JP4809983B2 - 生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置及びその方法 - Google Patents
生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置及びその方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4809983B2 JP4809983B2 JP2001037141A JP2001037141A JP4809983B2 JP 4809983 B2 JP4809983 B2 JP 4809983B2 JP 2001037141 A JP2001037141 A JP 2001037141A JP 2001037141 A JP2001037141 A JP 2001037141A JP 4809983 B2 JP4809983 B2 JP 4809983B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- biopolymer
- reaction field
- recovery
- detecting
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
- G01N33/5438—Electrodes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
- B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
- B01L2300/0645—Electrodes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
- B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
- B01L2300/0816—Cards, e.g. flat sample carriers usually with flow in two horizontal directions
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
- B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
- B01L2300/0864—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices comprising only one inlet and multiple receiving wells, e.g. for separation, splitting
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、 生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置、及びその方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生体内の反応の多くは、生体高分子特に蛋白質とその蛋白質と特異的に結合する化合物（リガンドという）との結合により開始される。
ヒトの遺伝子配列が決定され、個々の遺伝子の機能つまりはその遺伝子の生産する蛋白質の機能を解明することが求められている昨今、生体高分子とリガンドの結合を検出する技術は益々重要となる。また、蛋白質とリガンドの結合は極めて特異性が高いため、臨床診断分析や環境分析など多くの分野で分析技術としても活用されている。そのため従来から、蛋白質とリガンドの結合を検出するための多くの技術が開発されてきた。
【０００３】
例えば、既知のリガンドを放射性同位元素・酵素や蛍光化合物で標識するラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ／ＥＬＩＳＡ）や蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）等の標識イムノアッセイ法がよく知られている（例えば、ぶんせき,1999年, ページ839〜843）。この技術は抗体と抗原の分離方法などによっていくつかのグループに分けられるが、基本は種々の既知の抗原または抗体を放射性同位元素・酵素や蛍光化合物で標識し、目的の抗原や抗体との結合を検出することである。最近では、特に酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ／ＥＬＩＳＡ）や蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）は最もよく使われている。
【０００４】
近年表面プラズモン共鳴現象に基づく方法（ＳＰＲセンサ）が開発されている（ぶんせき、1997年, ページ362〜368 ）。この方法は、ガラス基板上に設けた金属薄膜の近傍での濃度変化があれば、それが屈折率に反映し、反射光強度を減少させる入射角が変化する、という現象に基づいている。実際には、結合を見ようとする化合物の一方をデキストランなどを介して金薄膜に固定し、他の化合物を含む試料溶液を流し、入射角の変化を検出する。
また、生体高分子を弾性体としてとらえ、微小なフィルムを用いリガンドとの結合による高次構造の変化に基づく張力の変化から結合を検出する、メカノケミカル法も開発されている（Anal.Biochem. 201, ページ68〜79, 1992年）。
【０００５】
一方、固相と溶相が直接接している界面において、溶液中の電解質の固体表面への吸着等により界面において正負の電荷の分離つまり界面分極がおこり、界面電気二重層が生じる。この界面電気二重層により生じる流動電位またはゼータ電位は、固体表面の状態を示すため、高分子膜・繊維・各種粒子など多くの分野で種々の目的に応用されている。この流動電位またはゼータ電位は、生体高分子とリガンドとの結合によっても変化することが知られている（Biosensors 2, ページ89〜100, 1986年）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
蛋白質とリガンドとの相互作用を検出するために、前述のように多くの方法が開発されている。しかし、現在機能が不明な蛋白質を解明しそれらの結果を実際の種々の目的に応用していくためには、一度に多数の蛋白質とそれらへのリガンドの結合を検出できる技術が求められている。
この場合、機能未知の蛋白質は勿論、リガンドが分かっている蛋白質でも、その既知のリガンドを酵素や蛍光化合物により標識する事を必要としない方法が望ましい。リガンドの入手が容易でなかったり、標識化合物を結合させること自体が困難であったり、その標識により活性が阻害される場合も多いからである。このような視点から上述の技術を見ると種々の問題点がある。
【０００７】
酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ／ＥＬＩＳＡ）や蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）等の標識イムノアッセイ法は、既知のリガンドや標識化合物が必要であるため、機能未知の蛋白質には適用できない。
ＳＰＲセンサは既知のリガンドや標識化合物を必要としないが、現時点では比較的大きな分子間の結合検出が中心であり、低分子量は最適の条件でも数百ダルトンが限界といわれている。これは、機能未知の蛋白質に適用する時には大きな限界となる。
メカノケミカル法は、ＳＰＲセンサと同様に既知のリガンドや標識化合物を必要とせず、かつ低分子量化合物にも適用できる（蛋白質とＣａやＭｇとの結合の検出が可能という報告がされて いる）という大きな利点を持つが、同時に多数の蛋白質とリガンドの結合を検出するのに適用するためには、装置が非常に大規模かつ複雑になる可能性が大きい。
【０００８】
流動電位やゼータ電位を生体高分子とそれに結合する化合物の検出に応用する試みは１９７０年代から行われてきた。Gladらは、IgGとProtein Aの結合が流動電位によって測定出来る事を示している（Biosensors 2, ページ89〜100, 1986年） 。西崎は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と抗ＨＳＡ抗体の結合をゼータ電位の変化によって定量している（特開平6-265551号公報） 。又、Kochらは、リゾチームを用いて、蛋白質の結合と流動電位との関係についての実験的・理論的考察を行っている（Biosensors & Bioelectronics 14, ページ413〜421, 1999年） 。
【０００９】
このように、流動電位やゼータ電位は、既知のリガンドや標識化合物を必要とせず、かつ分子量に関係なく、生体高分子とリガンドの結合検出に適用できる方法として研究 されてきた。しかし、この方法で問題になるのは、生体高分子の固定法である。Gladらは、生体高分子を、多孔性物質を詰めたチューブに固定し、西崎はラテックス粒子に固定し、Kochらは溶融シリカを詰めたキャピラリーに固定している。従って、従来の固定方法では、一度に多くの生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する事はできない。
【００１０】
一方、生体高分子から微小なフィルムやスポットをエレクトロスプレイデポジション法により形成する技術が開示されている（Anal.Chem.,71, ページ1415〜1420, 1999年及び Anal. Chem., 71, ページ3110〜3117, 1999年） 。この方法により、例えば、多数の蛋白質スポットからなる蛋白質マイクロチップを作製し、試料を流す時、流動電位（又は、ゼータ電位）を測定すれば、各スポット中の蛋白質と試料中の化合物の結合を検出する事ができる。
従って、本発明の目的は、既知のリガンドや標識化合物を必要としないで、高分子とそれに特異的に結合する化合物との結合を検出する装置及びその方法を提供する事である。また本発明の別の目的は、既知のリガンドや標識化合物を必要としないで、一度に多数の生体高分子とそれに特異的に結合する化合物との結合を検出する装置及びその方法を提供する事である。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明による生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置は、
生体高分子を固定させた反応場と、この反応場に連結され、反応場へ試料を供給する供給流路と、前記反応場と連結し、反応場の少なくとも一部を通過した試料を回収する回収流路と、を有する反応系を形成したブロックと、
前記供給流路を介して前記反応場へ試料を供給し、前記反応場の少なくとも一部を通過した試料を 前記回収流路から回収しながら、前記の固定された生体高分子の流動電位を測定する手段と、
を具えることを特徴とするものである。
【００１２】
また、本発明による 生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置は、
前記ブロックを、平坦な表面を互いに接合させた第１及び第２の基板を以って構成し、前記反応場、供給流路及び回収流路をこれらの基板の接合面に形成し、前記供給流路および回収流路を外部へ連通させる供給用開口及び回収用開口を形成したことを特徴とするものである。
【００１３】
また、本発明による 生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置は、
前記生体高分子が、エレクトロスプレイ・デポジション法により固定されることを特徴とするものである。
【００１４】
また、本発明による 生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置は、
前記の固定された生体高分子の供給流路側及び回収流路側に配置された微小な一対の電極と、
この一対の電極間に発生する流動電位を測定する手段と、
を具えることを特徴とするものである。
【００１５】
また、本発明による 生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置は、
前記電極が、ＩＳＦＥＴである、
ことを特徴とするものである。
【００１６】
また、本発明による 生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置は、
アレイ状に配列し固定させた生体高分子の複数のフィルムまたはスポットと、
前記の各フィルムまたはスポットごとに、こられのフィルムやスポットの供給流路側及び回収流路側に配置した複数の一対の電極と、
前記一対の電極の間に発生する流動電位を、前記の各フィルムまたはスポットごとに測定する手段と、
を具えることを特徴とするものである。
【００１７】
また、本発明による 生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置は、
前記の供給用開口及び回収用開口に配置された一対の圧力検出手段と、
前記の測定された流動電位及び圧力に基づき、ゼータ電位を求める演算手段と、
を具える、
ことを特徴とするものである。
【００１８】
また、本発明による 生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する方法は、
生体高分子を固定させた反応場と、この反応場に連結され、反応場へ試料を供給する供給流路と、前記反応場と連結し、反応場の少なくとも一部を通過した試料を回収する回収流路と、を有する反応系を形成したブロックを用いて、
前記反応場へ供給流路を介して試料を供給し、反応場の少なくとも一部を通過した試料を前記回収流路から回収しながら、 前記の固定された生体高分子の流動電位を測定する流動電位測定ステップ、
を含むことを特徴とするものである。
【００１９】
また、本発明による 生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する方法は、
前記の供給用開口及び回収用開口においてそれぞれ圧力を検出するステップと、
前記の測定された流動電位及び圧力に基づき、ゼータ電位を求めるゼータ電位演算ステップと、
を含むことを特徴とするものである。
【００２０】
なお、上述したように本発明は主に装置の形態として説明したが、本発明にはこれら装置に対応するそれぞれの方法が含まれるのはもちろんである。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明による 生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置、及びその方法の原理を詳細に説明する。
固相と溶相が直接接している界面において、溶液中の電解質の固体表面への吸着等により界面において正負の電荷の分離つまり界面分極がおこり、界面電気二重層が生じる。界面に電気二重層が存在するとき、各相を相対的に移動させると電場を誘起する。この現象は界面動電現象と呼ばれるが内部に多くの毛細管を持つ多孔性膜や、毛細管や、二枚の平板に若干の間隙を持たせたものと溶液の系において顕著である。固体と液体の接触面では、両相が相対的に移動するときに固体面の薄い液相は固相面に固着して固相と共に動く。この固定された液相と、運動する液相との境界面をすべり面という。すべり面と溶液内部との間の電位差をゼータ（ζ）電位または界面動電位という。多孔性膜、毛細管、二枚の平板の間隙を通して任意の圧力差（ΔＰ）を加えて電解質溶液を流すと、膜の両界面間、毛細管や二枚の平板の両端に電位差が現れ、この電位を流動電位という。
【００２２】
流動電位（ΔＥ）とゼータ電位（ζ）との間には次の関係がある。
ここでΔＰは溶液を流す時の、膜の両界面間、毛細管や二枚の平板の両端間の圧力差、εは溶液の誘電率、ηは溶液の粘度、λは溶液の伝導度である。（１）式から明らかなように、ε、η、λは溶液固有の値であり文献や別途測定により知ることができる。従ってΔＰを変えながらΔＥを測定するとζを求めることができる。ζは膜や毛細管や平板の表面の特徴を表すパラメータと考えることができる。
【００２３】
一般的にΔＥの測定は、上述したように膜の両界面間、毛細管や二枚の平板の両端で行われる。しかし膜内細孔や毛細管や二枚の平板において局所圧力差ΔＰｉとなる中間の二点間で行うと、二点間における局所電位差ΔＥｉを得る事ができ、その間における見かけ上の局所ゼータ電位ζｉを求めることができる。ここではε、η、λ等の条件を一定に保っておけば求められた流動電位をゼータ電位の代わりに表面評価の尺度として用いることができる。従って膜内細孔や毛細管や二枚の平板の表面上にｎ個の異なった性質を持つ部分（局所表面と呼ぶ）が存在する時、それぞれの局所表面の両端にｎ組の電極を配置しｎ組の流動電位を求めることができる。この時ｎ組の局所表面における電極間に生じる局所圧力差は全体の圧力差ΔＰと電極の位置の計測から得る事ができ、したがって見かけの局所ゼータ電位を最終的に計算できる。
【００２４】
生体高分子とリガンドとの結合により、この流動電位及びゼータ電位は変化するため、この変化を測定する事により、既知のリガンドや標識化合物を用いることなく生体高分子とリガンドとの相互作用を検出することができる。
【００２５】
【発明の実施の形態】
以下、添付する図面に基づき本発明をさらに詳細に説明する。
図１は、本発明による検出装置１０の基本構造を示す断面図である。この検出装置１０は、第１の基板１１と第２の基板１４の平坦な表面を接合してその接合面に流路及び反応場を形成させた反応系を有するブロックから構成される。第１の基板１１の表面上には、生体高分子のスポット１２（フィルム）を固定化し、このスポット１２の上流側と下流側に一対の電極１３を配置する。第２の基板１４には、接合することにより供給流路１５、回収流路１６及び反応場１７を形成する凹部１８を設けてある。この凹部１８の両端部には、流路と外部とを連通する供給用開口１９及び回収用開口２０が設けてあり、それぞれ流入管及び排出管に連結してある。また、試料の液漏れを防止するため、接合面にはOリングを、基板の双方或いは片方にはＯリングを収納するリング状の溝を設けてある。
【００２６】
第１の基板１１の大きさは、約７５ｘ２５ｍｍ厚さ１ｍｍのアクリル製であり、流路構造体として機能する第２の基板１４は同じく７５ｘ２５ｍｍ厚さ５ｍｍでアクリル製である。図のように、第１の基板１１の高分子フィルムの前後（上流側と下流側）には、棒状のプラチナ電極１３が２個固定されておりその直径は約０．２ｍｍであり基板面からおよそ０．５ｍｍ突出している。流路は、長円形のＯ−リングにより密閉されており、その厚さは１ｍｍ幅は５ｍｍ長さが約３５ｍｍとなっている。液体は、流入管からペリスタティックポンプなどによって注入される。生体高分子スポット１２はエレクトロスプレー法により形成されており、グルタルアルデヒドによって架橋処理されている。
【００２７】
測定に際しては、流入管に加圧しながらリガンドを含有する試料溶液を注入して測定部位となる反応場へ試料を流した状態で、一対の電極１３間に発生する局所流動電位を測定する。このようにして測定した流動電位の値の変化、或いは生体高分子なしの基板を用いて測定した基準電位との差に基づき、局所表面に存在する物質とリガンドとの間の結合を判断する。
【００２８】
図１では、例示として１個の生体高分子フィルムと一対の電極を設けた単一の測定部を持つ装置を挙げたが、この測定部をアレイ状にn 個設け（n 個のスポットと、一対の電極を各スポットの前後にn 個設け）、一度に複数の種類の生体高分子とリガンドとの結合による流動電位を測定するような装置を構成することも可能である。例えば、ｎの範囲は１≦ｎ≦１００００とするのが好適である。例えば、変形例として 、以下のような条件で装置を構成することもできる。
（１）第１の基板と第２の基板の接合面に形成する流路及び反応場の間隔を５０ｎｍ以上１ｃｍ以下とする。
（２）各基板の面積は１ｍｍ２ 以上９００ｃｍ２ 以下とする。
（３）基板の材料は金属、無機、有機材料であるが導電性を有するものとする。
（４）電極としては白金、白金黒、銀／塩化銀を使用し線状の場合は直径０．０５ｍｍ以上２ｍｍ以下、平板の場合は厚みが０．０５ｍｍ以上２ｍｍ以下、横幅が０．１ｍｍ以上１ｃｍ以下とする。
（５）使用する電解質溶液は、ＮａＣｌ等の一価の電解質からなる水溶液、ＣａＣｌ２ 等の二価の電解質からなる水溶液、その他多価の電解質からなる水溶液で、濃度は１０−５ ｍｏｌ／Ｌから５ｍｏｌ／Ｌの間で使用する。
（６）流路の両端間に加わる圧力差ΔＰ は０．０１気圧から１気圧とする。
（７）微小フィルム又はスポットの大きさは１μｍ２ 以上１ｃｍ２ 以下とする。
（８）電極間距離は１μｍ以上１ｃｍ以下とする。
（９）電極間の電位差は１μＶから１０００ｍＶのオーダーで測定できる測定手段を用いる。
（１０）個々の電位差測定部は、蛋白質やＤＮＡをエレクトロスプレイ法によりデポジットした生体高分子の微小フィルムまたはスポットの前方または後方（供給流路側と回収流路側）であって、生体高分子を固定していない部位にフィルムやスポットを挟んで前後するように配置した一対の電極からなり、試料を流しながらこれらの電極間の電位差を測定する。このようにして測定された電位差と、生体高分子が固定されていない状態での電位差や試料を流し始めたときからの電位差などとの差を用いて、生体高分子とリガンドとの結合の検出する。
【００２９】
図２は、本発明による検出装置を構成する第１の基板２１の模式図である。第１の基板２１の平坦な表面上には、生体高分子のスポット２２（フィルム）を固定化し、このスポット２２の上流側と下流側に一対の電極２３を配置する。
【００３０】
図３は、本発明による検出装置を構成する第２の基板３４の模式図である。第２の基板３４には、接合することにより供給流路３５、回収流路３６及び反応場３７を形成する凹部３８を設けてある。この凹部３８の両端部には、流路と外部とを連通する供給用開口３９及び回収用開口４０が設けてある。また、試料の液漏れを防止するため、Oリング取付け用溝４１を設けてある。
【００３１】
図４は、本発明による両面型検出装置５０の断面図である。この両面型検出装置５０は、第１の基板５１と第２の基板５４の平坦な表面を接合してその接合面に流路及び反応場を形成させた反応系を有するブロックから構成される。第１の基板５１の表面上には、生体高分子のスポット５２A（フィルム）を固定化し、このスポット５２Aの上流側と下流側に一対の電極５３Aを配置する。更に、第２の基板５４の表面上には、生体高分子のスポット５２B（フィルム）を固定化し、このスポット５２Bの上流側と下流側に一対の電極５３Bを配置する。このように、両面型では上述した片面型に加えて上側の基板にも生体高分子スポット５２Bおよび一対の電極５３Bを設けてあり、より高感度に流動電位を検出することが可能である。
【００３２】
図５は、ピン型電極を用いた基板の断面図である。この例では、基板６１の表面上に生体高分子のスポット６２を固定化し、その上流側と下流側に基板６１を貫通して反応場に露出するように一対のピン型電極６３を設けてある。
【００３３】
図６は、ランド型電極を用いた基板の断面図である。この例では、基板７１の表面上に生体高分子のスポット７２を固定化し、その上流側と下流側に一対のランド型電極７３を設けてある。このランド型電極７３には基板７１の下側から上面に貫通させて配線を結合する。
【００３４】
図７は、IS-FET（Ion Sensitive Field Effect Transistor）を用いた電極の模式図である。この例では、基板８１の表面上に生体高分子のスポット８２を固定化し、その上流側と下流側に一対のIS-FET型電極８３を設けてある。
【００３５】
図８は、IS-FET型電極を用いた基板の断面図である。図において、９１は基板、９２は酸化膜、９３Aはドレイン、９３Bはソース、９４はゲート酸化膜、９５は保護膜、９６は電極配線である。図のようにISFET型電極を用いれば、ゲート酸化膜上面の電位変化に非常に敏感に反応するために流動電位をより高感度に検出することが可能となる。
【００３６】
図９は、多数の生体高分子スポットおよび電極を配置したアレイ型検出器の模式図である。図９の上図において、１０１は流入口、１０２は分配回路、１０３は反応場即ち測定部位、１０４は電極配線取り出しコネクター、１０５は回収回路、１０６は流出口である。図９の下図は、反応場１０３の一部を拡大した図であり、図において１１１は微細流路、１１２は生体高分子のスポット、１１３は電極、１１４は配線である。図のように、各々のスポット１１２は、基本形とほぼ同等であるが、これらの電極配線は基盤裏面のパターンにより一カ所に引き出され、電気的に高速に検出が可能となっている。それぞれのスポット１１２には微細流路１１１により試料（反応液）が均一かつ連続的に供給されるようになっている。本構成によれば、多数の異なる生体高分子スポットを基板状に形成することで異なる多種類の物質の検出が同時に可能となるシステムの構築も可能となる。
【００３７】
上述したようにプリント基板の形成技術等を応用することにより、ランド型などの異なる構造にすることも可能である。また、アレイ状にする場合は裏面あるいは表面を用いて配線を基盤外部に導くことも可能であるし、また電極直下部に増幅回路を設けることも可能である。
【００３８】
次に、本発明による測定装置を用いて実際に生体高分子とリガンドとの結合を測定した。５ｍｍ×５ｍｍの基板上にαラクトアルブミンをエレクトロスプレー法によりデポジットし、これを用いてブロックを形成し装置を構成させた。この装置にＣａＣｌ２水溶液（ＨＥＰＥＳ バッファー ｐＨ７．５）を１ｍL/分で流した時に得られた電位差と水溶液濃度との関係を図１０に示す。装置は、図１で示した基本形の装置を使用している。またラクトアルブミンをデポジットしていない基板上にも同様の条件でしＣａＣｌ２水溶液を流しブランクテストを行ｔった。基板は、アクリルで、αラクトアルブミンをデポジットするエリアにはＰｔ−Ｐｄ合金をスパッタ蒸着によりコーティングしている。図のように、明らかにスポットを形成した基板とスポットなしの基板との間に差が見られこの方法で流動電位が測定でき、各種蛋白質やＤＮＡのキャラクタリゼーションができることを示している。
【００３９】
図１１は、生体高分子のスポットを固定化した基板における流動電位と、スポットなしの基板のみの状態での流動電位との差を取ったグラフである。
【００４０】
実施態様で挙げた実施例は例示に過ぎず、本発明の範囲には、幾多の変形、変更例が含まれることに留意されたい。例えば、実施例では挙げていないが、流動電位測定用の電極の他に、圧力計を上流側と下流側に設け、圧力差を求めることにより、さらにCPUなどの演算装置を用いて、測定した流動電位からゼータ電位を演算し、これに基づき生体高分子とリガンドとの結合を測定することは、当業者には容易である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明による検出装置１０の基本構造を示す断面図である。
【図２】 本発明による検出装置を構成する第１の基板２１の模式図である。
【図３】 本発明による検出装置を構成する第２の基板３４の模式図である。
【図４】 本発明による両面型検出装置５０の断面図である。
【図５】 ピン型電極を用いた基板の断面図である。
【図６】 ランド型電極を用いた基板の断面図である。
【図７】 IS-FET（Ion Sensitive Field Effect Transistor）を用いた電極の模式図である。
【図８】 IS-FET型電極を用いた基板の断面図である。
【図９】 多数の生体高分子スポットおよび電極を配置したアレイ型検出器の模式図である。
【図１０】 ＣａＣｌ２水溶液（ＨＥＰＥＳ バッファー ｐＨ７．５）を１ｍL/分で流した時に得られた電位差と水溶液濃度との関係を示すグラフである。
【図１１】 生体高分子のスポットを固定化した基板における流動電位と、スポットなしの基板のみの状態での流動電位との差を取ったグラフである。
【符号の説明】
１０ 検出装置
１１ 第１の基板
１２ スポット（フィルム）
１３ 電極
１４ 第２の基板
１５ 供給流路
１６ 回収流路
１７ 反応場
１８ 凹部
１９ 供給用開口
２０ 回収用開口
２１ 第１の基板
２２ スポット（フィルム）
２３ 電極
３４ 第２の基板
３５ 供給流路
３６ 回収流路
３７ 反応場
３８ 凹部
３９ 供給用開口
４０ 回収用開口
４１ Oリング取付け用溝
５０ 両面型検出装置
５１ 第１の基板５１
５２Ａ、５２Ｂ スポット（フィルム）
５３Ａ、５３Ｂ 電極
５４ 第２の基板
６１ 基板
６２ スポット
６３ ピン型電極
７１ 基板
７２ スポット
７３ ランド型電極
８１ 基板
８２ スポット
８３ IS-FET型電極
９１ 基板
９２ 酸化膜
９３A ドレイン
９３B ソース
９４ゲート酸化膜
９５ 保護膜
９６ 電極配線
１０１ 流入口
１０２ 分配回路
１０３ 反応場（測定部位）
１０４ 電極配線取り出しコネクター
１０５ 回収回路
１０６ 流出口
１１１ 微細流路
１１２ スポット
１１３ 電極
１１４ 配線
【発明の属する技術分野】
本発明は、 生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置、及びその方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生体内の反応の多くは、生体高分子特に蛋白質とその蛋白質と特異的に結合する化合物（リガンドという）との結合により開始される。
ヒトの遺伝子配列が決定され、個々の遺伝子の機能つまりはその遺伝子の生産する蛋白質の機能を解明することが求められている昨今、生体高分子とリガンドの結合を検出する技術は益々重要となる。また、蛋白質とリガンドの結合は極めて特異性が高いため、臨床診断分析や環境分析など多くの分野で分析技術としても活用されている。そのため従来から、蛋白質とリガンドの結合を検出するための多くの技術が開発されてきた。
【０００３】
例えば、既知のリガンドを放射性同位元素・酵素や蛍光化合物で標識するラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ／ＥＬＩＳＡ）や蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）等の標識イムノアッセイ法がよく知られている（例えば、ぶんせき,1999年, ページ839〜843）。この技術は抗体と抗原の分離方法などによっていくつかのグループに分けられるが、基本は種々の既知の抗原または抗体を放射性同位元素・酵素や蛍光化合物で標識し、目的の抗原や抗体との結合を検出することである。最近では、特に酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ／ＥＬＩＳＡ）や蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）は最もよく使われている。
【０００４】
近年表面プラズモン共鳴現象に基づく方法（ＳＰＲセンサ）が開発されている（ぶんせき、1997年, ページ362〜368 ）。この方法は、ガラス基板上に設けた金属薄膜の近傍での濃度変化があれば、それが屈折率に反映し、反射光強度を減少させる入射角が変化する、という現象に基づいている。実際には、結合を見ようとする化合物の一方をデキストランなどを介して金薄膜に固定し、他の化合物を含む試料溶液を流し、入射角の変化を検出する。
また、生体高分子を弾性体としてとらえ、微小なフィルムを用いリガンドとの結合による高次構造の変化に基づく張力の変化から結合を検出する、メカノケミカル法も開発されている（Anal.Biochem. 201, ページ68〜79, 1992年）。
【０００５】
一方、固相と溶相が直接接している界面において、溶液中の電解質の固体表面への吸着等により界面において正負の電荷の分離つまり界面分極がおこり、界面電気二重層が生じる。この界面電気二重層により生じる流動電位またはゼータ電位は、固体表面の状態を示すため、高分子膜・繊維・各種粒子など多くの分野で種々の目的に応用されている。この流動電位またはゼータ電位は、生体高分子とリガンドとの結合によっても変化することが知られている（Biosensors 2, ページ89〜100, 1986年）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
蛋白質とリガンドとの相互作用を検出するために、前述のように多くの方法が開発されている。しかし、現在機能が不明な蛋白質を解明しそれらの結果を実際の種々の目的に応用していくためには、一度に多数の蛋白質とそれらへのリガンドの結合を検出できる技術が求められている。
この場合、機能未知の蛋白質は勿論、リガンドが分かっている蛋白質でも、その既知のリガンドを酵素や蛍光化合物により標識する事を必要としない方法が望ましい。リガンドの入手が容易でなかったり、標識化合物を結合させること自体が困難であったり、その標識により活性が阻害される場合も多いからである。このような視点から上述の技術を見ると種々の問題点がある。
【０００７】
酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ／ＥＬＩＳＡ）や蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）等の標識イムノアッセイ法は、既知のリガンドや標識化合物が必要であるため、機能未知の蛋白質には適用できない。
ＳＰＲセンサは既知のリガンドや標識化合物を必要としないが、現時点では比較的大きな分子間の結合検出が中心であり、低分子量は最適の条件でも数百ダルトンが限界といわれている。これは、機能未知の蛋白質に適用する時には大きな限界となる。
メカノケミカル法は、ＳＰＲセンサと同様に既知のリガンドや標識化合物を必要とせず、かつ低分子量化合物にも適用できる（蛋白質とＣａやＭｇとの結合の検出が可能という報告がされて いる）という大きな利点を持つが、同時に多数の蛋白質とリガンドの結合を検出するのに適用するためには、装置が非常に大規模かつ複雑になる可能性が大きい。
【０００８】
流動電位やゼータ電位を生体高分子とそれに結合する化合物の検出に応用する試みは１９７０年代から行われてきた。Gladらは、IgGとProtein Aの結合が流動電位によって測定出来る事を示している（Biosensors 2, ページ89〜100, 1986年） 。西崎は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と抗ＨＳＡ抗体の結合をゼータ電位の変化によって定量している（特開平6-265551号公報） 。又、Kochらは、リゾチームを用いて、蛋白質の結合と流動電位との関係についての実験的・理論的考察を行っている（Biosensors & Bioelectronics 14, ページ413〜421, 1999年） 。
【０００９】
このように、流動電位やゼータ電位は、既知のリガンドや標識化合物を必要とせず、かつ分子量に関係なく、生体高分子とリガンドの結合検出に適用できる方法として研究 されてきた。しかし、この方法で問題になるのは、生体高分子の固定法である。Gladらは、生体高分子を、多孔性物質を詰めたチューブに固定し、西崎はラテックス粒子に固定し、Kochらは溶融シリカを詰めたキャピラリーに固定している。従って、従来の固定方法では、一度に多くの生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する事はできない。
【００１０】
一方、生体高分子から微小なフィルムやスポットをエレクトロスプレイデポジション法により形成する技術が開示されている（Anal.Chem.,71, ページ1415〜1420, 1999年及び Anal. Chem., 71, ページ3110〜3117, 1999年） 。この方法により、例えば、多数の蛋白質スポットからなる蛋白質マイクロチップを作製し、試料を流す時、流動電位（又は、ゼータ電位）を測定すれば、各スポット中の蛋白質と試料中の化合物の結合を検出する事ができる。
従って、本発明の目的は、既知のリガンドや標識化合物を必要としないで、高分子とそれに特異的に結合する化合物との結合を検出する装置及びその方法を提供する事である。また本発明の別の目的は、既知のリガンドや標識化合物を必要としないで、一度に多数の生体高分子とそれに特異的に結合する化合物との結合を検出する装置及びその方法を提供する事である。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明による生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置は、
生体高分子を固定させた反応場と、この反応場に連結され、反応場へ試料を供給する供給流路と、前記反応場と連結し、反応場の少なくとも一部を通過した試料を回収する回収流路と、を有する反応系を形成したブロックと、
前記供給流路を介して前記反応場へ試料を供給し、前記反応場の少なくとも一部を通過した試料を 前記回収流路から回収しながら、前記の固定された生体高分子の流動電位を測定する手段と、
を具えることを特徴とするものである。
【００１２】
また、本発明による 生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置は、
前記ブロックを、平坦な表面を互いに接合させた第１及び第２の基板を以って構成し、前記反応場、供給流路及び回収流路をこれらの基板の接合面に形成し、前記供給流路および回収流路を外部へ連通させる供給用開口及び回収用開口を形成したことを特徴とするものである。
【００１３】
また、本発明による 生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置は、
前記生体高分子が、エレクトロスプレイ・デポジション法により固定されることを特徴とするものである。
【００１４】
また、本発明による 生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置は、
前記の固定された生体高分子の供給流路側及び回収流路側に配置された微小な一対の電極と、
この一対の電極間に発生する流動電位を測定する手段と、
を具えることを特徴とするものである。
【００１５】
また、本発明による 生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置は、
前記電極が、ＩＳＦＥＴである、
ことを特徴とするものである。
【００１６】
また、本発明による 生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置は、
アレイ状に配列し固定させた生体高分子の複数のフィルムまたはスポットと、
前記の各フィルムまたはスポットごとに、こられのフィルムやスポットの供給流路側及び回収流路側に配置した複数の一対の電極と、
前記一対の電極の間に発生する流動電位を、前記の各フィルムまたはスポットごとに測定する手段と、
を具えることを特徴とするものである。
【００１７】
また、本発明による 生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置は、
前記の供給用開口及び回収用開口に配置された一対の圧力検出手段と、
前記の測定された流動電位及び圧力に基づき、ゼータ電位を求める演算手段と、
を具える、
ことを特徴とするものである。
【００１８】
また、本発明による 生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する方法は、
生体高分子を固定させた反応場と、この反応場に連結され、反応場へ試料を供給する供給流路と、前記反応場と連結し、反応場の少なくとも一部を通過した試料を回収する回収流路と、を有する反応系を形成したブロックを用いて、
前記反応場へ供給流路を介して試料を供給し、反応場の少なくとも一部を通過した試料を前記回収流路から回収しながら、 前記の固定された生体高分子の流動電位を測定する流動電位測定ステップ、
を含むことを特徴とするものである。
【００１９】
また、本発明による 生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する方法は、
前記の供給用開口及び回収用開口においてそれぞれ圧力を検出するステップと、
前記の測定された流動電位及び圧力に基づき、ゼータ電位を求めるゼータ電位演算ステップと、
を含むことを特徴とするものである。
【００２０】
なお、上述したように本発明は主に装置の形態として説明したが、本発明にはこれら装置に対応するそれぞれの方法が含まれるのはもちろんである。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明による 生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置、及びその方法の原理を詳細に説明する。
固相と溶相が直接接している界面において、溶液中の電解質の固体表面への吸着等により界面において正負の電荷の分離つまり界面分極がおこり、界面電気二重層が生じる。界面に電気二重層が存在するとき、各相を相対的に移動させると電場を誘起する。この現象は界面動電現象と呼ばれるが内部に多くの毛細管を持つ多孔性膜や、毛細管や、二枚の平板に若干の間隙を持たせたものと溶液の系において顕著である。固体と液体の接触面では、両相が相対的に移動するときに固体面の薄い液相は固相面に固着して固相と共に動く。この固定された液相と、運動する液相との境界面をすべり面という。すべり面と溶液内部との間の電位差をゼータ（ζ）電位または界面動電位という。多孔性膜、毛細管、二枚の平板の間隙を通して任意の圧力差（ΔＰ）を加えて電解質溶液を流すと、膜の両界面間、毛細管や二枚の平板の両端に電位差が現れ、この電位を流動電位という。
【００２２】
流動電位（ΔＥ）とゼータ電位（ζ）との間には次の関係がある。
【００２３】
一般的にΔＥの測定は、上述したように膜の両界面間、毛細管や二枚の平板の両端で行われる。しかし膜内細孔や毛細管や二枚の平板において局所圧力差ΔＰｉとなる中間の二点間で行うと、二点間における局所電位差ΔＥｉを得る事ができ、その間における見かけ上の局所ゼータ電位ζｉを求めることができる。ここではε、η、λ等の条件を一定に保っておけば求められた流動電位をゼータ電位の代わりに表面評価の尺度として用いることができる。従って膜内細孔や毛細管や二枚の平板の表面上にｎ個の異なった性質を持つ部分（局所表面と呼ぶ）が存在する時、それぞれの局所表面の両端にｎ組の電極を配置しｎ組の流動電位を求めることができる。この時ｎ組の局所表面における電極間に生じる局所圧力差は全体の圧力差ΔＰと電極の位置の計測から得る事ができ、したがって見かけの局所ゼータ電位を最終的に計算できる。
【００２４】
生体高分子とリガンドとの結合により、この流動電位及びゼータ電位は変化するため、この変化を測定する事により、既知のリガンドや標識化合物を用いることなく生体高分子とリガンドとの相互作用を検出することができる。
【００２５】
【発明の実施の形態】
以下、添付する図面に基づき本発明をさらに詳細に説明する。
図１は、本発明による検出装置１０の基本構造を示す断面図である。この検出装置１０は、第１の基板１１と第２の基板１４の平坦な表面を接合してその接合面に流路及び反応場を形成させた反応系を有するブロックから構成される。第１の基板１１の表面上には、生体高分子のスポット１２（フィルム）を固定化し、このスポット１２の上流側と下流側に一対の電極１３を配置する。第２の基板１４には、接合することにより供給流路１５、回収流路１６及び反応場１７を形成する凹部１８を設けてある。この凹部１８の両端部には、流路と外部とを連通する供給用開口１９及び回収用開口２０が設けてあり、それぞれ流入管及び排出管に連結してある。また、試料の液漏れを防止するため、接合面にはOリングを、基板の双方或いは片方にはＯリングを収納するリング状の溝を設けてある。
【００２６】
第１の基板１１の大きさは、約７５ｘ２５ｍｍ厚さ１ｍｍのアクリル製であり、流路構造体として機能する第２の基板１４は同じく７５ｘ２５ｍｍ厚さ５ｍｍでアクリル製である。図のように、第１の基板１１の高分子フィルムの前後（上流側と下流側）には、棒状のプラチナ電極１３が２個固定されておりその直径は約０．２ｍｍであり基板面からおよそ０．５ｍｍ突出している。流路は、長円形のＯ−リングにより密閉されており、その厚さは１ｍｍ幅は５ｍｍ長さが約３５ｍｍとなっている。液体は、流入管からペリスタティックポンプなどによって注入される。生体高分子スポット１２はエレクトロスプレー法により形成されており、グルタルアルデヒドによって架橋処理されている。
【００２７】
測定に際しては、流入管に加圧しながらリガンドを含有する試料溶液を注入して測定部位となる反応場へ試料を流した状態で、一対の電極１３間に発生する局所流動電位を測定する。このようにして測定した流動電位の値の変化、或いは生体高分子なしの基板を用いて測定した基準電位との差に基づき、局所表面に存在する物質とリガンドとの間の結合を判断する。
【００２８】
図１では、例示として１個の生体高分子フィルムと一対の電極を設けた単一の測定部を持つ装置を挙げたが、この測定部をアレイ状にn 個設け（n 個のスポットと、一対の電極を各スポットの前後にn 個設け）、一度に複数の種類の生体高分子とリガンドとの結合による流動電位を測定するような装置を構成することも可能である。例えば、ｎの範囲は１≦ｎ≦１００００とするのが好適である。例えば、変形例として 、以下のような条件で装置を構成することもできる。
（１）第１の基板と第２の基板の接合面に形成する流路及び反応場の間隔を５０ｎｍ以上１ｃｍ以下とする。
（２）各基板の面積は１ｍｍ２ 以上９００ｃｍ２ 以下とする。
（３）基板の材料は金属、無機、有機材料であるが導電性を有するものとする。
（４）電極としては白金、白金黒、銀／塩化銀を使用し線状の場合は直径０．０５ｍｍ以上２ｍｍ以下、平板の場合は厚みが０．０５ｍｍ以上２ｍｍ以下、横幅が０．１ｍｍ以上１ｃｍ以下とする。
（５）使用する電解質溶液は、ＮａＣｌ等の一価の電解質からなる水溶液、ＣａＣｌ２ 等の二価の電解質からなる水溶液、その他多価の電解質からなる水溶液で、濃度は１０−５ ｍｏｌ／Ｌから５ｍｏｌ／Ｌの間で使用する。
（６）流路の両端間に加わる圧力差ΔＰ は０．０１気圧から１気圧とする。
（７）微小フィルム又はスポットの大きさは１μｍ２ 以上１ｃｍ２ 以下とする。
（８）電極間距離は１μｍ以上１ｃｍ以下とする。
（９）電極間の電位差は１μＶから１０００ｍＶのオーダーで測定できる測定手段を用いる。
（１０）個々の電位差測定部は、蛋白質やＤＮＡをエレクトロスプレイ法によりデポジットした生体高分子の微小フィルムまたはスポットの前方または後方（供給流路側と回収流路側）であって、生体高分子を固定していない部位にフィルムやスポットを挟んで前後するように配置した一対の電極からなり、試料を流しながらこれらの電極間の電位差を測定する。このようにして測定された電位差と、生体高分子が固定されていない状態での電位差や試料を流し始めたときからの電位差などとの差を用いて、生体高分子とリガンドとの結合の検出する。
【００２９】
図２は、本発明による検出装置を構成する第１の基板２１の模式図である。第１の基板２１の平坦な表面上には、生体高分子のスポット２２（フィルム）を固定化し、このスポット２２の上流側と下流側に一対の電極２３を配置する。
【００３０】
図３は、本発明による検出装置を構成する第２の基板３４の模式図である。第２の基板３４には、接合することにより供給流路３５、回収流路３６及び反応場３７を形成する凹部３８を設けてある。この凹部３８の両端部には、流路と外部とを連通する供給用開口３９及び回収用開口４０が設けてある。また、試料の液漏れを防止するため、Oリング取付け用溝４１を設けてある。
【００３１】
図４は、本発明による両面型検出装置５０の断面図である。この両面型検出装置５０は、第１の基板５１と第２の基板５４の平坦な表面を接合してその接合面に流路及び反応場を形成させた反応系を有するブロックから構成される。第１の基板５１の表面上には、生体高分子のスポット５２A（フィルム）を固定化し、このスポット５２Aの上流側と下流側に一対の電極５３Aを配置する。更に、第２の基板５４の表面上には、生体高分子のスポット５２B（フィルム）を固定化し、このスポット５２Bの上流側と下流側に一対の電極５３Bを配置する。このように、両面型では上述した片面型に加えて上側の基板にも生体高分子スポット５２Bおよび一対の電極５３Bを設けてあり、より高感度に流動電位を検出することが可能である。
【００３２】
図５は、ピン型電極を用いた基板の断面図である。この例では、基板６１の表面上に生体高分子のスポット６２を固定化し、その上流側と下流側に基板６１を貫通して反応場に露出するように一対のピン型電極６３を設けてある。
【００３３】
図６は、ランド型電極を用いた基板の断面図である。この例では、基板７１の表面上に生体高分子のスポット７２を固定化し、その上流側と下流側に一対のランド型電極７３を設けてある。このランド型電極７３には基板７１の下側から上面に貫通させて配線を結合する。
【００３４】
図７は、IS-FET（Ion Sensitive Field Effect Transistor）を用いた電極の模式図である。この例では、基板８１の表面上に生体高分子のスポット８２を固定化し、その上流側と下流側に一対のIS-FET型電極８３を設けてある。
【００３５】
図８は、IS-FET型電極を用いた基板の断面図である。図において、９１は基板、９２は酸化膜、９３Aはドレイン、９３Bはソース、９４はゲート酸化膜、９５は保護膜、９６は電極配線である。図のようにISFET型電極を用いれば、ゲート酸化膜上面の電位変化に非常に敏感に反応するために流動電位をより高感度に検出することが可能となる。
【００３６】
図９は、多数の生体高分子スポットおよび電極を配置したアレイ型検出器の模式図である。図９の上図において、１０１は流入口、１０２は分配回路、１０３は反応場即ち測定部位、１０４は電極配線取り出しコネクター、１０５は回収回路、１０６は流出口である。図９の下図は、反応場１０３の一部を拡大した図であり、図において１１１は微細流路、１１２は生体高分子のスポット、１１３は電極、１１４は配線である。図のように、各々のスポット１１２は、基本形とほぼ同等であるが、これらの電極配線は基盤裏面のパターンにより一カ所に引き出され、電気的に高速に検出が可能となっている。それぞれのスポット１１２には微細流路１１１により試料（反応液）が均一かつ連続的に供給されるようになっている。本構成によれば、多数の異なる生体高分子スポットを基板状に形成することで異なる多種類の物質の検出が同時に可能となるシステムの構築も可能となる。
【００３７】
上述したようにプリント基板の形成技術等を応用することにより、ランド型などの異なる構造にすることも可能である。また、アレイ状にする場合は裏面あるいは表面を用いて配線を基盤外部に導くことも可能であるし、また電極直下部に増幅回路を設けることも可能である。
【００３８】
次に、本発明による測定装置を用いて実際に生体高分子とリガンドとの結合を測定した。５ｍｍ×５ｍｍの基板上にαラクトアルブミンをエレクトロスプレー法によりデポジットし、これを用いてブロックを形成し装置を構成させた。この装置にＣａＣｌ２水溶液（ＨＥＰＥＳ バッファー ｐＨ７．５）を１ｍL/分で流した時に得られた電位差と水溶液濃度との関係を図１０に示す。装置は、図１で示した基本形の装置を使用している。またラクトアルブミンをデポジットしていない基板上にも同様の条件でしＣａＣｌ２水溶液を流しブランクテストを行ｔった。基板は、アクリルで、αラクトアルブミンをデポジットするエリアにはＰｔ−Ｐｄ合金をスパッタ蒸着によりコーティングしている。図のように、明らかにスポットを形成した基板とスポットなしの基板との間に差が見られこの方法で流動電位が測定でき、各種蛋白質やＤＮＡのキャラクタリゼーションができることを示している。
【００３９】
図１１は、生体高分子のスポットを固定化した基板における流動電位と、スポットなしの基板のみの状態での流動電位との差を取ったグラフである。
【００４０】
実施態様で挙げた実施例は例示に過ぎず、本発明の範囲には、幾多の変形、変更例が含まれることに留意されたい。例えば、実施例では挙げていないが、流動電位測定用の電極の他に、圧力計を上流側と下流側に設け、圧力差を求めることにより、さらにCPUなどの演算装置を用いて、測定した流動電位からゼータ電位を演算し、これに基づき生体高分子とリガンドとの結合を測定することは、当業者には容易である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明による検出装置１０の基本構造を示す断面図である。
【図２】 本発明による検出装置を構成する第１の基板２１の模式図である。
【図３】 本発明による検出装置を構成する第２の基板３４の模式図である。
【図４】 本発明による両面型検出装置５０の断面図である。
【図５】 ピン型電極を用いた基板の断面図である。
【図６】 ランド型電極を用いた基板の断面図である。
【図７】 IS-FET（Ion Sensitive Field Effect Transistor）を用いた電極の模式図である。
【図８】 IS-FET型電極を用いた基板の断面図である。
【図９】 多数の生体高分子スポットおよび電極を配置したアレイ型検出器の模式図である。
【図１０】 ＣａＣｌ２水溶液（ＨＥＰＥＳ バッファー ｐＨ７．５）を１ｍL/分で流した時に得られた電位差と水溶液濃度との関係を示すグラフである。
【図１１】 生体高分子のスポットを固定化した基板における流動電位と、スポットなしの基板のみの状態での流動電位との差を取ったグラフである。
【符号の説明】
１０ 検出装置
１１ 第１の基板
１２ スポット（フィルム）
１３ 電極
１４ 第２の基板
１５ 供給流路
１６ 回収流路
１７ 反応場
１８ 凹部
１９ 供給用開口
２０ 回収用開口
２１ 第１の基板
２２ スポット（フィルム）
２３ 電極
３４ 第２の基板
３５ 供給流路
３６ 回収流路
３７ 反応場
３８ 凹部
３９ 供給用開口
４０ 回収用開口
４１ Oリング取付け用溝
５０ 両面型検出装置
５１ 第１の基板５１
５２Ａ、５２Ｂ スポット（フィルム）
５３Ａ、５３Ｂ 電極
５４ 第２の基板
６１ 基板
６２ スポット
６３ ピン型電極
７１ 基板
７２ スポット
７３ ランド型電極
８１ 基板
８２ スポット
８３ IS-FET型電極
９１ 基板
９２ 酸化膜
９３A ドレイン
９３B ソース
９４ゲート酸化膜
９５ 保護膜
９６ 電極配線
１０１ 流入口
１０２ 分配回路
１０３ 反応場（測定部位）
１０４ 電極配線取り出しコネクター
１０５ 回収回路
１０６ 流出口
１１１ 微細流路
１１２ スポット
１１３ 電極
１１４ 配線
Claims (7)
- 生体高分子を固定させた反応場と、この反応場に連結され、反応場へ試料を供給する供給流路と、前記反応場と連結し、反応場の少なくとも一部を通過した試料を回収する回収流路と、を有する反応系を形成したブロックと、
前記供給流路を介して前記反応場へ試料を供給し、前記反応場の少なくとも一部を通過した試料を 前記回収流路から回収しながら、前記の固定された生体高分子の流動電位を測定する手段と、
アレイ状に配列し固定させた生体高分子の複数のフィルムまたはスポットと、
前記の各フィルムまたはスポットごとに、これらのフィルムやスポットの供給流路側及び回収流路側に配置した複数の一対の電極と、
前記一対の電極の間に発生する流動電位を、前記の各フィルムまたはスポットごとに測定する手段と、
を具えることを特徴とする生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置。 - 請求項１に記載の 生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置において、前記ブロックを、平坦な表面を互いに接合させた第１及び第２の基板を以って構成し、前記反応場、供給流路及び回収流路をこれらの基板の接合面に形成し、前記供給流路および回収流路を外部へ連通させる供給用開口及び回収用開口を形成したことを特徴とする装置。
- 請求項２に記載の生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置において、前記の供給用開口及び回収用開口に配置された一対の圧力検出手段と、前記の測定された流動電位及び圧力に基づき、ゼータ電位を求める演算手段と、を具える、ことを特徴とする装置。
- 請求項１〜３のいずれか一項に記載の 生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置において、前記生体高分子が、エレクトロスプレイ・デポジション法により固定されることを特徴とする装置。
- 請求項４に記載の生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置において、前記電極が、ＩＳＦＥＴである、ことを特徴とする装置。
- 生体高分子を固定させた反応場と、この反応場に連結され、反応場へ試料を供給する供給流路と、前記反応場と連結し、反応場の少なくとも一部を通過した試料を回収する回収流路と、を有する反応系を形成したブロックを用いて、前記反応場へ供給流路を介して試料を供給し、反応場の少なくとも一部を通過した試料を前記回収流路から回収しながら、前記の固定された生体高分子の流動電位を測定する流動電位測定ステップと、
アレイ状に配列し固定させた生体高分子の複数のフィルムまたはスポットと、前記の各フィルムまたはスポットごとに、これらのフィルムやスポットの供給流路側及び回収流路側に配置した複数の一対の電極とを用いて、前記一対の電極の間に発生する流動電位を、前記の各フィルムまたはスポットごとに測定するステップと、
を含むことを特徴とする生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する方法。 - 請求項６に記載の生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する方法において、前記ブロックとして、平坦な表面を互いに接合させた第１及び第２の基板を以って構成され、前記反応場、供給流路及び回収流路をこれらの基板の接合面に有し、前記供給流路および回収流路を外部へ連通させる供給用開口及び回収用開口を有するものを用いて、前記の供給用開口及び回収用開口においてそれぞれ圧力を検出するステップと、前記の測定された流動電位及び圧力に基づき、ゼータ電位を求めるゼータ電位演算ステップと、を含むことを特徴とする方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001037141A JP4809983B2 (ja) | 2001-02-14 | 2001-02-14 | 生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置及びその方法 |
| EP02712364A EP1371974A4 (en) | 2001-02-14 | 2002-02-14 | DEVICE AND METHOD FOR DETECTING INTERACTIONS BETWEEN A BIOPOLYMER AND A LIGAND |
| US10/467,762 US20040115679A1 (en) | 2001-02-14 | 2002-02-14 | Apparatus for detecting interactions between biopolymer and ligand and method thereof |
| PCT/JP2002/001269 WO2002065112A1 (en) | 2001-02-14 | 2002-02-14 | Apparatus for detecting interaction between biopolymer and ligand and method thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001037141A JP4809983B2 (ja) | 2001-02-14 | 2001-02-14 | 生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置及びその方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002243741A JP2002243741A (ja) | 2002-08-28 |
| JP4809983B2 true JP4809983B2 (ja) | 2011-11-09 |
Family
ID=18900316
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001037141A Expired - Fee Related JP4809983B2 (ja) | 2001-02-14 | 2001-02-14 | 生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置及びその方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20040115679A1 (ja) |
| EP (1) | EP1371974A4 (ja) |
| JP (1) | JP4809983B2 (ja) |
| WO (1) | WO2002065112A1 (ja) |
Families Citing this family (47)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7407781B2 (en) * | 2002-05-08 | 2008-08-05 | Wyeth | Oocyte recording chamber |
| US7692219B1 (en) | 2004-06-25 | 2010-04-06 | University Of Hawaii | Ultrasensitive biosensors |
| JP2006242900A (ja) * | 2005-03-07 | 2006-09-14 | Mitsubishi Chemicals Corp | センサユニット及び反応場セルユニット並びに分析装置 |
| US20100314699A1 (en) * | 2006-12-12 | 2010-12-16 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Electrochemical sensor device, method of manufacturing the same |
| EP2639578B1 (en) | 2006-12-14 | 2016-09-14 | Life Technologies Corporation | Apparatus for measuring analytes using large scale fet arrays |
| US8349167B2 (en) | 2006-12-14 | 2013-01-08 | Life Technologies Corporation | Methods and apparatus for detecting molecular interactions using FET arrays |
| US8262900B2 (en) | 2006-12-14 | 2012-09-11 | Life Technologies Corporation | Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays |
| US11339430B2 (en) | 2007-07-10 | 2022-05-24 | Life Technologies Corporation | Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays |
| GB2461127B (en) * | 2008-06-25 | 2010-07-14 | Ion Torrent Systems Inc | Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays |
| EP2982437B1 (en) | 2008-06-25 | 2017-12-06 | Life Technologies Corporation | Methods and apparatus for measuring analytes using large scale fet arrays |
| DE202008009938U1 (de) | 2008-07-23 | 2008-10-09 | Bürkert Werke GmbH & Co.KG | Sensorsystem |
| US20100137143A1 (en) | 2008-10-22 | 2010-06-03 | Ion Torrent Systems Incorporated | Methods and apparatus for measuring analytes |
| US20100301398A1 (en) | 2009-05-29 | 2010-12-02 | Ion Torrent Systems Incorporated | Methods and apparatus for measuring analytes |
| EP2431748B1 (en) * | 2009-05-15 | 2017-08-23 | Konica Minolta, Inc. | Microchip |
| US20120261274A1 (en) | 2009-05-29 | 2012-10-18 | Life Technologies Corporation | Methods and apparatus for measuring analytes |
| US8776573B2 (en) | 2009-05-29 | 2014-07-15 | Life Technologies Corporation | Methods and apparatus for measuring analytes |
| US8673627B2 (en) | 2009-05-29 | 2014-03-18 | Life Technologies Corporation | Apparatus and methods for performing electrochemical reactions |
| CN119165030A (zh) | 2010-06-30 | 2024-12-20 | 生命科技公司 | 阵列列积分器 |
| WO2012003363A1 (en) | 2010-06-30 | 2012-01-05 | Life Technologies Corporation | Ion-sensing charge-accumulation circuits and methods |
| CN106932456B (zh) | 2010-06-30 | 2020-02-21 | 生命科技公司 | 用于测试isfet阵列的方法和装置 |
| US11307166B2 (en) | 2010-07-01 | 2022-04-19 | Life Technologies Corporation | Column ADC |
| US8653567B2 (en) | 2010-07-03 | 2014-02-18 | Life Technologies Corporation | Chemically sensitive sensor with lightly doped drains |
| US20130266979A1 (en) * | 2010-07-22 | 2013-10-10 | Stichting Voor De Technische Wetenschappen | Lab-on-a-chip device, for instance for use of the analysis of semen |
| EP2617061B1 (en) | 2010-09-15 | 2021-06-30 | Life Technologies Corporation | Methods and apparatus for measuring analytes |
| CN103299182A (zh) | 2010-09-24 | 2013-09-11 | 生命科技公司 | 匹配的晶体管对电路 |
| US9970984B2 (en) | 2011-12-01 | 2018-05-15 | Life Technologies Corporation | Method and apparatus for identifying defects in a chemical sensor array |
| US8747748B2 (en) | 2012-01-19 | 2014-06-10 | Life Technologies Corporation | Chemical sensor with conductive cup-shaped sensor surface |
| US8821798B2 (en) | 2012-01-19 | 2014-09-02 | Life Technologies Corporation | Titanium nitride as sensing layer for microwell structure |
| US8786331B2 (en) | 2012-05-29 | 2014-07-22 | Life Technologies Corporation | System for reducing noise in a chemical sensor array |
| EP3460486A1 (en) | 2012-11-12 | 2019-03-27 | The Regents of The University of California | Electrophoretic bar code assay devices and methods for making and using the same |
| US9080968B2 (en) | 2013-01-04 | 2015-07-14 | Life Technologies Corporation | Methods and systems for point of use removal of sacrificial material |
| US9841398B2 (en) | 2013-01-08 | 2017-12-12 | Life Technologies Corporation | Methods for manufacturing well structures for low-noise chemical sensors |
| US8962366B2 (en) | 2013-01-28 | 2015-02-24 | Life Technologies Corporation | Self-aligned well structures for low-noise chemical sensors |
| US8841217B1 (en) | 2013-03-13 | 2014-09-23 | Life Technologies Corporation | Chemical sensor with protruded sensor surface |
| US8963216B2 (en) | 2013-03-13 | 2015-02-24 | Life Technologies Corporation | Chemical sensor with sidewall spacer sensor surface |
| EP2972280B1 (en) | 2013-03-15 | 2021-09-29 | Life Technologies Corporation | Chemical sensor with consistent sensor surface areas |
| US9835585B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-12-05 | Life Technologies Corporation | Chemical sensor with protruded sensor surface |
| WO2014149778A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Life Technologies Corporation | Chemical sensors with consistent sensor surface areas |
| US9116117B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-08-25 | Life Technologies Corporation | Chemical sensor with sidewall sensor surface |
| US20140264471A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Life Technologies Corporation | Chemical device with thin conductive element |
| US10458942B2 (en) | 2013-06-10 | 2019-10-29 | Life Technologies Corporation | Chemical sensor array having multiple sensors per well |
| WO2015054663A2 (en) * | 2013-10-11 | 2015-04-16 | The Regents Of The University Of California | Biomolecular interaction detection devices and methods |
| JPWO2015163194A1 (ja) * | 2014-04-25 | 2017-04-13 | 国立大学法人 東京大学 | 細胞外小胞体分析チップ、細胞外小胞体分析方法、細胞外小胞体分析装置 |
| US10077472B2 (en) | 2014-12-18 | 2018-09-18 | Life Technologies Corporation | High data rate integrated circuit with power management |
| KR102593647B1 (ko) | 2014-12-18 | 2023-10-26 | 라이프 테크놀로지스 코포레이션 | 트랜스미터 구성을 갖춘 높은 데이터율 집적 회로 |
| TW202024628A (zh) | 2014-12-18 | 2020-07-01 | 美商生命技術公司 | 用於使用大規模fet陣列量測分析物之方法及設備 |
| US10890546B2 (en) | 2016-03-09 | 2021-01-12 | The Regents Of The University Of California | Transient induced molecular electronic spectroscopy method for study of molecule interactions |
Family Cites Families (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4810657A (en) * | 1987-10-19 | 1989-03-07 | Swank Roy L | Method of diagnosing multiple sclerosis and other diseases by measurement of blood plasma protein streaming potential |
| JPH07104321B2 (ja) * | 1988-03-14 | 1995-11-13 | 日本特殊陶業株式会社 | バイオセンサ |
| AU642444B2 (en) * | 1989-11-30 | 1993-10-21 | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | Reaction vessel |
| US5770029A (en) * | 1996-07-30 | 1998-06-23 | Soane Biosciences | Integrated electrophoretic microdevices |
| JPH0450758A (ja) * | 1990-06-19 | 1992-02-19 | Ebara Infilco Co Ltd | ゼータ電位測定装置 |
| US5726026A (en) * | 1992-05-01 | 1998-03-10 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Mesoscale sample preparation device and systems for determination and processing of analytes |
| JPH06265551A (ja) * | 1993-03-11 | 1994-09-22 | Hoechst Japan Ltd | ゼータ電位を用いた免疫学的測定方法及び免疫学的測定用キット |
| DE4318519C2 (de) * | 1993-06-03 | 1996-11-28 | Fraunhofer Ges Forschung | Elektrochemischer Sensor |
| US5470749A (en) * | 1993-08-27 | 1995-11-28 | Mobil Oil Corporation | Method for determining steam quality using a foaming surfactant |
| DE4345152C2 (de) * | 1993-09-10 | 1999-07-15 | Inst Polymerforschung Dresden | Zeta-Potential-Meßzelle |
| JP3166471B2 (ja) * | 1994-02-28 | 2001-05-14 | 株式会社島津製作所 | 導電率測定方法 |
| US5630924A (en) * | 1995-04-20 | 1997-05-20 | Perseptive Biosystems, Inc. | Compositions, methods and apparatus for ultrafast electroseparation analysis |
| JPH09292358A (ja) * | 1996-02-29 | 1997-11-11 | Horiba Ltd | 光走査型二次元濃度分布測定装置を用いたゼータ電位計測方法 |
| JP2924815B2 (ja) * | 1996-09-27 | 1999-07-26 | 日本電気株式会社 | ゼータ電位測定装置 |
| JPH10332621A (ja) * | 1997-06-02 | 1998-12-18 | Shimadzu Corp | ゼータ電位評価方法およびゼータ電位測定装置 |
| DE19755183C2 (de) * | 1997-12-11 | 2001-11-29 | Inst Polymerforschung Dresden | Mikro-Spaltzelle |
| JP2000019144A (ja) * | 1998-06-30 | 2000-01-21 | Shimadzu Corp | ゼータ電位測定方法および測定装置 |
| US6169394B1 (en) * | 1998-09-18 | 2001-01-02 | University Of The Utah Research Foundation | Electrical detector for micro-analysis systems |
| US20020177135A1 (en) * | 1999-07-27 | 2002-11-28 | Doung Hau H. | Devices and methods for biochip multiplexing |
| US6361958B1 (en) * | 1999-11-12 | 2002-03-26 | Motorola, Inc. | Biochannel assay for hybridization with biomaterial |
-
2001
- 2001-02-14 JP JP2001037141A patent/JP4809983B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-02-14 EP EP02712364A patent/EP1371974A4/en not_active Withdrawn
- 2002-02-14 WO PCT/JP2002/001269 patent/WO2002065112A1/ja not_active Ceased
- 2002-02-14 US US10/467,762 patent/US20040115679A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20040115679A1 (en) | 2004-06-17 |
| WO2002065112A1 (en) | 2002-08-22 |
| EP1371974A4 (en) | 2007-05-16 |
| JP2002243741A (ja) | 2002-08-28 |
| EP1371974A1 (en) | 2003-12-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4809983B2 (ja) | 生体高分子とリガンドとの相互作用を検出する装置及びその方法 | |
| US4822566A (en) | Optimized capacitive sensor for chemical analysis and measurement | |
| La Belle et al. | Label-free impedimetric detection of glycan− lectin interactions | |
| KR100348351B1 (ko) | 전기화학 멤브레인 스트립 바이오센서 | |
| US6548311B1 (en) | Device and method for detecting analytes | |
| JP5416692B2 (ja) | 電気的分析方法 | |
| US20060141469A1 (en) | Multi-layered electrochemical microfluidic sensor comprising reagent on porous layer | |
| CN102762746B (zh) | 检测生物相关分子及其相互作用性质的方法 | |
| KR101271022B1 (ko) | 다공성 필름이 부착되어 있는 멤브레인 바이오센서 및 이를 이용한 면역반응 또는 효소반응 측정방법 | |
| Niu et al. | A three-dimensional paper-based isoelectric focusing device for direct analysis of proteins in physiological samples | |
| JP2009002939A (ja) | アンペロメトリック型バイオセンサ | |
| CN111051885A (zh) | 检测系统及生产方法 | |
| JP6231655B2 (ja) | 生体分子相互作用を調整するための側方流動イムノアッセイにおけるｐＨ／温度／イオン勾配の発生およびその用途 | |
| US12072311B2 (en) | Sensor assembly and method of using same | |
| WO2004010143A2 (en) | Electrochemical lateral flow and flow-through devices | |
| KR100972391B1 (ko) | 나노센서를 이용한 질병검사장치 | |
| US7851202B2 (en) | Biosensor and method for operating the latter | |
| RU178317U1 (ru) | Полевой транзистор для определения биологически активных соединений | |
| US20250369950A1 (en) | Electrokinetic Active Particles for Multimodal Biosensing | |
| Jia et al. | Preparation of an electrochemical sensor based on the surface molecular imprinting technique and its application in the detection of proteins | |
| JP2002174614A (ja) | 免疫電極センサー | |
| JP2002333419A (ja) | 免疫電極センサー | |
| JP2002174612A (ja) | 測定方法およびその装置 | |
| JP2002174613A (ja) | 免疫電極センサー |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RD01 | Notification of change of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7426 Effective date: 20010223 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20010223 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20021112 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20021112 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20021120 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20021112 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20030121 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20031201 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20040607 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20040607 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080207 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20080207 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080207 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110222 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110422 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110524 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110708 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20110802 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20110822 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140826 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |