menetelmän suorittamiseksi ja joka muodostuu virtauskammiosta (8), joka on liitetty suoraan tai epäsuoraan joko a) kahteen säiliöön (5) ja (12), joista kumpikin on täytetty immobilisoidulla pH-gradientilla, jolla on sähkönjohtokyky ja sekä puskuri- että titrauksen standardili-uoskapasiteetti pH-vaihteluvälillään, tai b) kahteen amfoteeriseen isoelektriseen immobilisoituun pH-membrääniin (25) ja (26), joilla on sähkönjohtokyky ja sekä puskuri- että titrauksen standardiliuoskapasiteetti tietyssä pH-arvossa, tai c) yhteen edellä esitetyn kohdan a) mukaiseen pH-gra-dienttiin ja yhteen edellä esitetyn kohdan b) mukaiseen pH-membraaniin, pH-gradienttien tai membraanien virtaus-kammion (8) vieressä olevien raja-alueiden isoelektristen pisteiden ollessa samat tai juuri alle puhdistettavan amfoteerisen kemiallisen yhdisteen isoelektrisen pisteen (anodipuoli) ja samat tai juuri yli puhdistettavan mainitun amfoteerisen kemiallisen yhdisteen isoelektrisen pisteen (katodipuoli), joista pH-gradienteista tai pH-membraaneista toinen on liitetty toisesta päästään tai reunastaan anodikammioon (14) ja toinen pH-gradientti tai pH-membraani on liitetty toisesta päästään tai reunastaan katodikammioon (3). 1 Patenttivaatimuksen 17 mukainen isoelektrinen fo-kusointielektroforeesilaite, joka on sopiva minkä tahansa patenttivaatimuksista 3-16 mukaisen menetelmän suorittamiseksi ja joka muodostuu virtauskammiosta (8), joka on liitetty kahteen säiliöön (5) ja (12), joista kumpikin on täytetty immobilisoidulla pH-gradientilla, joista gra-dienteista toisella, joka on toisesta päästään liitetty virtauskammioon (8), on isoelektrinen piste juuri alle 97893 35 puhdistettavan amfoteerisen kemiallisen yhdisteen iso-elektrisen pisteen ja toisesta päästään se on liitetty anodikammioon (14) ja toisella pH-gradientilla, joka toisesta päästään on liitetty virtauskammioon (8), on iso-elektrinen piste juuri yli puhdistettavan mainitun amfoteerisen kemiallisen yhdisteen isoelektrisen pisteen ja toisesta äärirajaltaan se on liitetty katodikammioon (3).
18. 20. Patenttivaatimuksien 17, 18 tai 19 mukainen laite, jossa virtauskammio (8) on liitetty pumpun (9) välityksellä näytesäiliöön (11).
19. 21. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 17-20 mukainen laite, joka on varustettu pH-gradientit ja näytteen va-kiolämpötilassa pitävällä laitteella.
20. 22. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 17-21 mukainen laite, joka on varustettu laitteella säiliöiden (5) ja (12) pH-gradienttigeelin tai pH-membraanigeelin mekaaniseksi tukemiseksi.
21. 23. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 17-22 mukainen laite, joka sisältää 2 eikä enempää kuin 2 pH-membraania.
22. 24. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 17-22 mukainen laite, joka on sopiva kahden amfoteerisen tai neutraalin yhdisteen puhdistamiseksi samanaikaisesti ja joka muodostuu kahdesta erillisestä virtauskammiosta (8a) ja (8b), jotka on erotettu toinen toisistaan välissä olevalla im-mobilisoidulla pH-gradientilla (20) tai yhdellä tai kahdella pH-membraanilla.
23. 25. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 17-24 mukainen laite, joka on laitettu sellaiseen asentoon, että hydraulinen virtaus (7) poistaa ilmakuplat virtauskammiosta (8). 97893 36
24. 26. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 18-25 mukainen laite, jossa immobilisoiduilla pH-gradienteilla ja pH-membraaneilla on kontrolloitu puskuri- ja titrauksen standardiliuoskapasiteetti, pH-arvo ja sähkönjohtokyky ja jotka voidaan valmistaa toistettavalla tavalla.
25. 27. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 18-26 mukainen laite, jossa immobilisoiduilla pH-gradienteilla ja pH-membraaneilla on kontrolloitu puskuri- ja titrauksen standardiliuoskapasiteetti ja ne sisältävät amfolyyttejä määrän, joka varmistaa riittävän sähkönjohtokyvyn.
26. 28. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 17-27 mukainen laite, joka on varustettu sisään- ja ulossyötöillä (27) ja (28) elektrolyyttiliuosten uudistamiseksi katodi- ja anodikammiossa (3) ja (14).