CN100535644C - 一种微纳升体系流体芯片的检测系统及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微纳升体系流体芯片检测系统及检测方法，其特征在于：它包括入射光生成系统、双焦面荧光收集系统、收集光处理系统、循环流动立体温控载物台以及微流体芯片；入射光生成系统至少包括有一光源和一设置在光源输出端的聚光镜；双焦面荧光收集系统包括前、后两个成像透镜组和一设置在后透镜组输出端的探测器；收集光处理系统包括一与探测器输出端连接的A/D采集卡，一与A/D采集卡输出端连接的计算机；温控载物台包括一承载微流体芯片的运动平台，围绕在运动平台周围的传热介质，设置在传热介质周围的加热器和设置在加热器外面的是保温装置；计算机通过运动控制器连接运动平台，且通过一温控反馈电路连接加热器和温度传感器。本发明结构简单、成本低廉、荧光收集效率与检测灵敏度高、操作使用方便，使得本发明更加利于推广和普及。

Description

一种微纳升体系流体芯片的检测系统及检测方法

技术领域

本发明涉及一种微流体芯片的检测方法及系统，特别是关于一种成本低廉，检测灵敏度和分辨率都比较高的微纳升体系(1nL～10μL)流体芯片的检测方法及系统。

背景技术

微流体芯片技术，又被称为“芯片实验室”(Lab-on-a-chip)，或微型全分析系统(μTAS：Micro-separation in Miniaturized Total Analysis System)，是二十世纪后期兴起的一门多学科交叉技术，它借助微机电加工、计算机、电子学、材料学、光学、机械学、自动控制、软件等系统集成工程技术与分析化学、生物学、医学等多学科应用领域进行有机的交叉结合，将生命科学、医学、化学分析等研究中样品制备、生化反应和分析检测等不连续过程集成到一块小小的芯片中，实现从试样处理到结果检测的整体微型化、自动化、集成化与便携化。微流体芯片检测仪器是生物芯片技术走向实际应用的专用仪器设备，借助显微放大成像、共焦扫描、荧光探测，以及数字图像处理等技术手段，将生物芯片中生化反应引起的基因蛋白差异表达结果以图像形式显示出来，便于人们进行医学分析或进行其它研究。

目前，国际上流行的微流体芯片检测主要有荧光显微方法、共焦扫描方法和电化学方法等。荧光显微镜是一种手工操作、使用简单的微流体芯片检测装置，可以进行单通道低分辨率的微流体芯片反应信号观察，可以通过荧光显微镜自带的制冷CCD数字化系统将所观察到的荧光信号采集并存储生成数字图像，其缺点在于其观察范围比较小，一般在几个毫米以内，检测速度相对较慢(＜100Hz)，制冷CCD数字化荧光显微镜的造价也比较昂贵。共焦扫描仪是一种国际上流行的自动化微流体芯片检测仪器，可以进行多通道、大面积(100毫米×100毫米)、中等分辨率(5微米～50微米)、检测速度相对较快(＜100kHz)的微流体芯片信号检测，并存储生成数字图像，但是共焦扫描仪的结构复杂，造价相对比较昂贵。电化学检测是一种重要的微流体芯片检测方法，根据电化学检测的原理和应用特点，将电化学检测器与微芯片制作在一起，采用安培法、电导法、电位法等将微流体芯片检测信号进行放大与数字化输出，电化学检测容易实现微流体芯片检测系统的小型化，但检测灵敏度不很高。实时荧光定量PCR(聚合酶链式反应，polymerase chain reaction)仪也是一种重要的微流体检测仪器，不过目前还局限在用Tube管进行5μL以上体系的微流体反应检测，仪器价格也比较昂贵，需要30多万元/台。

国内有多家单位围绕基于试管实时荧光定量PCR检测开展了许多工作，如“申请号200410073432.1”、“申请号200510028623.0”、“申请号01139052.2”、“专利号ZL200420102062.5”等，他们的核心研究工作有一个共同点，就是采用不同的光纤(单根，或多根，或阵列)耦合方法对试管中实时荧光定量PCR扩增反应信号进行检测，达到简化光路系统结构，降低整个仪器的造价的目的，由于涉及到光纤的耦合与信号传输，荧光信号接收端的数值孔径不可能很高，荧光信号在光纤中传输随着距离的增加其损耗明显增大，因此仪器的检测灵敏度受到较大的限制，不如常规使用透镜组合方式所获得的检测灵敏度高，这也就为开展透镜组合方式的微流体芯片检测技术创新研究工作提供了机遇和发展空间。也有人(“申请号01128122.7”)进行了将核酸扩增与基因芯片杂交集成在一起的研究，其特点是采用三维传递机械手实现扩增与杂交的自动控制，但在对芯片中荧光信号检测方面没有提出具体的创新工作内容。还有人在PCR扩增的微流控芯片应用封装结构(“专利号ZL200420072774.7”)中介绍了一种设置多个不同温度区域让样品来回经过这些区域实现PCR扩增的变温方法，在PCR扩增器(“申请号01120216.5”)中介绍了一种复杂的加热温控装置，其目的是保证热源的均匀性，并以此来实现PCR扩增腔体内部的温度分布均匀，但这些工作均存在一定的局限性，也没有涉及到与扩增信号检测技术相关的研究内容，无法实现温控与检测的系统集成，达不到芯片上基因扩增反应检测系统的使用要求。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以满足日常室内环境条件使用和野外作业使用要求，小型便携式，成本低廉，而且检测灵敏度和分辨率都比较高的微纳升体系(1nL～10μL)流体芯片的检测系统及检测方法。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种微纳升体系流体芯片检测系统，包括入射光生成系统、双焦面荧光收集系统、收集光处理系统、循环流动立体温控载物台以及微流体芯片；所述入射光生成系统至少包括有一光源和一设置在所述光源输出端的聚光镜；所述双焦面荧光收集系统包括前、后两个成像透镜组和一设置在所述后透镜组输出端的探测器；所述收集光处理系统包括一与所述探测器输出端连接的A/D采集卡，一与所述A/D采集卡输出端连接的计算机；所述温控载物台包括一承载所述微流体芯片的运动平台，围绕在所述运动平台周围的传热介质，设置在所述传热介质周围的加热器和设置在所述加热器外面的是保温装置；所述计算机通过所述运动控制器连接所述运动平台，且通过一温控反馈电路连接所述加热器和温度传感器。

所述后成像透镜组为五个透镜片，依次设置为包含两个凸面的凸透镜、包含一个凹面和一个凸面的透镜、包含一个凹面和一个凸面的透镜、包含两个凸面的凸透镜和包含两个凹面的凹透镜。

所述前透镜组可以包括七个透镜，其依次设置为具有一个凹面和一个凸面的凹透镜、包含两个凹面的凹透镜、包含两个凸面的凸透镜、包含两个凹面的凹透镜、包含两个凸面的凸透镜、包含一个凸面和一个凹面的透镜和包含两个凸面的凸透镜。

所述前透镜组也可以包括五个透镜，其依次设置为包含两个凹面的凹透镜、包含两个凸面的凸透镜、包含一个凹面和一个凸面的透镜、包含一个凹面和一个凸面的透镜和包含两个凸面的凸透镜。

所述循环流动立体温控载物台上的加热器单个方向设置或从上下两个方向设置或从周围四个方向设置或从三维空间六个方向设置。

在所述加热器顶部设置一传热介质循环流动驱动器，所述驱动器为一电机带动的伸入传热介质内的搅拌桨。

所述微流体芯片的腔体容积为1nL～10μL。

一种微纳升体系流体芯片检测方法，其包括以下内容：(1)将一由运动平台带动的微流体芯片放置在一恒温加热装置中，通过运动平台的运动，使围绕在微流体芯片周围的传热介质各处的加热温度均匀；(2)将恒温加热装置的驱动控制与反馈控制分别连接计算机，使微流体芯片腔体内部温度始终保持等温扩增或常规PCR扩增的生化反应状况；(3)利用一具有前、后组的双焦面成像透镜组中各透镜之间的匹配，提高荧光接收效率。

在所述传热介质中设置一驱动装置，带动传热介质循环流动。

将所述等温扩增的温度控制范围设置在50℃～65℃。

本发明由于采取上述设计，具有以下优点：1、本发明方法的循环流动立体温控载物台采用电机驱动微流体芯片承载平台旋转扰动传热介质与加热器相对旋转运动的循环流动方式，来减少加热器局部供热不均匀性，实现了对微流体芯片的均匀立体加热与温控。2、本发明装置提供了一种由10个或12个镜片组成的双焦面成像光学检测系统，并将12个镜片分成7片组和5片组的前后结构，或将10个镜片分成5片组和5片组的前后结构，中间为平行光传输并消除杂散光，本发明可以最大限度利用物镜的数值孔径大，工作距离长，使用材料种类少的特点，使荧光接收效率达到系统的衍射极限理论值，与普通荧光显微成像相比，本发明可以获得的荧光信号强度显著提高，加工工艺性好，生产成本低。3、本发明的温控载物台，采用矿物油等作为传热介质，利于其不易蒸发、传热快等优点，不但在温控中采用传热介质循环流动的方法，保证了微流体芯片腔体内部温度的均一性，减少了加热器不均匀性的影响，而且通过温度传感器反馈控制维持热平衡，保证了微流体芯片腔体内部温度符合生化反应使用要求。4、本发明适合微流体芯片等温扩增或常规PCR扩增生化反应的使用要求，针对不同的微流体芯片材料和不同的腔体容积(1nL～10μL)，通过实验摸索出了一整套进行实际DNA扩增生化反应的有效温度修正方法，在等温扩增实际应用中得到的有效扩增温度经验值范围为50℃～65℃，腔体容积越小要求的扩增温度越低，扩增信号指数级上升的起始时间提前，反应时间缩短。5、与国际上流行的Tube管体系实时荧光PCR仪相比较，本发明的微纳升体系流体芯片检测系统结构简单，样品与试剂用量少，数值孔径大，荧光收集效率高，等温扩增应用的可控有效扩增温度范围宽(50℃～65℃)，生产成本低，可以更好地满足微纳升体系下流体芯片等温或常规PCR扩增生化反应的使用要求。

附图说明

图1为本发明的第一种装置结构示意图

图2为本发明的第二种装置结构示意图

图3为本发明的第三种装置结构示意图

图4为本发明的第四种装置结构示意图

图5为本发明的第五种装置结构示意图

图6为本发明的第六种装置结构示意图

图7为本发明的前组7片镜头结构示意图

图8为本发明的后组5片镜头结构示意图

图9为本发明的前组5片镜头结构示意图

图10为本发明的循环流动立体温控载物台结构示意图

具体实施方式

如图1～6所示，本发明包括入射光生成系统1、双焦面荧光收集系统2、收集光处理系统3、循环流动立体温控载物台4以及微流体芯片5。

本发明的入射光生成系统1包括一光源(LED或激光器)11、一聚光镜12、一滤光片13和一可选光快门14。聚光镜12可以是单个的镜片、或由2个或2个以上镜片组合的镜头；滤光片13可以是窄带滤光片或二向色镜等，如果用窄带光源(如激光，窄带LED等)，则滤光片13可以省略；可选光快门14可以是手动切换，也可以是电控自动切换，在有些应用场合可选光快门14也可以省略。

本发明的双焦面荧光收集系统2包括由前、后组21、22组成的双焦面成像透镜组，一中孔反射镜(或二向色镜)23，一滤光片24，一针孔光阑25和一探测器26。探测器26可以是PMT、CCD、光子记数器、光电池、或光电二极管等。双焦面成像透镜组的一种实施方法是采用十二个透镜片的组合形式，其具体结构依次设置为包含一个凹面和一个凸面的凹透镜A、包含两个凹面的凹透镜B、包含两个凸面的凸透镜C、包含两个凹面的凹透镜D、包含两个凸面的凸透镜E、包含一个凸面和一个凹面的透镜F、包含两个凸面的凸透镜G、包含两个凸面的凸透镜H、包含一个凹面和一个凸面的透镜I、包含一个凹面和一个凸面的透镜J、包含两个凸面的凸透镜K、包含两个凹面的凹透镜L。双焦面成像透镜组的前、后组21、22采用前组7片(如图7所示)+后组5片(如图8所示)方式组合，在本实施例中各镜面的参数如表1和表2所示：

表112镜片双焦面成像透镜组中的前组7片镜头设计实施案例(单位：mm)

7片镜头组的焦距F＝13.0±1.0mm，有效工作距离S＝3.2±1.0mm，数值孔径NA＝0.7±0.1。

说明：其中的曲率半径误差为±1.0mm，顶点间距误差为±0.5mm，通光口径误差为±1.0mm。

表212镜片双焦面成像透镜组中的后组5片镜头设计实施案例(单位：mm)

5片镜头前组的焦距F＝32.0±1.0mm，有效工作距离S＝16.0±1.0mm，数值孔径NA＝0.4±0.1

说明：其中的曲率半径误差为±1.0mm，顶点间距误差为±0.5mm，通光口径误差为±1.0mm。

在本发明双焦面荧光收集系统2中，由前、后组21、22组成的双焦面成像透镜组的另一种实施方法是采用10个透镜片的组合形式，其具体结构依次设置为包含两个凹面的凹透镜M、包含两个凸面凸透镜N、包含一个凹面和一个凸面的透镜O、包含一个凹面和一个凸面的透镜P、包含两个凸面的凸透镜Q、包含两个凸面的凸透镜R、包含一个凹面和一个凸面的透镜S、包含一个凹面和一个凸面的透镜T、包含两个凸面的凸透镜U、包含两个凹面的凹透镜V。双焦面成像透镜组的前、后21、22采用前组5片(如图9所示)+后组5片(如图8所示)方式组合，在本实施例中各镜面的参数如表3和表4所示：

表310镜片双焦面成像透镜组中的前组5片镜头设计实施案例(单位：mm)

5片镜头前组的焦距F＝32.0±1.0mm，有效工作距离S＝16.0±1.0mm，数值孔径NA＝0.4±0.1

说明：其中的曲率半径误差为±1.0mm，顶点间距误差为±0.5mm，通光口径误差为±1.0mm。

表410镜片双焦面成像透镜组中的后组5片镜头设计实施案例(单位：mm)

5片镜头前组的焦距F＝32.0±1.0mm，有效工作距离S＝16.0±1.0mm，数值孔径NA＝0.4±0.1

说明：其中的曲率半径误差为±1.0mm，顶点间距误差为±0.5mm，通光口径误差为±1.0mm。

本发明双焦面荧光收集系统2中，双焦面成像透镜组的前、后组21、22还可以采用其它形式的两个球面或非球面透镜片，或多个球面或非球面透镜片组合的共焦或成像光学系统结构。

本发明收集光处理系统3包括一计算机31和一块A/D采集卡32，探测器26的输出端与A/D采集卡32连接。由入射光生成系统1产生的照明光，激发微流体芯片5产生的荧光，依次通过双焦面成像透镜组的前组21、中孔反射镜(或二向色镜)23、滤光片24、双焦面成像透镜组的后组22、针孔光阑25，被探测器26接收，并进行光电转换产生模拟信号，然后通过A/D采集卡32输入计算机31，最终由计算机软件处理生成等温或常规PCR扩增反应实时信号检测曲线。

循环流动立体温控载物台4包括加热器41(加热板、或加热电阻丝、加热膜)、温度传感器42、传热介质43(矿物油，或水，或空气)、保温装置44、温控反馈电路45、运动平台46和一运动控制器47等。温控载物台4由加热器41供应热量，可以是从单个方向、或从上下两个方向、或从周围四个方向、或从三维空间六个方向等进行单层(或多层)加热，不同方向和不同层的热源可以是同时加热，也可以是不同时加热，由设置在不同位置的1个、2个，或多个测温传感点的温度传感器42，对温控载物台4内部的传热介质进行温度实时监测与反馈，温度传感器42的反馈信号被温控反馈电路45接收，同时由计算机通过温控反馈电路45实现对温控载物台4的温度控制管理，以负反馈方式来确定是继续加热还是停止加热，以便满足实际应用所提出的温控使用要求。微流体芯片5位于载物台4内部的运动平台46上，运动平台46包括电机(可以是一个或多个步进电机、直线电机、直流电机)、导轨、丝杠等驱动装置，运动平台46与运动控制器47连接，并通过运动控制器47与计算机31相连，运动控制器47通过接收计算机的指令来控制微流体芯片5的旋转运动，或平移运动，平移运动又包括一维平移运动、或二维平移运动、或三维平移运动；对于被测腔体正好位于一个圆周上的微流体芯片5，只需要有旋转运动即可，因此，在本实施例中的运动平台46可以省略使用导轨与丝杠。微流体芯片5周围是传热介质43，微流体芯片5随运动平台46产生的运动可以使传热介质43被搅动，使传热介质43循环流动，从而实现减少加热器41局部不均匀性对腔体内部温度分布的影响，保证腔体范围内的温度均匀与平衡，实现对微流体芯片5的均匀立体加热与温控。保温装置44位于温控载物台4的最外层，可以防止热量扩散，保持温控载物台4内部温度稳定。加热器41和保温装置44上设置有通光窗口441，通光窗口的数量可以是一个，或多个，或阵列方式；可以是圆孔、或方孔、或其他形状。通光窗口用于检测扩增反应产生的荧光信号。

如图10所示，本发明可以在加热装器41顶部设置一个传热介质循环流动驱动器48，驱动器48包括一伸入传热介质43内的搅拌桨和带动搅拌桨的电机。驱动器48也与运动控制器47连接，并通过运动控制器47与计算机31相连，通过接收计算机31的指令作旋转运动带动传热介质循环流动。对于检测运动平台46处于周期性旋转状态的情况，可以借助运动平台46的旋转运动来实现传热介质循环流动，不使用驱动器48，或通过驱动器48做相反方向的旋转运动等。

通过上述对本发明系统结构设置的描述，可以看出本发明对微纳升体系流体芯片的检测方法包括以下内容：

1、将一由运动平台带动的微流体芯片放置在一恒温加热装置中，通过运动平台的运动，使围绕在微流体芯片周围的传热介质各处的加热温度均匀；

2、将恒温加热装置的驱动控制与反馈控制分别连接计算机，使微流体芯片腔体内部温度始终保持等温扩增或常规PCR扩增的生化反应状况；

3、利用一具有前、后组的双焦面成像透镜组中各透镜之间的匹配，获得更高的荧光接收效率。

在上述传热介质中设置一驱动装置，带动传热介质循环流动来减少加热器局部供热不均匀性，实现对微流体芯片的均匀立体加热与温控带动传热介质循环流动来减少加热器局部供热不均匀性，实现对微流体芯片的均匀立体加热与温控。

本发明可以达到以下性能指标：

1、系统适应的微流体腔体样品检测范围为1nL～10μL。

2、系统检测的灵敏度对应被测样品分子拷备数10个，或0.1个荧光分子/μm²。

3、系统温度控制范围0℃～100℃，等温扩增应用的可控有效扩增温度范围为50℃～65℃。

4、系统检测信号的实时采样频率范围≤100kHz。

5、系统适应的微流体芯片几何形状大小为直径(或边长)1mm～200mm，厚度0.1mm～100mm。

6、系统中立体温控载物台内部的温度不均匀性＜1℃，温度控制的精度1℃。

作为具体应用实施举例，如直径3mm厚度1.5mm的微腔体体系采用62℃扩增温度可以获得良好的等温扩增信号曲线，又如直径3mm厚度1.0mm的微腔体体系采用60℃扩增温度可以获得良好的等温扩增信号曲线，如直径3mm厚度0.5mm的微腔体体系采用58℃可以获得良好的等温扩增信号曲线等。

Claims (15)

1、一种微纳升体系流体芯片检测系统，其特征在于：它包括入射光生成系统、双焦面荧光收集系统、收集光处理系统、循环流动立体温控载物台以及微流体芯片；所述入射光生成系统至少包括有一光源和一设置在所述光源输出端的聚光镜；所述双焦面荧光收集系统包括前、后两个成像透镜组、一设置在所述后透镜组输出端的针孔光阑和一设置在所述针孔光阑后面的探测器；所述收集光处理系统包括一与所述探测器输出端连接的A/D采集卡，一与所述A/D采集卡输出端连接的计算机；所述循环流动立体温控载物台包括一承载所述微流体芯片的运动平台，围绕在所述运动平台周围的传热介质，设置在所述传热介质周围的加热器和设置在所述加热器外面的保温装置；所述计算机通过一运动控制器连接所述运动平台，且通过一温控反馈电路连接所述加热器和温度传感器。

2、如权利要求1所述的微纳升体系流体芯片检测系统，其特征在于：所述后成像透镜组为五个透镜片，依次设置为包含两个凸面的凸透镜、包含一个凹面和一个凸面的透镜、包含一个凹面和一个凸面的透镜、包含两个凸面的凸透镜和包含两个凹面的凹透镜。

3、如权利要求1所述的微纳升体系流体芯片检测系统，其特征在于：所述前透镜组包括七个透镜，其依次设置为具有一个凹面和一个凸面的凹透镜、包含两个凹面的凹透镜、包含两个凸面的凸透镜、包含两个凹面的凹透镜、包含两个凸面的凸透镜、包含一个凸面和一个凹面的透镜和包含两个凸面的凸透镜。

4、如权利要求2所述的微纳升体系流体芯片检测系统，其特征在于：所述前透镜组包括七个透镜，其依次设置为具有一个凹面和一个凸面的凹透镜、包含两个凹面的凹透镜、包含两个凸面的凸透镜、包含两个凹面的凹透镜、包含两个凸面的凸透镜、包含一个凸面和一个凹面的透镜和包含两个凸面的凸透镜。

5、如权利要求1所述的微纳升体系流体芯片检测系统，其特征在于：所述前透镜组包括五个透镜，其依次设置为包含两个凹面的凹透镜、包含两个凸面的凸透镜、包含一个凹面和一个凸面的透镜、包含一个凹面和一个凸面的透镜和包含两个凸面的凸透镜。

6、如权利要求2所述的微纳升体系流体芯片检测系统，其特征在于：所述前透镜组包括五个透镜，其依次设置为包含两个凹面的凹透镜、包含两个凸面的凸透镜、包含一个凹面和一个凸面的透镜、包含一个凹面和一个凸面的透镜和包含两个凸面的凸透镜。

7、如权利要求1或2或3或4或5或6所述的微流体芯片检测系统，其特征在于：所述循环流动立体温控载物台上的加热器单个方向设置或从上下两个方向设置或从周围四个方向设置或从三维空间六个方向设置。

8、如权利要求1或2或3或4或5或6所述的微流体芯片检测系统，其特征在于：在所述加热器顶部设置一传热介质循环流动驱动器，所述驱动器为一电机带动的伸入传热介质内的搅拌桨。

9、如权利要求7所述的微流体芯片检测系统，其特征在于：在所述加热器顶部设置一传热介质循环流动驱动器，所述驱动器为一电机带动的伸入传热介质内的搅拌桨。

10、如权利要求1或2或3或4或5或6或9所述的微纳升体系流体芯片检测系统，其特征在于：所述微流体芯片的腔体容积为1nL～10μL。

11、如权利要求7所述的微纳升体系流体芯片检测系统，其特征在于：所述微流体芯片的腔体容积为1nL～10μL。

12、如权利要求8所述的微纳升体系流体芯片检测系统，其特征在于：所述微流体芯片的腔体容积为1nL～10μL。

13、一种使用如权利要求1所述检测系统的微纳升体系流体芯片检测方法，其包括以下内容：

(1)将一由运动平台带动的微流体芯片放置在一恒温加热装置中，通过运动平台的运动，使围绕在微流体芯片周围的传热介质各处的加热温度均匀；

(2)将恒温加热装置的驱动控制与反馈控制分别连接计算机，使微流体芯片腔体内部温度始终保持等温扩增或常规PCR扩增的生化反应状况；

(3)利用一具有前、后组的双焦面成像透镜组中各透镜之间的匹配，提高荧光接收效率。

14、如权利要求13所述的一种微纳升体系流体芯片检测方法，其特征在于：在所述传热介质中设置一驱动装置，带动传热介质循环流动。

15、如权利要求13所述的一种微纳升体系流体芯片检测方法，其特征在于：将所述等温扩增的温度控制范围设置在50℃～65℃。

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