ES2592380T3

ES2592380T3 - Extracción de analitos separados por isotacoforesis

Info

Publication number: ES2592380T3
Application number: ES10168635.0T
Authority: ES
Inventors: Reto Schoch
Original assignee: Molecular Control AG
Current assignee: Molecular Control AG
Priority date: 2010-07-06
Filing date: 2010-07-06
Publication date: 2016-11-29
Anticipated expiration: 2030-07-06
Also published as: US8585883B2; EP2407777A1; EP2407777B1; US20110297546A1; PT2407777T; DK2407777T3

Abstract

Un método para preconcentrar y aislar una diversidad n de analitos cargados (Ai, con i >= 1 a n) contenidos en una muestra mediante isotacoforesis, y cada uno de dichos analitos Ai tiene una movilidad electroforética efectiva μAi, y dichas movilidades electroforéticas efectivas μAi obedecen la relación completamente ordenada μA1 > μA2 > etc. > μAn, por medio de un aparato que comprende: - un canal de separación principal (C) con un extremo proximal (P) y un extremo distal (D), - medios para cargar una porción de muestra suplementada en un segmento interno de dicho canal de separación principal localizado entre dicho extremo proximal y dicho extremo distal, - medios para aplicar un campo eléctrico (Ê) entre dicho extremo proximal (P) y dicho extremo distal (D), - una diversidad n de canales de extracción (Ei, con i >= 1 a n) que están orientados de manera transversal con respecto a dicho canal de separación principal (C) y que tienen uniones respectivas con dicho canal de separación principal localizadas en sitios diferentes del mismo, y cada canal de extracción tiene una parte de extracción que conduce fuera del canal de separación principal, - medios para detectar zonas enfocadas dentro de dicho canal de separación (C) y/o medios para medir una velocidad de flujo a lo largo de un eje longitudinal de dicho canal de separación bajo la influencia de un campo eléctrico (Ê) aplicado a lo largo de dicho eje mediante dichos medios para aplicar un campo eléctrico, - medios para aplicar un flujo transversal a lo largo de cada uno de dichos canales de extracción (Ei) para extraer cualquiera de dichos analitos localizados en la unión respectiva del canal de extracción (Ei) y del canal de separación principal (C), y dicho método comprende las etapas de: - cargar un electrolito líder (LE) en una región distal del canal adyacente a dicho extremo distal y un electrolito terminal (TE) en una región proximal del canal adyacente a dicho extremo proximal, y dicho electrolito líder (LE) tiene una movilidad electroforética efectiva μLE > μA1 y dicho electrolito terminal (TE) tiene una movilidad electroforética efectiva μTE < μAn, - añadir una muestra suplementada a dicha región proximal (P) del canal, - dicha muestra suplementada comprende una mezcla de dicha muestra y un número n-1 de compuestos espaciadores (Sk, con k >= 1 a n-1), y cada uno de dichos compuestos espaciadores (Sk) tiene una movilidad electroforética efectiva μSk, y dichas movilidades electroforéticas efectivas μSk obedecen la relación completamente ordenada μAk > μSk > μAk+1, - aplicar un campo eléctrico axial entre dicho extremo proximal (P) y dicho extremo distal (D), y de ese modo se provoca una preconcentración y separación de dichos analitos y espaciadores formando zonas de espaciadores enfocadas y zonas de analitos enfocadas respectivas que fluyen a lo largo de dicho eje longitudinal, - cada uno de dichos compuestos espaciadores (Sk) en dicha muestra suplementada tiene una concentración inicial (c0,Sk) seleccionada de tal manera que corresponda sustancialmente, como su concentración preconcentrada (cSk) en la zona de espaciador enfocada respectiva, a un volumen de dicho canal de separación principal encerrado entre un par asociado de canales de extracción adyacentes (Ek) y (Ek+1), - detectar la posición y/o medir la velocidad de dichas zonas enfocadas, - opcionalmente detener el proceso desconectando dicho campo eléctrico (Ê) cuando la zona enfocada de cada analito (Ai) se localiza en la unión respectiva con el canal de extracción (Ei), - aplicar un flujo transversal de la parte de la muestra suplementada localizada en la unión del canal de separación principal y del canal de extracción respectivo, por lo que se transfiere cada analito preconcentrado (Ai) del canal de separación principal para el aislamiento de dicho analito.

Description

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descritos; y

FIG. 8D muestra la extracción de BSA en el canal de extracción E1, y ConA está preconcentrada adicionalmente en posición anterior entre el espaciador y TE (no ilustrado).

Descripción detallada de la invención

La presente invención describe sistemas y métodos para extraer analitos (que tienen en general una abundancia baja) de mezclas de muestras complejas para instrumentos automatizados de laboratorio y dispositivos manuales. Emplea la ITP basada en el apilamiento mediante el uso de espaciadores, que se modifican específicamente para coincidir con la geometría de los canales de extracción, lo que permite la extracción sólida y simultánea de varios analitos. El rendimiento y la pureza de extracción se pueden optimizar mediante un control temporal exacto de la etapa de extracción y mediante un diseño optimizado de la geometría de las intersecciones de los microcanales. Después de la extracción de los analitos, se pueden transportar a los depósitos de extracción, dispensarlos directamente en gotículas para su análisis posterior, o reinyectarlos en un canal de separación principal adicional en el que los analitos se preconcentran y aíslan adicionalmente para conseguir purezas de extracción incrementadas.

Los métodos y sistemas de esta invención se pueden usar en varios campos, tales como el diagnóstico en el punto de asistencia, ciencias de la vida, biodefensa, industrias alimentarias y del agua, y detección agrícola y ambiental. Los analitos a extraer pueden ser, p.ej., moléculas cargadas tales como aminoácidos, péptidos, proteínas, glicoproteínas, biomarcadores, hormonas, metabolitos, orgánulos, membranas, liposomas, lípidos, sacáridos y derivados de los mismos, anticuerpos, complejos de anticuerpos, ácidos nucleicos, complejos de ácido nucleico proteína, aditivos alimentarios, patógenos, virus, fármacos, metales pesados, toxinas, productos químicos industriales tóxicos, explosivos, armas químicas, armas biológicas, iones, y/o similares. La muestra que contiene los analitos puede ser una muestra clínica obtenida de un fluido corporal o muestra de tejido, o puede ser de una fuente ambiental, por ejemplo. Además, el analito a extraer puede ser compatible con un inmunoensayo, secuenciación de proteínas, espectrometría de masas, geles, PCR, amplificación isotérmica, reacciones de hibridación, micromatrices, unión proteína-ADN. La muestra se puede tratar con un tampón de lisis, si las moléculas de analito están contenidas en células. Esto liberará los analitos a la disolución para su procesamiento posterior.

El ensayo de ITP se diseña para apilar varios analitos en zonas específicas que están separadas entre sí por moléculas espaciadoras. La FIG. 1A ilustra el proceso de ITP, durante el cual los analitos (A1 a An) y los espaciadores (Si a Sn-1) se redistribuyen por sí mismos en zonas secuenciales según su movilidad electroforética efectiva. Este proceso obedece la función de regulación de Kohlrausch (KRF),

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en la que z es la valencia iónica de la especie j, c es la concentración de la especie j, x es la posición en el canal de separación principal, t es el tiempo, y µ es la movilidad electroforética efectiva de la especie j. La movilidad electroforética efectiva se define como:

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en la que v es la velocidad media observable y Ê el campo eléctrico en las condiciones experimentales específicas. La movilidad electroforética efectiva es diferente de la movilidad electroforética completamente ionizada, que se considera más una propiedad del material. Esto da como resultado una disminución por etapas de las concentraciones del analito y de los iones espaciadores (partiendo de LE a TE). Los espaciadores se modifican para alcanzar la ITP en modo de meseta, y la longitud de la meseta en las condiciones de ITP dSk corresponde en un ±20% a la distancia de separación entre canales dEk como se muestra en la FIG. 1B, así:

dEk = dSk (±20%) (3)

La concentración preconcentrada del espaciador Sk enfocado en ITP en modo de meseta se puede calcular con la EC. (1), y el estado de electroneutralidad (Khurana y Santiago, Anal. Chem., 2008, 80, 279):

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en la que G es el contraión común. En condiciones de KRF estacionarias y una sección transversal constante del canal de separación principal, la longitud de la meseta de cada zona de espaciador depende de la longitud del tapón inyectado dln (FIG. 3A):

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en la que c0,Sk es la concentración inicial del espaciador Sk. Con eso, se puede calcular la longitud de la meseta de cada zona de espaciador según la EC. (5) como una función de la concentración de espaciador inicial c0,Sk. Para el esquema de inyección continua (FIG. 4) como se describe más adelante, la longitud de inyección se puede aproximar como:

dln = μSk Ê tITP , (6)

en la que tITP es el tiempo durante el cual se lleva a cabo el enfoque isotacoforético.

La ITP en modo de meseta se alcanza cuando las moléculas cargadas están presentes a una concentración inicial suficientemente elevada para formar zonas enfocadas con un perfil de concentración en meseta (localmente uniforme) en el estado estacionario. De manera diferente, para las concentraciones iniciales bajas (y tiempos cortos de enfoque) de las moléculas cargadas, la anchura de la zona puede ser del orden de la anchura de la interfase. Este régimen de ITP se ha denominado modo de pico, en el que los perfiles de concentración de las zonas enfocadas son aproximadamente gaussianos en vez de en forma de meseta, véase la FIG. 1A. La anchura de la interfase en la ITP en modo de pico está regida por el gradiente del campo eléctrico y la dispersión en el límite líderterminal.

En esta invención de ITP, los espaciadores se diseñan para alcanzar el modo de meseta, y las moléculas de analito están presentes en general a concentraciones inferiores, formando picos enfocados. Las distancias de separación entre los picos de analitos está principalmente determinada, por lo tanto, por la concentración de los espaciadores que separan los analitos a una distancia definida entre sí, y la longitud de la meseta puede ser de entre 20 µm y 50 mm. Las concentraciones típicas son las siguientes: intervalo mM para LE y TE, µM para los espaciadores, y nM o inferior para las moléculas de analito.

Para la selección del LE, TE y los espaciadores, su movilidad electroforética efectiva es lo más importante, ya que describe su orden de enfoque durante la ITP. La movilidad electroforética efectiva de un ión cambia con sus valores de pKa, y depende además de varios parámetros tales como el pH del tampón, la fuerza iónica, el tipo de ión, la valencia del ión y la matriz de cribado. La movilidad electroforética efectiva de cientos de sustancias aniónicas ha sido simulada por Hirokawa et al. (J. Chrom., 1983, 271, D1). Estos resultados se incluyen en la base de datos gratuita Peakmaster de Jaros et al. (Electrophoresis, 2004, 25, 3080).

En los párrafos siguientes se describe un procedimiento general para la selección de los electrolitos y espaciadores. La diferencia de movilidades efectivas entre el LE y TE debería ser tan grande como sea posible, de 10 a 70 × 10-9

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ms-1, que permite hacer funcionar el ensayo de ITP lo suficientemente rápido (unos cuantos minutos) a aproximadamente 10 a 500 V cm-1. La diferencia de movilidad efectiva entre el LE y TE depende además del número de analitos que se tienen que extraer, ya que se ha considerado una diferencia de movilidades efectivas de al menos

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2 a 5 × 10-9 ms-1 entre dos zonas de meseta para conseguir un pico de analito enfocado claramente. Así, un ensayo de ITP para la extracción de seis analitos se debería diseñar con una diferencia mínima de movilidades

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efectivas entre el LE y TE de aproximadamente 18 a 30 × 10-9 ms.

A continuación, se tiene que determinar el pH del sistema tampón en el que se llevará a cabo la extracción, y se tienen que considerar los puntos isoeléctricos (pI) de las moléculas de analito para esta etapa. El valor de pH del tampón del LE y TE se selecciona de forma que todas las moléculas de analito estén cargadas negativamente o positivamente, y que en general tenga un valor de pH entre 3 y 10. Además, la selección del valor de pH del tampón permite la exclusión específica de la migración de moléculas contaminantes si están cargadas de manera opuesta a las moléculas de analito, y/o se puede elegir el valor del pH y la composición y concentración de la matriz de cribado de forma que las moléculas contaminantes y las moléculas de analito tengan movilidades electroforéticas efectivas diferentes. El LE y TE no tienen que tener el mismo valor de pH, pero se recomienda por simplicidad. El segundo parámetro importante para la determinación de un electrolito de ITP es su fuerza iónica. Khurana y Santiago (Anal. Chem., 2008, 80, 6300) han descrito que el enfoque en modo de pico óptimo se consigue si el LE tiene una conductividad de 0,8 S m-1 y el TE 0,03 S m-1 .

Hasta ahora, se ha determinado el pH y la fuerza iónica de los electrolitos, y ahora se tienen que establecer sus composiciones químicas, para cuyo proceso se recomienda el programa gratuito Peakmaster. Se puede elegir un ácido y una base de la base de datos Peakmaster y añadirlos a la lista de constituyentes de electrolitos de fondo del programa, para cuyos componentes se pueden calcular parámetros del sistema tales como el pH resultante, la fuerza iónica, la conductividad y la capacidad tamponadora. Las concentraciones del ácido y de la base se pueden cambiar hasta obtener los parámetros deseados del sistema para el LE y TE. Debido a que 0,8 S m-1 y 0,03 S m-1 son las fuerzas iónicas óptimas para el LE y TE, como se describió anteriormente, las concentraciones finales serán de alrededor de 100 mM y aproximadamente 10 mM, respectivamente.

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La movilidad electroforética efectiva de los analitos se puede hallar potencialmente en la bibliografía, pero, para el diseño exacto del ensayo de ITP, la movilidad efectiva de cada analito se tiene que determinar experimentalmente. Esto se puede llevar a cabo con diversos experimentos, de los cuales se describen dos en la presente memoria. El primero es un método electroforético, en el que se inyecta el analito y una molécula de referencia con una movilidad electroforética efectiva exactamente conocida en un canal de separación. Para fines de calibración, ambas moléculas están marcadas de manera fluorescente, de forma que se pueden investigar con un microscopio de fluorescencia. Después de la inyección, las dos moléculas se separarán según su movilidad efectiva, y debido a que se conoce la movilidad efectiva de la molécula de referencia, se puede calcular fácilmente la del analito.

El segundo método para la determinación de la movilidad electroforética efectiva de un analito se basa en la ITP. En el primer experimento repetitivo, se lleva a cabo la ITP con el LE, TE (como se determinó anteriormente) y el analito, y se verifica que la molécula de analito se enfoca entre el LE y TE. Para fines de calibración, la molécula de analito se puede marcar de manera fluorescente para la detección óptica. Después, el TE se sustituye con otro TE que tiene una movilidad efectiva mayor mediante la selección de otro ión la base de datos Peakmaster, o cambiando el valor del pH del TE para afinar su movilidad electroforética efectiva, y se repite el experimento. Si el analito está enfocándose, la movilidad efectiva del TE todavía es demasiado baja y se tiene que incrementar de nuevo. Una vez que el analito ya no se preconcentra, se puede concluir que la movilidad electroforética efectiva del analito tiene que estar entre este TE y el TE previo. Cuanto menores sean los incrementos de la movilidad del TE, más exacta será la determinación de la movilidad electroforética efectiva del analito.

Finalmente, las moléculas espaciadoras se añaden en Peakmaster al TE a concentraciones bajas, en general µM a mM, según la EC. (5). Primero, se añade el espaciador 1 con una movilidad electroforética efectiva entre el analito 1 y 2 (verificada mediante la función de cálculo de Peakmaster) a la lista de constituyentes. Después, se puede añadir el espaciador 2 que tiene una movilidad efectiva entre el analito 2 y 3, el espaciador 3 tiene que tener una movilidad efectiva entre el analito 3 y 4, y así sucesivamente. Después de cada iteración se tiene que controlar que todavía se cumplan los parámetros del sistema del TE.

Una vez que se han determinado el LE, TE y las moléculas espaciadoras, se tiene que verificar experimentalmente que de hecho tienen la movilidad efectiva y el orden de enfoque esperados. Se podrían dar desplazamientos de la movilidad si se usa una matriz de cribado, ya que la matriz de cribado no se ha considerado durante el proceso de simulación con Peakmaster. En general, una matriz de cribado es ventajosa si dos analitos tienen casi la misma movilidad electroforética efectiva en disolución libre pero tienen tamaños diferentes, lo que permite incrementar su diferencia de movilidades electroforéticas efectivas mediante un mecanismo de exclusión por tamaño por medio de una optimización de la composición y concentración de la matriz de cribado. La matriz de cribado puede ser de polisacáridos tales como hidroxipropil-, hidroxietil-, (hidroxipropil)metil-celulosa, un gel de agarosa, o un polímero tal como un copolímero en bloque (que contiene oligómeros repetitivos de dos o más polímeros diferentes), un polímero lineal, un polímero ramificado o un polímero reticulado.

Se añade en general un agente para la supresión del flujo electroosmótico a los electrolitos, lo que permite un rendimiento más alto debido a que el transporte electroforético se hace más dominante. Los agentes para la supresión del flujo electroosmótico se pueden seleccionar del grupo que consiste en polivinilpirrolidonas, polietilenglicoles, poli(óxidos de etileno), polilactamas, derivados de poliacrilamida sustituidos, derivados de metilhidroxietilo hidrosolubles de celulosa y poli(alcohol vinílico).

La movilidad electroforética efectiva del LE, TE y espaciadores se ha verificado experimentalmente, y ahora se tiene que ajustar la concentración de las moléculas espaciadoras. La EC. (5) se ha usado para una primera aproximación de la concentración necesaria de espaciador, y este parámetro se tiene que afinar experimentalmente. Esto se puede llevar a cabo por medio de medidas de calibración fluorescentes, por ejemplo: la distancia de separación entre dos analitos fluorescentes corresponde a la longitud de la meseta (dSk) del compuesto espaciador (Sk), cuyo parámetro se ajusta por medio de un incremento o disminución de la concentración inicial de espaciador c0,Sk hasta que se cumple dEk = dSk.

Los canales se pueden fabricar de vidrio, plástico (en particular polímeros orgánicos o de condensación), resinas (tales como PDMS -polidimetilsiloxano), silicio, o se pueden emplear también otros materiales. Para el vidrio, se pueden usar tecnologías de microfabricación para la estructuración de los canales, mientras se usa en general el moldeo por inyección o el fresado de precisión para los materiales plásticos.

Debido al proceso de fabricación de los canales de vidrio mediante el uso de grabado húmedo, la anchura w de todos los canales es en general mayor que su altura h:w > h. La altura es en general menor de ~400 µm, y la anchura menor de ~1 mm. En contraste, si se emplean métodos de fabricación diferentes, la altura puede ser igual o incluso mayor que la anchura, y puede alcanzar hasta ~1 mm. Para procedimientos de extracción sólidos y repetibles, la longitud de la meseta de los espaciadores dSk es mayor de dos veces la anchura del canal de separación principal wM:

dSk > 2wM (7)

La geometría de las intersecciones de los canales de extracción de ITP se optimiza para alcanzar purezas y

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rendimientos de extracción más altos. Como se muestra en la FIG. 1B, las partes de inyección y extracción de los canales de extracción se pueden diseñar con anchuras diferentes, wE,li y WE,Ei, respectivamente. Además, las geometrías potenciales de las intersecciones se muestran en la FIG. 2A-D, en la que las líneas representan las líneas del campo eléctrico o las líneas de flujo para el flujo electrocinético o accionado por presión, respectivamente. La introducción de constricciones en los canales de extracción justo antes y/o después de la intersección conduce a líneas de campo/flujo optimizadas a lo largo del canal de separación principal, lo que da como resultado purezas y rendimientos de extracción mayores.

El enfoque y la extracción de los analitos se pueden llevar a cabo con muchos protocolos, de los que se muestran dos ejemplares de acuerdo con la invención en la FIG. 3 y FIG. 4. En la FIG. 3A, el depósito 10 se rellena con TE, el depósito 12 con la muestra que contiene los analitos y los espaciadores, y todos los depósitos restantes con LE que puede contener una matriz de cribado. Después, se aplica un vacío al depósito 11 para rellenar los canales tal como se muestra. A continuación, se aplica un campo eléctrico del orden de 10 a 500 V cm-1 a lo largo del canal de separación principal entre los depósitos 10 y 13, de forma que el analito y las moléculas espaciadoras se apilan entre el LE y TE como se muestra en la FIG. 3B. Inmediatamente tras la aplicación del campo eléctrico, las zonas apiladas están entre la posición 14 y 15, y después viajan hacia delante hasta que están frente a sus canales de extracción correspondientes. Finalmente, las zonas de analitos se transfieren a los canales de extracción mediante un flujo electrocinético o accionado por presión, como se muestra en la FIG. 3C mediante las flechas.

La matriz de cribado tiene principalmente dos funciones: (1) Incrementa la diferencia de las movilidades electroforéticas efectivas entre los analitos de interés. La separación se basa simplemente en la movilidad electroforética si los electrolitos no contienen una matriz de cribado, mientras una matriz de cribado conduce a un mecanismo de exclusión por tamaño. (2) Impide que entren burbujas y partículas grandes en los canales, lo que incrementa la solidez del método. Además, se puede integrar una membrana porosa en los depósitos o los canales para la filtración de la muestra y los electrolitos, en la que los poros pueden tener un tamaño de nano-o micrometros.

Otro protocolo ejemplar para el apilamiento y la extracción de los analitos se muestra en la FIG. 4, en la que el depósito 20 se rellena primero con TE que contiene los analitos y los espaciadores. Todos los otros depósitos excepto el 21 se rellenan de LE que puede contener una matriz de cribado, y se aplica un vacío al depósito 21, lo que da como resultado el llenado de los canales como se muestra en la FIG. 4A. En la siguiente etapa, se aplica el campo eléctrico de ITP de aproximadamente 10 a 500 V cm-1 entre los depósitos 20 y 22, lo que conduce a un apilamiento instantáneo de la muestra cerca de la posición 23. Estas zonas se desplazan hacia delante, se paran una vez que están frente a sus canales de extracción correspondientes, y se extraen en estos canales mediante el uso de un flujo electrocinético o accionado por presión como se muestra en la FIG. 4C mediante las flechas.

Si los analitos se tienen que extraer en un tampón diferente del LE para su análisis posterior, se puede aplicar un procedimiento de relleno de microcanales como se demuestra en la FIG. 5. La red de microcanales de la FIG. 4 se usa en la FIG. 5, pero también se puede aplicar el mismo esquema al dispositivo de la FIG. 3. Primero, los depósitos 32 a 35 se rellenan con el tampón de extracción (EB) deseado, el depósito 31 con LE, y el depósito 30 con TE que contiene los analitos y los espaciadores. Después, se aplica un vacío bajo a los depósitos 36 a 43, y un vacío alto al depósito 44. Esto permite rellenar los canales de extracción con el tampón de extracción como se muestra mediante las flechas blancas en la FIG. 5A, y una pequeña cantidad del tampón de extracción se transporta en el canal de separación principal al depósito 44. Para superar este llenado heterogéneo del canal de separación principal, se aplica un flujo electrocinético en la FIG. 5B desde el depósito 31 hasta el depósito 44, de forma que todo el canal de separación principal se está llenando con LE solamente. La FIG. 5C muestra un primer plano de la unión indicada mediante la línea discontinua de la FIG. 5B.

Para ambos esquemas, después de haber transferido las zonas de analitos a los canales de extracción, se vuelve a aplicar un campo eléctrico a lo largo del canal de separación principal, cuya longitud varía entre 1 mm y 50 cm, para transportar las moléculas de analito restantes al depósito de residuos 13, 22 o 31. Después, se aplica el flujo a lo largo de los canales de extracción para transferir completamente las zonas de analitos a los depósitos de extracción. Este proceso permite reducir la entrada de moléculas contaminantes a los canales de extracción. En vez de transportar los analitos a los depósitos de extracción, también se pueden dispensar en gotículas como se muestra en la FIG. 6. Para esta etapa, se dispensa continuamente líquido desde el microcanal de extremo abrupto sobre una superficie hasta que se alcanza el volumen deseado de gotícula. Se pueden generar simultáneamente varias gotículas a través de múltiples canales de extracción, y las gotículas se pueden colocar en una matriz específica para su análisis posterior, tal como mediante espectrometría de masas, microscopía crioelectrónica, AFM, láseres infrarrojos, tecnologías basadas en campos evanescentes, formación de imágenes mediante resonancia de plasmones superficiales, o detecciones ópticas, por ejemplo.

En otra realización, los analitos extraídos se pueden reinyectar según la FIG. 3 en un canal de separación principal adicional en el que los analitos se preconcentran y aíslan adicionalmente. Con ello, los analitos se purifican de manera secuencial, donde en el primer módulo de extracción se eliminan las moléculas con abundancia alta, y en el segundo módulo de extracción se lleva a cabo el aislamiento selectivo de los analitos, por ejemplo. Esto se puede conseguir mediante el uso de diferentes sistemas tampón de ITP (pH, fuerza iónica, movilidad electroforética efectiva) para el primer y segundo módulos de extracción.

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Claims

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