DE102016116768B4

DE102016116768B4 - Kaskaden-Free-Flow-Isotachophorese-Vorrichtung

Info

Publication number: DE102016116768B4
Application number: DE102016116768.1A
Authority: DE
Inventors: Andreas Manz; Jukyung Park; Rosanne Guijt
Original assignee: Korea Institute of Science and Technology Europe Forschungs GmbH
Current assignee: Korea Institute of Science and Technology Europe Forschungs GmbH
Priority date: 2016-09-07
Filing date: 2016-09-07
Publication date: 2018-05-17
Anticipated expiration: 2036-09-08
Also published as: DE102016116768A1

Abstract

Kaskaden-Free-Flow-Isotachophorese (FFITP)-Vorrichtung, umfassend mindestens zwei kaskadierende Domänen, eine erste Domäne (D1) und wenigstens eine weitere Domäne (D2), wobei die erste Domäne (D1) und die wenigstens eine weitere Domäne (D2) jeweils mindestens drei Eingänge, eine Separationskammer (6A; 6B), auf welche ein elektromagnetisches Feld (1) anwendbar ist, und zwei oder mehr Ausgänge umfassen, wobei die Höhe des Probenvolumens (2) in der Separationskammer der ersten Domäne (D1) größer ist als die Höhe des Probenvolumens (2) in der Separationskammer der wenigstens einen weiteren Domäne (D2), wobei zumindest einer der Ausgänge der ersten Domäne (D1) über ein Probenvolumeninterface (4) mit einem der Eingänge der wenigstens einen weiteren Domäne (D2) verbunden ist und wobei das Probenvolumen (2) in dem Probenvolumeninterface (4) durch drei Vektoren definiert ist, nämlich die Höhe des Probenvolumens in dem Probenvolumeninterface, die Weite des Probenvolumens in dem Probenvolumeninterface und der Strecke, die das Probenvolumen zwischen der ersten Domäne (D1) und der wenigstens einen weiteren Domäne (D2) in dem Probenvolumeninterface (4) passiert, wobei eine Fläche dieses Probenvolumens durch die Vektoren Höhe und Weite definiert ist, wobei diese Fläche derart ausgebildet ist, dass während sich die Höhe des Probenvolumens entlang der Strecke zu dem Eingang der wenigstens einen weiteren Domäne (D2) verringert, sich die Weite des Probenvolumens entlang der Strecke zu dem Eingang der wenigstens einen weiteren Domäne (D2) vergrößert, wobei die Fläche entlang der Strecke des Probenvolumeninterfaces (4) konstant bleibt.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Kaskaden-Free-Flow-Isotachophorese-Vorrichtungen sowie Verfahren zum Betreiben der Kaskaden-Free-Flow-Isotachophorese-Vorrichtungen.
Biomarker sind objektiv messbare biologische Eigenschaften, die zum Diagnostizieren, zum Überwachen oder für das Vorhersagen von Risiken einer Erkrankung verwendet werden können. Beispielsweise sind BRCA1-Mutationen genetische Marker für das Brustkrebs-Risiko, ein hoher Blutzuckerspiegel ist ein Anzeichen für Diabetes, die Kreatininausscheidung steht im Zusammenhang mit der Leistung der Nierenfunktion und das prostataspezifische Antigen (PSA) ist ein Protein-Biomarker für Prostatakrebs.
Mit „omics“-Ansätzen, wie der Transkriptomik, der Proteomik, der Glykomik und der Metabolomik, stieg die Zahl der bekannten Biomarker exponentiell. Ein entscheidender Aspekt bei der Verwendung dieser Biomarker zur Behandlungsinformation ist die Entwicklung von Analyseverfahren, die die Vielzahl der physikalisch-chemischen Eigenschaften und den Dynamikbereich in Plasma und Urin bewältigen können.
Für den Nachweis von Malaria mittels fluoreszenzmarkierten Parasiten in roten Blutkörperchen wurde für PDMS-Mikrokanäle mit gleicher Querschnittsfläche und gleicher Kanallänge gezeigt, dass durch eine Reduzierung der Kanaltiefe ein stabilerer elektroosmotischer Fluß erreicht werden kann [DUONG, T.N.T.; CHEANG, H. N.; GHISTA, D.N.; LIUA. Q.: „Stable and High-Volume Eiectroosmotic Transport for Microfluidic Chip". In: NanoSingapore 2006:IEEE Conference on Emerging Technologies - Nanoelectronics - Proceedings, Singapore 10-13 Jan. 2006; S. 237-240; ISBN 978-0-7803-9357-8; DOI:10.1109/NANOEL.2006.1609720; XP010911159]. Für eine automatisierte Vorrichtung, mittels Kapillarverdrängungselektrophorese in kurzen geschlossenen Kapillaren mit ungleichmäßigem Querschnitt, wurde gezeigt, dass der ungleichmäßige Querschnitt zu einer Reduzierung der benötigten Gesamtspannung führte [Stastna M; Kahle V; Slais K: „Automated instrumentation for miniaturized displacement electrophoresis with on-column photometric detection". In: Journal of Chromatography A, 730 (1996) 261-272. DO|:10.1016/0021-9673(95)01164-1; XP004039237]
Da viele Biomarker von Interesse in geringer Konzentration vorhanden sind, im Vergleich zu dem stärker konzentrierten und komplexen chemischen Hintergrund, muss die Konzentration der Biomarker von Interesse selektiv angehoben werden, damit sie ohne Störungen nachgewiesen werden kann.
Isotachophorese (ITP) ist eine leistungsfähige Technik, die gleichzeitig Zielanalyte konzentriert und Störungen beseitigt. Ein ITP-System besteht aus verschiedenen Elektrolyten, wobei die Co-Ionen auf der Basis der elektrophoretischen Mobilität in Beziehung zu dem Target ausgewählt werden. Das Co-Ion in dem Führungselektrolyten (LE) hat eine höhere Mobilität als die der Zielanalyten, während das Co-Ion in dem Beendigungselektrolyten (TE) eine geringere Mobilität als die der Zielanalyten aufweist. Wenn das ITP-System etabliert ist, ordnen sich die Ionen nach ihrer Mobilität gemäß der Kohlrausch-Regelfunktion an, wobei die analytischen Zielanylyten bzw. das Zielanalyt zwischen dem LE und TE positioniert werden/wird.
Es wurden Versuche durchgeführt, um die Nachweisgrenze von ITP zu verringern, wobei die Verwendung von (i) selektiven und empfindlichen Detektoren, (ii) geringen Konzentrationen des Führungselektrolyten, (iii) kleineren Detektionszellen und (iv) erhöhtem Probenvolumen verwendet wurden.
Die Verwendung von erhöhtem Probenvolumen erscheint wegen seiner Universalität und Flexibilität am Vielversprechendsten zu sein, vorausgesetzt interferierende Massebestandteile werden entfernt, anstatt mit den Zielmolekülen konzentriert zu werden.
Ein effektiver Weg das Injektionsvolumen zu erhöhen ist es die Kanallänge zu verlängern, wobei mittels Serpentinenkanälen gezeigt wurde, dass die Kanallänge erhöht wird, ohne dass die Gesamtchipabmessung zunimmt [Paschkewitz, J. S., Molho, J. I., Xu, H., Bharadwaj, R., Park, C. C., Electrophoresis 2007, 28, 4561-4571. Kasicka, V., Prusik, Z., Gas, B., Stedry,M., Electrophoresis 1995, 16, 2034-2038. Harrison, S. L. M., Chemical Engineering, Washington State University, Pullman 2007, p. 69 oder US 2011 / 0 297 546 A1 ].
Eine Erhöhung der Kanallänge hat jedoch Einschränkungen hinsichtlich des Ausgleichs zwischen der Analysezeit und der Joule-Erwärmung. Daher wurden hydrodynamische oder elektroosmotische Gegenströme verwendet, um wirksam die Kanallänge zu erhöhen, ohne dessen physikalische Abmessungen zu ändern [Everaerts, F. M., Vacik, J., J. Chromatogr. A 1970, 49,262-268, S.C. Phung, Y.H. Nai, M. Macka, S.M. Powell, R.M. Guijt and M.C. Breadmore, Counter-pressure-assisted itp with electrokinetic injection under field-amplified conditions for bacterial analysis, Analytical and Bioanalytical Chemistry (2015)]. Das parabolische Strömungsprofil kann jedoch die Peakform verzerren und die Auflösung verringern [Breadmore, M. C., Electrophoresis 2008, 29, 1082-1091. , Review Microfluidic isotachophoresis: A review Petr SmejkallDanny Bottenus2 Michael C. Breadmore1 Rosanne M. Guijt, Cornelius F. Ivor, Frantisek Foret, Mirek Macka].
Eine elegantere Methode zur Erhöhung des Konzentrationsfaktors ist es die Querschnittsfläche an dem Einspritzende zu erhöhen. Dieses Konzept wurde durch Simulation in 3D und auch in 1D [Bahga, S. S., Kaigala, G. V, Bercovici, M., Santiago, J.G., Electrophoresis 2011, 32, 563-572. Breadmore,M. C., Electrophoresis 2008, 29, 1082-1091] gezeigt, für eine DLD(deterministic lateral displacement)-Vorrichtung in der WO 2014 / 145 075 A9 offenbart sowie versuchsweise durch die Verwendung eines Kaskaden-µ-ITP-Chips gezeigt, wobei von einer Zunahme des Konzentrationsfaktors um 10,000 berichtet wurde [Bottenus, D., Jubery, T. Z., Ouyang, Y. X., Dong, W. J.,Dutta, P., Ivory, C. F., Lab. Chip. 2011, 11, 890-898.].
Free-Flow-Elektrophorese (FFE) ist eine elektrophoretische Trenntechnik, bei der ein elektrisches Feld senkrecht zur Strömungsrichtung angelegt wird, um ein kontinuierliches Trennsystem zu erhalten. Analog zu der Terminologie, die in der Kapillarelektrophorese verwendet wird, ist FFITP die Betriebsart der FFE, bei der ein diskontinuierliches Puffersystem, bestehend aus einem LE und TE, durch die Trennkammer fließt [Kohlheyer, D., Eijkel, J. C. T., van den Berg, A., Schasfoort, R. B. M., Electrophoresis 2008, 29,977-993. T. K. Khurana and J. G. Santiago, Anal. Chem., 2008, 80,6300-6307.25. D. Janasek, M. Schilling, J. Franzke and A. Manz, Anal. Chem., 2006, 78, 3815-3819.]. FFITP ist besonders attraktiv, da sie eine kontinuierliche Trennung kombiniert mit einer selektiven Konzentration der Analyten liefert.
Es wäre daher von großem Nutzen, wenn es Vorrichtungen und Verfahren zum Betreiben der Vorrichtungen gäbe, die ohne die oben erwähnten Nachteile die Erhöhung einer Konzentration in einem Probenvolumen bis hin zur Erfassungsmessstelle ermöglichen.
Daher schlagen wir eine Kaskaden FFITP Vorrichtung vor, die effektiv die Empfindlichkeit erhöht, indem das Probenvolumen erhöht wird, was einen kontinuierlichen hohen Konzentrationsfaktor im Vergleich zu allen anderen existierenden Systemen ermöglicht.
FFITP ist besonders attraktiv, da sie eine kontinuierliche Trennung kombiniert mit einer selektiven Konzentration der Analyten liefert.
Daher ist es die Aufgabe der Erfindung, solche Vorrichtungen und Verfahren zum Betreiben der Vorrichtungen bereitzustellen.
Unter Bezugnahme auf Anspruch 1 wird die Aufgabe durch eine Kaskaden-Free-Flow-Isotachophorese (FFITP)-Vorrichtung gelöst, welche mindestens zwei kaskadierende Domänen umfasst, eine erste Domäne und die wenigstens eine weitere Domäne. Die erste Domäne und wenigstens eine weitere Domäne umfassen jeweils mindestens drei Eingänge, eine Separationskammer, auf welche ein elektromagnetisches Feld (z.B. elektrische Spannung, ein Magnetfeld oder ein elektromagnetisches Feld) anwendbar ist, und zwei oder mehr Ausgänge.
Es ist vorgesehen, dass die Höhe des Probenvolumens in der Separationskammer der ersten Domäne größer ist als die Höhe des Probenvolumens in der Separationskammer der wenigstens einen weiteren Domäne.
Dies ist vorteilhaft, da es nicht möglich ist die Probe über den originären Eingang zu konzentrieren. Dennoch, wenn die oben beschriebene Vorrichtung verwendet wird, kann eine größere Einsatzmenge des Probenvolumens bzw. der Probenmenge in die (erste Domäne der) Vorrichtung injiziert werden, welche dann weiter konzentriert werden kann.
Es ist ebenfalls im Rahmen der Erfindung vorgesehen, dass zumindest einer der Ausgänge der ersten Domäne über ein Probenvolumeninterface mit einem der Eingänge der wenigstens einen weiteren Domäne verbunden ist. Da jede Domäne zumindest drei Eingänge und zwei oder mehr Ausgänge aufweist, ist jede Kombination von Eingängen und Ausgängen - verbunden durch ein Probenvolumeninterface - möglich. Eine bevorzugte Ausgestaltung für eine Vorrichtung mit zwei Domänen sieht vor, dass die erste Domäne einen zentralen Ausgang aufweist, der über ein Probenvolumeninterface mit einem zentralen Eingang der wenigstens einen weiteren Domäne verbunden ist. Für eine andere Ausgestaltung ist ebenso vorstellbar, dass zwei oder mehr Probenvolumeninterfaces an dem zentralen Ausgang der ersten Domäne angeschlossen sind. Daher können dann zwei oder mehrere Domänen mit der ersten Domäne verbunden werden. Für eine weitere Ausgestaltung ist auch vorstellbar, dass die erste Domäne einen zentralen Ausgang aufweist, der mit einem Probenvolumeninterface verbunden ist, welches zwei oder mehr Kanäle aufweist, wobei alle Kanäle mit einem zentralen Eingang der zumindest einen weiteren Domäne verbunden sind. Der zentrale Eingang der wenigstens einen weiteren Domäne ist für alle Ausgestaltungen weiter als die Weite des zentralen Ausgangs der ersten Domäne. Weiterhin ist die Höhe des zentralen Eingangs der wenigstens einen weiteren Domäne kleiner als die Höhe des Ausgangs der ersten Domäne.
Das Probenvolumen in dem Probenvolumeninterface ist durch drei Vektoren definiert ist, nämlich durch die Höhe des Probenvolumens in dem Probenvolumeninterface, der Weite des Probenvolumens in dem Probenvolumeninterface und der Strecke, die das Probenvolumen zwischen der ersten Domäne und der wenigstens einen weiteren Domäne in dem Probenvolumeninterface zurücklegt. Dementsprechend kann eine Fläche dieses Probenvolumens durch die Vektoren Höhe und Weite definiert werden.
Es ist weiterhin im Rahmen der Erfindung vorgesehen, dass diese Fläche derart ausgebildet ist, dass während sich die Höhe des Probenvolumens entlang der Strecke zu dem Eingang der wenigstens einen weiteren Domäne verringert, sich die Weite des Probenvolumens entlang der Strecke zu dem Eingang der wenigstens einen weiteren Domäne vergrößert, wobei die Fläche entlang der Strecke des Probenvolumeninterfaces im Wesentlichen konstant bleibt.
Die Biomarker von Interesse oder andere Proben, die in dem Probenvolumen vorhanden sind, werden daher in der ersten Domäne durch ein elektromagnetisches Feld konzentriert. Die konzentrierte Probe, welche nur ein Bruchteil des Probenvolumens ist, welches in die erste Domäne eingebracht wurde, fließt daraufhin in das Probenvolumeninterface, wo die Höhe und die Weite derart ausgebildet sind, dass sich die Höhe verringert und sich die Weite verbreitert, während die Flussrate in dem Probenvolumeninterface im Wesentlichen konstant bleibt. Daher fließt eine konzentrierte Probe in die zweite Domäne, welche eine reduzierte Höhe und eine erweiterte Breite aufweist, wo sie dann erneut durch ein elektromagnetisches Feld konzentriert werden kann.
Unter Bezugnahme auf Anspruch 2 kann die Aufgabe weiterhin durch eine Kaskaden-Free-Flow-Isotachophorese (FFITP)-Vorrichtung gelöst werden, welche mindestens eine kaskadierende Domäne umfasst, wobei die wenigstens eine Domäne mindestens drei Eingänge, eine Separationskammer, auf welche ein elektromagnetisches Feld (z.B. elektrische Spannung, ein Magnetfeld oder ein elektromagnetisches Feld) anwendbar ist, und zwei oder mehr Ausgänge.
Das Probenvolumen der wenigstens einen Domäne ist durch drei Vektoren definiert, nämlich durch die Höhe des Probenvolumens in der Domäne, die Weite des Probenvolumens in der Domäne und der Strecke, die das Probenvolumen zwischen einem der Eingänge der Domäne und einem der Ausgänge der Domäne zurücklegt.
Daher kann eine Fläche dieses Probenvolumens durch die Vektoren Höhe und Weite definiert werden, wobei diese Fläche derart ausgebildet ist, dass während sich die Höhe des Probenvolumens entlang der Strecke zu einem der Ausgänge der Domäne verringert, sich die Weite des Probenvolumens entlang der Strecke zu einem der Ausgänge der Domäne vergrößert.
Es ist weiterhin vorgesehen, dass in dieser Domäne die Fläche entlang der Strecke zwischen einem der Eingänge und einem der Ausgänge im Wesentlichen konstant bleibt.
Die Biomarker von Interesse oder andere Proben, die in dem Probenvolumen vorhanden sind, werden daher in der ersten Domäne durch ein elektromagnetisches Feld konzentriert, wobei zugleich die Höhe und die Weite des Probenvolumens derart verändert werden, so dass sich die Höhe verringert und sich die Weite verbreitert. Es ist zu der Erfindung gehörig, dass das elektromagnetische Feld nur auf einen Teilbereich der wenigstens einen Domäne angewendet werden kann, beispielsweise der obere Bereich, in dem das Probenvolumen eingespeist wird.
In jedem Fall kann ein konzentriertes Probenvolumen mit einer reduzierten Höhe und einer erweiterten Breite an einem der Ausgänge gesammelt werden.
Dieser Ausgang kann direkt mit einer weiteren Domäne verbunden sein, welche im Vergleich zu der Eingangshöhe und Weite der wenigstens einen Domäne eine reduzierte Höhe und eine größere Weite aufweist, in der das Probenvolumen mit dem Probe von Interesse erneut durch ein elektromagnetisches Feld konzentriert werden kann. Es ist ebenfalls zu der Erfindung gehörig, dass der Ausgang der wenigstens einen Domäne mit einem oder mehreren wie oben beschriebenen Probenvolumeninterfaces verbunden ist oder mit einem oder mehreren Probenvolumeninterfaces verbunden ist, welche nur den Fluss zu einer anderen Domäne oder Vorrichtung zulassen, ohne dass das Probenvolumen eine Änderung der Höhe oder Weite erfährt.
Gemäß Anspruch 3 ist es für beide Vorrichtungen vorgesehen, dass jede Domäne mit zwei Seitenkammern ausgestattet ist, auf welche ein elektromagnetisches Feld anwendbar ist.
Dies ist vorteilhaft, da die Seitenkammern von der Hauptkammer separiert sind, wodurch verhindert wird das Gasblasen, welche durch die Anwendung eines elektromagnetischen Feldes generiert werden, in die Hauptkammer eindringen sowie eine potentiell auftretende pH-Veränderung in der Separationskammer reduziert wird.
Es ist weiterhin vorgesehen, dass die Flussrate in dem Probenvolumen und/oder dem Probenvolumeninterface konstant ist.
Dies ist beispielsweise für kontinuierliche oder Hochdurchsatzanwendungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung von Vorteil.
Für die Kaskaden-FFITP-Vorrichtung gemäß Anspruch 1 ist vorstellbar, dass die Höheverringerung des Probenvolumens in dem Probenvolumeninterface entlang der Strecke zu dem Eingang der wenigstens einen weiteren Domäne durch eine zusätzlich angewendete Laminarströmung erreicht wird.
Die zusätzliche Laminarströmung kann durch einen zusätzlichen Eingang an dem unteren Ende (Oberseite) und/oder an der oberen Seite (Oberseite) des Interfaces erreicht werden.
Durch die Anwendung einer zusätzlichen Laminarströmung auf die Proben in dem Probenvolumeninterface wird erreicht, dass die Proben von Interesse vertikal konzentriert werden (beispielsweise durch die Laminarströmung, die durch einen zusätzlichen Eingang, der an der Oberseite angeordneten ist, appliziert wird). Dies ist vorteilhaft, da die vertikale Konzentrierung in dem Probenvolumeninterface eine weitere Konzentrierung der Probe bewirkt. Zusätzlich benötigt die wenigstens der Domäne der Vorrichtung keine inneren geometrischen Veränderungen. Dies ist insbesondere in dem Fall von Interesse, wenn die weiteren (beispielsweise die zweiten) Domänen in der Höhe nicht reduzierbar sind (das Limit wird erreicht).
Für die Kaskaden-FFITP-Vorrichtung gemäß Anspruch 1 ist weiterhin vorstellbar, dass die Innenmaße des Probenvolumeninterfaces , durch welches das Probenvolumen passiert, durch drei Vektoren definiert ist, nämlich die Höhe des Innenprobenvolumeninterfaces, die Weite des Innenprobenvolumeninterfaces und die Länge des Probenvolumeninterfaces von dem Ausgang von der ersten Domäne zu dem Eingang der wenigstens einen weiteren Domäne, wobei sich die Höhe der Innenmaße des Probenvolumeninterfaces hin zu dem Eingang der wenigstens einen weiteren Domänen verringert und sich die Weite der Innenmaße des Probenvolumeninterfaces hin zu dem Eingang der wenigstens einen weiteren Domänen vergrößert, wobei die Fläche, die durch die Vektoren Höhe und Weite definiert ist entlang der Länge der Innenmaße des Probenvolumeninterfaces im Wesentlichen konstant bleibt.
Dementsprechend werden die Weite und die Höhe des Probenvolumens über die Länge/Strecke des Probenvolumeninterfaces durch die Änderungen der inneren Geometrie des Probenvolumeninterfaces geändert.
Für die Kaskaden-FFITP-Vorrichtung gemäß Anspruch 2 ist im Rahmen der Erfindung vorgesehen, dass zumindest einer der Ausgänge der wenigstens einen Domäne über ein Probenvolumeninterface mit einem der Eingänge der wenigstens einen weiteren Domäne verbunden ist.
Da alle Domänen wenigstens drei Eingänge und zwei oder mehr Ausgänge umfassen, sind jegliche Kombinationen von Eingängen und Ausgängen - verbunden durch einen Probenvolumeninterface - möglich. Eine bevorzugte Ausgestaltung für eine Vorrichtung mit zwei Domänen sieht vor, dass die erste Domäne einen zentralen Ausgang aufweist, der über ein Probenvolumeninterface mit einem zentralen Eingang der wenigstens einen weiteren Domäne verbunden ist. Für eine andere Ausgestaltung ist ebenso vorstellbar, dass zwei oder mehr Probenvolumeninterfaces an dem zentralen Ausgang der ersten Domäne angeschlossen sind. Daher können zwei oder mehr zweite Domänen mit der ersten Domäne verbunden werden.
Das Probenvolumen in dem Probenvolumeninterface wird, wie zuvor, durch die drei Vektoren definiert, nämlich durch die Höhe des Probenvolumens in dem Probenvolumeninterface, der Weite des Probenvolumens in dem Probenvolumeninterface und der Strecke, die das Probenvolumen zwischen der ersten Domäne und der wenigstens einen weiteren Domäne in dem Probenvolumeninterface zurücklegt. Dementsprechend kann eine Fläche dieses Probenvolumens durch die Vektoren Höhe und Weite definiert werden.
Es ist weiterhin im Rahmen der Erfindung vorgesehen, dass diese Fläche derart ausgebildet ist, dass während sich die Höhe des Probenvolumens entlang der Strecke zu dem Eingang der wenigstens einen weiteren der Domäne verringert, sich die Weite des Probenvolumens entlang der Strecke zu dem Eingang der wenigstens einen weiteren der Domäne vergrößert, wobei die Fläche entlang der Strecke des Probenvolumeninterfaces im Wesentlichen konstant bleibt.
Für die Kaskaden-FFITP-Vorrichtung gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 7 ist im Rahmen der Erfindung weiterhin vorgesehen, dass in dem Probenvolumeninterface ein elektromagnetisches Feld auf das Probenvolumen anwendbar ist, wodurch die Höhe der Proben in dem Probenvolumen in dem Probenvolumeninterface in Richtung des Eingangs der wenigstens einen weiteren Domäne abnimmt.
Durch die Anwendung eines rechtwinklig angewendeten elektromagnetischen Feldes (nämlich von der Oberseite zu der Unterseite) - verglichen mit dem zuvor beschriebenen elektromagnetischen Feldern, welche eine horizontale Konzentration in der Kammer bewirken - auf die Proben in dem Probenvolumeninterface bewirkt eine vertikale Konzentrierung der Proben von Interesse. Die ist vorteilhaft, da die Oberseite-zu-Unterseite-Konzentrierung in dem Probenvolumeninterface eine zusätzliche Konzentrierung der Proben bewirkt. Zusätzlich muss die innere Geometrie der wenigstens einen Domäne der Vorrichtung nicht verändert werden. Dies ist insbesondere in dem Fall von Interesse, wenn die weiteren (zweiten) Domänen nicht in der Höhe reduzierbar sind (das Limit ist erreicht).
Für die Kaskaden-FFITP-Vorrichtung gemäß Anspruch 1, 2 oder einem der Ansprüche 7 oder 8 ist vorstellbar, dass einer der freien Ausgänge der ersten Domäne oder der wenigstens einen weiteren Domäne mit einer Detektionsvorrichtung verbunden ist.
Die Detektionsvorrichtung kann eine Vorrichtung zur Kernspinresonanz (NMR)-Spektroskopie, Massenspektroskopie (MS), ein beliebiges anderes Spektrometer (z. B. optisch, magnetisch, Flugzeit), ein Biosensor oder jede andere Detektionsvorrichtung sein. Weiterhin ist es vorstellbar, dass die Detektionseinrichtung eine vorgeschaltete Trenneinrichtung aufweist. Dies ist vorteilhaft für z.B. kontinuierliche Anwendungen oder Hochdurchsatzanwendungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Es ist weiterhin im Rahmen der Kaskaden-FFITP-Vorrichtung gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2 vorgesehen, dass bei jeder Domäne ein Führungselektrolyt (LE) zu einem der mindestens drei Eingänge, ein Probenvolumen zu einem anderen der mindestens drei Eingänge und ein Beendigungselektrolyt (TE) zu einem anderen der mindestens drei Eingänge applizierbar ist.
Die Aufgabe der Erfindung wird weiterhin durch ein Verfahren für die Konzentrierung von Proben unter Verwendung der Kaskaden-Free-Flow-Isotachophorese (FFITP)-Vorrichtung gemäß Anspruch 1 gelöst, welches die Schritte umfasst:

- Applizieren von einem Führungselektrolyt (LE) und einem Beendigungselektrolyt (TE) zu den wenigstens zwei Domänen, wobei sowohl der Führungselektrolyt (LE) als auch der Beendigungselektrolyt (TE) jeweils an einem der mindestens drei Eingänge der ersten Domäne appliziert werden,
- Applizieren des Probenvolumens in einen der mindestens drei Eingänge der ersten Domäne,
- Einstellen der Durchflussraten des Führungselektrolyten (LE), des Beendigungselektrolyten (TE) und des Probenvolumens,
- Anlegen eines elektromagnetischen Feldes, um die Separation zu erreichen,
- Entnahme des Probenvolumens an dem wenigstens einen der zwei oder mehr Ausgänge der zweiten Domäne.

Es ist hierbei im Rahmen der Erfindung vorgesehen, dass die Flussrate des Führungselektrolyten (LE) und des Beendigungselektrolyten (TE) in der ersten Domäne höher ist als die Flussrate des Führungselektrolyten (LE) und des Beendigungselektrolyten (TE) in der mindestens einen weiteren Domäne.
Es ist hierbei im Rahmen der Erfindung ebenfalls vorgesehen, dass elektromagnetische Feld (z.B. elektrische Spannung, ein Magnetfeld oder ein elektromagnetisches Feld), welches auf die Separationskammer der ersten Domäne angewendet wird, niedriger ist als das elektromagnetische Feld, welches auf die Separationskammer der mindestens einen weiteren Domäne angewendet wird.
Dies ist vorteilhaft, da der Konzentrationsfaktor eine proportionale Beziehung zu dem elektromagnetischen Feld aufweist. Die Bereitstellung eines hohen elektromagnetischen Feldes auf die Flüssigkeit, die mit einem hohen Volumen vorliegt, führt zu Joule-Erwärmungsproblemen aufgrund der hohen Leitfähigkeit. Um dieses Problem zu vermeiden, ist vorgesehen, dass in dem ersten Bereich ein schwaches elektromagnetisches Feld angelegt wird und die Feldstärke in der wenigstens einen weiteren Domäne erhöht ist.
Für die Kaskaden-Free-Flow-Isotachophorese (FFITP)-Vorrichtung gemäß Anspruch 2 wird die Aufgabe weiterhin durch ein Verfahren gelöst, welches die Schritte umfasst:

- Applizieren von einem Führungselektrolyt (LE) und einem Beendigungselektrolyt (TE) zu der wenigstens einen Domäne, wobei sowohl der Führungselektrolyt (LE) als auch der Beendigungselektrolyt (TE) jeweils an einem der mindestens drei Eingänge der Domäne appliziert werden,
- Applizieren des Probenvolumens in einen der mindestens drei Eingänge der mindestens einen Domäne,
- Einstellen der Durchflussraten des Führungselektrolyten, des Beendigungselektrolyten (TE) und des Probenvolumens,
- Anlegen eines elektromagnetischen Feldes, um die Separation zu erreichen,
- Entnahme des Probenvolumens an dem wenigstens einen der zwei oder mehr Ausgänge der mindestens einen Domäne.

Die obigen und weitere Merkmale, Einzelheiten und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch eine detaillierte Beschreibung einer beispielhaften Ausführungsform unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert, in denen:

1 eine schematische Kaskaden-Free-Flow-Isotachophorese (FFITP)-Vorrichtung mit zwei Domänen, welche durch ein Probenvolumeninterface verbunden sind, in Draufsicht zeigt,
2 eine Kaskaden-Free-Flow-Isotachophorese (FFITP)-Vorrichtung mit zwei Domänen, welche durch ein Probenvolumeninterface verbunden sind, in Draufsicht zeigt,
3a & b das schematische Funktionsprinzip für das Probenvolumen in perspektivischer Ansicht zeigen,
4 das schematische Funktionsprinzip für das Probenvolumeninterface in perspektivischer Ansicht zeigt.

In 1 ist schematisch eine Kaskaden-Free-Flow-Isotachophorese (FFITP)-Vorrichtung mit zwei Domänen (D1, D2), welche über ein Probenvolumeninterface (4) miteinander verbunden sind, in Draufsicht dargestellt. Auf beide Domänen (D1, D2) wird ein elektrisches Feld (1; dargestellt durch den horizontalen Pfeil), ein Probenvolumen (2) und LE und TE angewendet. Der Fluss von LE, TE und dem Probenvolumen (2) in den beiden Domänen ist druckgetrieben (3; dargestellt durch den vertikalen Pfeil). Durch die Verwendung des elektrischen Feldes (1) wird erreicht, dass die Proben (2), welche durch ein einen zentral lokalisierten Eingang der ersten Domäne (D1) eingebracht werden, horizontal über die Distanz von dem Eingang zu dem Ausgang der ersten Domäne (D1) konzentriert werden. Die Höhe des Probenvolumens in der ersten Domäne (D1) bleibt für diese Ausführungsform konstant. Der Ausgang der ersten Domäne (D1) hat daher die Höhe des Eingangs der ersten Domäne (D1), jedoch eine viel kleinere Weite. In dem Probenvolumeninterface (4) verringert sich die Höhe des Probenvolumens (2) entlang der Strecke zu dem Eingang der zweiten Domäne (D2) und die Weite des Probenvolumens (2) erhöht sich entlang der Strecke zu dem Eingang der zweiten Domäne (D2), wobei die Fläche (definiert durch die Weite und die Höhe) im Wesentlichen entlang der Strecke des Probenvolumeninterfaces (4) konstant bleibt. Der Eingang der zweiten Domäne (D2), welcher, wie dargestellt, ein mittig angeordneter Eingang ist, weist eine Höhe und Weite auf, welche der Höhe und Weite des Ausgangs des Probenvolumeninterfaces (4) entspricht. Auf die zweite Domäne (D2) ist ein elektrisches Feld (1) anwendbar. Durch die Verwendung des elektrischen Feldes (1) wird erreicht, dass die Proben (2), welche durch einen Mitteleingang der zweiten Domäne (D2) eingebracht wurden, über die Strecke von dem Eingang zu dem Ausgang der zweiten Domäne (D2) horizontal konzentriert werden. Damit wird eine zweite Konzentrierung erreicht.
In 2 ist eine Kaskaden-Free-Flow-Isotachophorese (FFITP)-Vorrichtung mit zwei Domänen (D1, D2), welche über ein Probenvolumeninterface miteinander verbunden sind, in Draufsicht dargestellt. Kurz dargestellt umfasst die erste Domäne (D1) drei Eingänge, eine Separations-(Haupt-)Kammer mit einer Größe von ungefähr 4 mm × 6 mm, zwei Seitenkammern für die Verbindung der Elektroden und drei Ausgänge. Die zweite Domäne (D2) der Vorrichtung hat auch 5 Eingänge, eine Separations-(Haupt-)Kammer mit einer Größe von ungefähr 10 mm × 10 mm, zwei Seitenkammern für die Verbindung der Elektroden und fünf Ausgänge. Das (Probenvolumen-) Interface von der ersten Domäne und der zweiten Domäne wird durch direkte Verbindung erreicht, wobei der mittlere/zentrale Ausgang der ersten Domäne mit einer Weite von ungefähr 30 µm und einer Höhe von ungefähr 50 µm direkt mit der zweiten Domäne verbunden ist. Damit das Volumen konstant bleibt weist der mittlere/zentrale Eingang der zweiten Domäne ungefähr eine Kanalweite von 300 µm und eine Höhe von ungefähr 5 µm auf.
Um die dreidimensionale Höhenveränderung in der Vorrichtung (Chip) zu erreichen, müssen zwei verschiedene Verfahren durchgeführt werden, welche dann miteinander verbunden werden. Um eine Strukturtiefe von beispielsweise 5 µm zu erhalten kann Glas-Ätzung mit einer HF (25%) / HCl (2,5%) / DI-Mischung durchgeführt werden. Permix kann z.B. für die 50 µm Struktur verwendet werden, da der Mittelausgang der ersten Domäne eine Kanalbreite von ungefähr 30 µm und einer Kanalhöhe von ungefähr 50 µm benötigt. Das Startsubstrat ist z.B. ein 500 µm Borosilikatglaswafer. Nach der Reinigung in HNO₃ und einer Schnellabspülung in deionisiertem (DI) Wasser wurde das Permix50µm auf den Glaswafer bei 78 ° C laminiert (Laminator DH360). Daraufhin wurde der Wafer für 300 s bei 90 °C gebacken. Die Lage von den Kanälen kann durch optische Lithographie unter Verwendung von z.B. einem OLIN Oir 907-17 Negativ-Photoresist definiert werden, welche anschließend mit z.B. einem MR Dev 600 (PGMEA) entwickelt werden. Die Kanäle werden durch Verbinden der beiden Wafer unter Verwendung eines 60 sec Hochdruckvorverfestigungsschrittes in einem EV620-Maskenausraster bei 340 °C und einer einstündigen Nachverbrennung in einem Ofen bei 600-650 ° C unter atmosphärischen Bedingungen definiert. Der Chip wird auf beiden Seiten durch laminierte Folien geschützt und in einzelne Vorrichtungen durch z.B. eine NL-CLR- Disco DAD Diamantsäge geschnitten.
3A und 3B zeigen das schematische Betriebsprinzip und die geometrische Wirkung für das Probenvolumeninterface in perspektivischer Ansicht. Die Konzentration ist definiert als eine Menge, gemessen in g oder mol pro Volumen. In Peak-Modus ITP ist die Konzentration (C) die absolute Menge des Analyten in mol (M) in dem Peakvolumen, definiert durch die Peakweite (w) und die Kanalquerschnittsfläche (A) [Lab Chip. 2011 Nov 21;11(22):3793-801. doi: 10.1039/c1lc20469f. Epub 2011 Sep 21. Preconcentration and detection of the phosphorylated forms of cardiac troponin I in a cascade microchip by cationic isotachophoresis]. $C_{i} = \frac{M_{i}}{W_{i} \times A}$
Die Kaskaden-FFITP ermöglicht eine effektive Erhöhung der Empfindlichkeit durch Erhöhung des Probenvolumens. Dies wird durch eine Verringerung der Separationskammerhöhe von ungefähr 50 µm zu ungefähr 5 µm realisiert, wie in 3B dargestellt. Neben der Konzentrationszunahme durch die geometrische Veränderung ermöglicht die Kaskaden-FFITP die Verwendung eines unterschiedlichen Buffersystems in der zweiten Domäne, was eine Änderung der Selektivität oder Empfindlichkeit durch die Art und Konzentration der Elektrolyte ermöglicht. Das Kaskadendesign ermöglicht eine Erhöhung der Trennspannung in der zweiten Domäne aufgrund des erhöhten elektrischen Widerstandes und der erhöhten Wärmeableitung, was den Konzentrationsfaktor weiter erhöhen kann.
Um die Analytkonzentration am Detektionspunkt zu erhöhen, könnte man, wie gezeigt, die Probenmenge erhöhen, indem das injizierte Volumen erhöht und/oder die Querschnittsfläche vor der Detektion reduziert wird.
Bei einer Free-Flow-Vorrichtung bedeutet die Erhöhung des Probenvolumens die Erhöhung der Breite und der Höhe des Probenstroms. Dies mag eine einfache Option sein, jedoch gibt es zwei große Einschränkungen. Zuerst gibt es eine geometrische Grenze für die Breite, die durch den Herstellungsprozess eingestellt wird, in unserem Fall die Größe eines Wafers. Zweitens führt die Erhöhung der Höhe zu einer Verringerung des elektrischen Widerstands und damit zu einem höheren Strom, was zu einer Joule-Erwärmung führen kann.
Die Beziehung zwischen der effektiven Spannung und der Peakbreite ist gegeben als [PHYSICS OF FLUIDS 26, 012001 (2014) Sample distribution in peak mode isotachophoresis]:
wobei W die Peakbreite, R die Gaskonstante, T die Temperatur (K), F die Konstante von Faraday, µ_L die Mobilität von LE und µ_t die Mobilität von TE ist.
Die vorgeschlagene Kaskadenvorrichtung kombiniert eine erste tiefe Free-Flow-Kammer mit eine zweiten seichteren Kammer. In der ersten Kammer wird der Zielanalyt in eine Zone konzentriert, die eine Weite aufweist, die durch die Gl. 2 definiert ist. Die Konzentration in diesem Peak bezieht sich auf die Zonenbreite und die Kammerhöhe über einen unendlich kurzen Abschnitt. Wenn diese Zone in eine zweite flachere Vorrichtung übertragen wird, erhöht die Verringerung der Höhe die Peakbreite. In dem in der zweiten ITP-Kammer angelegten Feld stellt die Zone wieder ihre Gleichgewichtsbreite her, wodurch die Konzentration erhöht wird, da das Volumen, das die Analytmenge M enthält, effektiv reduziert wird.
Eine Verringerung der Kammerhöhe erhöht den elektrischen Widerstand $R = ρ \frac{w}{H \times L}$
und abnehmende Joule-Erwärmung, da diese umgekehrt proportional zu R ist: $(H \propto \frac{V^{2}}{R} \times t)$
Dies bedeutet, dass bei Verwendung desselben Elektrolytsystems höhere Feldstärken in der flachen Kammer verwendet werden können, was eine weitere Verringerung der Peakbreite ermöglicht (Gl. 2).
4 zeigt das schematische Betriebsprinzip des Probenvolumeninterfaces in perspektivischer Ansicht. Der Ausgang der ersten Domäne hat die Höhe (H1) des Eingangs der ersten Domäne, jedoch eine wesentlich kleinere Breite (wl). In dem Probenvolumeninterface verringert sich die Höhe des Probenvolumens über die Strecke zu dem Eingang der zweiten Domäne und die Weite des Probenvolumeninterfaces erhöht sich über die Strecke zu dem Eingang der zweiten Domäne, wobei die Fläche (definiert durch die Weite und die Höhe) im Wesentlichen konstant über die Strecke des Probenvolumeninterfaces bleibt. Der Eingang der zweiten Domäne weist eine Höhe (H2) auf, welche wesentlich kleiner ist als die Höhe (H1) des Ausgangs der ersten Domäne und eine Weite (W2), welche wesentlich Breiter ist als die Breite des Ausgangs der ersten Domäne.

Claims

Kaskaden-Free-Flow-Isotachophorese (FFITP)-Vorrichtung, umfassend mindestens zwei kaskadierende Domänen, eine erste Domäne (D1) und wenigstens eine weitere Domäne (D2), wobei die erste Domäne (D1) und die wenigstens eine weitere Domäne (D2) jeweils mindestens drei Eingänge, eine Separationskammer (6A; 6B), auf welche ein elektromagnetisches Feld (1) anwendbar ist, und zwei oder mehr Ausgänge umfassen, wobei die Höhe des Probenvolumens (2) in der Separationskammer der ersten Domäne (D1) größer ist als die Höhe des Probenvolumens (2) in der Separationskammer der wenigstens einen weiteren Domäne (D2), wobei zumindest einer der Ausgänge der ersten Domäne (D1) über ein Probenvolumeninterface (4) mit einem der Eingänge der wenigstens einen weiteren Domäne (D2) verbunden ist und wobei das Probenvolumen (2) in dem Probenvolumeninterface (4) durch drei Vektoren definiert ist, nämlich die Höhe des Probenvolumens in dem Probenvolumeninterface, die Weite des Probenvolumens in dem Probenvolumeninterface und der Strecke, die das Probenvolumen zwischen der ersten Domäne (D1) und der wenigstens einen weiteren Domäne (D2) in dem Probenvolumeninterface (4) passiert, wobei eine Fläche dieses Probenvolumens durch die Vektoren Höhe und Weite definiert ist, wobei diese Fläche derart ausgebildet ist, dass während sich die Höhe des Probenvolumens entlang der Strecke zu dem Eingang der wenigstens einen weiteren Domäne (D2) verringert, sich die Weite des Probenvolumens entlang der Strecke zu dem Eingang der wenigstens einen weiteren Domäne (D2) vergrößert, wobei die Fläche entlang der Strecke des Probenvolumeninterfaces (4) konstant bleibt.
Kaskaden-Free-Flow-Isotachophorese (FFITP)-Vorrichtung, umfassend mindestens eine kaskadierende Domäne, wobei die wenigstens eine Domäne (D1) mindestens drei Eingänge, eine Separationskammer (6A), auf welche ein elektromagnetisches Feld (1) anwendbar ist, und zwei oder mehr Ausgänge umfasst, wobei das Probenvolumen (2) der wenigstens einen Domäne (D1) durch drei Vektoren definiert ist, nämlich die Höhe des Probenvolumens in der Domäne, die Weite des Probenvolumens in der Domäne und der Strecke, die das Probenvolumen zwischen einem der Eingänge der Domäne und einem der Ausgänge der Domäne passiert, wobei eine Fläche dieses Probenvolumens durch die Vektoren Höhe und Weite definiert ist, wobei diese Fläche derart ausgebildet ist, dass während sich die Höhe des Probenvolumens entlang der Strecke zu einem der Ausgänge der Domäne (D1) verringert, sich die Weite des Probenvolumens entlang der Strecke zu einem der Ausgänge der Domäne (D1) vergrößert, wobei die Fläche entlang der Strecke zwischen einem der Eingänge und einem der Ausgänge konstant bleibt.
Kaskaden-Free-Flow-Isotachophorese (FFITP)-Vorrichtung gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass jede Domäne (D1, D2; D1) mit zwei Seitenkammern ausgestattet ist, auf welche ein elektromagnetisches Feld (1) anwendbar ist.
Kaskaden-Free-Flow-Isotachophorese (FFITP)-Vorrichtung bestehend aus zumindest zwei Domänen (D1, D2; D1, D1) gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Flussrate in dem Probenvolumen (2) und/oder dem Probenvolumeninterface (4) konstant ist.
Kaskaden-Free-Flow-Isotachophorese (FFITP)-Vorrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Höheverringerung des Probenvolumens (2) in dem Probenvolumeninterface (4) entlang der Strecke zu dem Eingang der wenigstens einen weiteren Domäne (D2) durch eine zusätzlich angewendete Laminarströmung erreicht wird.
Kaskaden-Free-Flow-Isotachophorese (FFITP)-Vorrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Innenmaße des Probenvolumeninterfaces (4), durch welches das Probenvolumen (2) passiert, durch drei Vektoren definiert ist, nämlich die Höhe des Innenprobenvolumeninterfaces, die Weite des Innenprobenvolumeninterfaces und die Länge des Probenvolumeninterfaces von dem Ausgang von der ersten Domäne (1) zu dem Eingang der wenigstens einen weiteren Domäne (D2), wobei sich die Höhe der Innenmaße des Probenvolumeninterfaces (4) hin zu dem Eingang der wenigstens einen weiteren Domänen (D2) verringert und sich die Weite der Innenmaße des Probenvolumeninterfaces (4) hin zu dem Eingang der wenigstens einen weiteren Domänen (D2) vergrößert, wobei die Fläche, die durch die Vektoren Höhe und Weite definiert ist, entlang der Länge der Innenmaße des Probenvolumeninterfaces (4) im Wesentlichen konstant bleibt.
Kaskaden-Free-Flow-Isotachophorese (FFITP)-Vorrichtung gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest einer der Ausgänge der wenigstens einen Domäne (D1) über ein Probenvolumeninterface (4) mit einem der Eingänge der wenigstens einen weiteren Domäne verbunden ist.
Kaskaden-Free-Flow-Isotachophorese (FFITP)-Vorrichtung gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Probenvolumeninterface (4) ein elektromagnetisches Feld auf das Probenvolumen (2) anwendbar ist, wodurch die Höhe des Probenvolumens (2) in dem Probenvolumeninterface (4) in Richtung des Eingangs der wenigstens einen weiteren Domäne (D2) abnimmt.
Kaskaden-Free-Flow-Isotachophorese (FFITP)-Vorrichtung gemäß Anspruch 1, 2 oder einem der Ansprüche 7 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass einer der freien Ausgänge der ersten Domäne (D1) oder der wenigstens einen weiteren Domäne (D2; D1) mit einer Detektionsvorrichtung verbunden ist.
Kaskaden-Free-Flow-Isotachophorese (FFITP)-Vorrichtung gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass bei jeder Domäne ein Führungselektrolyt (LE) zu einem der mindestens drei Eingänge, ein Probenvolumen zu einem anderen der mindestens drei Eingänge und ein Beendigungselektrolyt (TE) zu einem anderen der mindestens drei Eingänge applizierbar sind.
Verfahren für die Konzentrierung von Proben unter Verwendung der Kaskaden-Free-Flow-Isotachophorese (FFITP)-Vorrichtung gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Schritte - Applizieren von einem Führungselektrolyt (LE) und einem Beendigungselektrolyt (TE) zu den wenigstens zwei Domänen (D1, D2), wobei sowohl der Führungselektrolyt (LE) als auch der Beendigungselektrolyt (TE) jeweils an einem der mindestens drei Eingänge der ersten Domäne (D1) appliziert werden, - Applizieren des Probenvolumens in einen der mindestens drei Eingänge der ersten Domäne (D1), - Einstellen der Durchflussraten (3) des Führungselektrolyten (LE), des Beendigungselektrolyten (TE) und des Probenvolumens (2), - Anlegen eines elektromagnetischen Feldes (1), um die Separation zu erreichen, - Entnahme des Probenvolumens (2) an dem wenigstens einen der zwei oder mehr Ausgänge der zweiten Domäne (D2).
Verfahren für die Konzentrierung von Proben gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Flussraten des Führungselektrolyten (LE) und des Beendigungselektrolyten (TE) in der ersten Domäne höher ist als die Flussraten des Führungselektrolyten (LE) und des Beendigungselektrolyten (TE) in der mindestens einen weiteren Domäne (D2).
Verfahren für die Konzentrierung von Proben gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das elektromagnetische Feld (1), welches auf die Separationskammer (6A) der ersten Domäne (D1) angewendet wird, niedriger ist als das elektromagnetische Feld (2), welches auf die Separationskammer (6B) der mindestens einen weiteren Domäne (D2) angewendet wird.
Verfahren für die Konzentrierung von Proben unter Verwendung der Kaskaden-Free-Flow-Isotachophorese (FFITP)-Vorrichtung gemäß Anspruch 2, gekennzeichnet durch die Schritte - Applizieren von einem Führungselektrolyt (LE) und einem Beendigungselektrolyt (TE) zu der wenigstens einen Domäne (D1), wobei sowohl der Führungselektrolyt (LE) als auch der Beendigungselektrolyt (TE) jeweils an einem der mindestens drei Eingänge der Domäne (D1) appliziert werden, - Applizieren des Probenvolumens (2) in einen der mindestens drei Eingänge der mindestens einen Domäne (D1), - Einstellen der Durchflussraten (3) des Führungselektrolyten (LE), des Beendigungselektrolyten (TE) und des Probenvolumens (2), - Anlegen eines elektromagnetischen Feldes (1), um die Separation zu erreichen, - Entnahme des Probenvolumens (2) an dem wenigstens einen der zwei oder mehr Ausgänge der mindestens einen Domäne (D1).